Recupero laparoscopico degli ovociti e crioconservazione durante la vaginoplastica per il trattamento della sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

Riepilogo

Un team dedicato può offrire alle pazienti Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser la possibilità di eseguire la stimolazione ovarica controllata e la crioconservazione degli ovociti al momento della vaginoplastica laparoscopica.

Abstract

Nei pazienti con sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKHS) che sono programmati per vaginoplastica laparoscopica e hanno un desiderio di maternità biologica, proponiamo che venga eseguito un concomitante prelievo laparoscopico degli ovociti per la crioconservazione. Il prelievo ovocitario viene effettuato all'inizio della laparoscopia. Vengono posizionati trocar destro e sinistro da 5 mm, attraverso i quali viene utilizzato un ago di aspirazione dell'ovulo da 17 G per la puntura delle ovaie destra e sinistra, rispettivamente. Per facilitare l'esposizione dei follicoli, le ovaie vengono mobilitate e trattenute con una pinza laparoscopica.

Quando si aspirano più follicoli vicini l'uno all'altro, la punta dell'ago viene trattenuta nell'ovaio per ridurre il numero di volte in cui la corteccia ovarica viene trafitta e a causa del rischio intrinseco di sanguinamento. I passaggi successivi sono invariati rispetto alla tecnica modificata laparoscopica Davydov per vaginoplastica. Prima dell'intervento chirurgico, la stimolazione ovarica controllata viene eseguita con un protocollo antagonista dell'ormone di rilascio dell'ormone gonadotropina (Gn-RH) e la procedura concomitante di prelievo degli ovociti e vaginoplastica è programmata 36 ore dopo il trigger finale della maturazione follicolare. Il liquido follicolare viene raccolto nelle stesse provette sterili da 10 ml utilizzate durante il prelievo transvaginale degli ovociti e trasferito in un blocco riscaldante (37 °C) al laboratorio di riproduzione assistita, dove gli ovociti maturi (metafase II) vengono vitrificati.

In questo caso, una serie di 23 donne con MRKH, ovociti sono stati recuperati con successo e crioconservati in tutte le pazienti; La vaginoplastica è stata successivamente condotta senza modifiche e le cure postoperatorie ospedaliere e ambulatoriali (giorno della rimozione del catetere urinario, giorno della dimissione ospedaliera, uso del dilatatore e comfort al follow-up) sono rimaste inalterate. Una complicanza postoperatoria si è verificata in un paziente (febbre che si è sviluppata il giorno 5 dopo l'intervento chirurgico e rilevamento del liquido intraperitoneale all'ecografia transaddominale) e si è risolta dopo un trattamento conservativo. Piuttosto che eseguire vaginoplastica chirurgica e ritardare il prelievo degli ovociti nei pazienti MRKH, questo approccio combina entrambe le procedure in un'unica laparoscopia, riducendo così al minimo l'invasività chirurgica e i rischi anestesiologici.

Introduzione

Con un'incidenza di circa 1 su 4-10.000 donne, MRKHS è la causa del 15% dei casi di amenorrea primaria. La MRKHS è caratterizzata dall'assenza congenita del segmento superiore della vagina e dell'utero, mentre le anomalie del tratto urinario e scheletrico sono associate in modo variabile. Più specificamente, di solito è presente una volta vaginale con una profondità di 1-2 cm e si possono trovare due corna uterine rudimentali¹.

In passato, l'interesse medico primario nel MRKHS era quello di consentire un normale rapporto sessuale, che generalmente richiede la costruzione di una neovagina con approcci non chirurgici o chirurgici². Tuttavia, i progressi nella medicina riproduttiva attualmente consentono la maternità genetica nei pazienti MRKHS, mediante maternità surrogata^3,4 o, più recentemente^, trapianto di utero⁵. Mentre il trapianto di utero è ancora una procedura sperimentale, la maternità surrogata è disponibile in molti paesi del mondo⁶ e gli esiti ostetrici e psicosociali riportati sono paragonabili a quelli della fecondazione in vitro standard e della donazione di ovociti⁷.

Sia la maternità surrogata che il trapianto di utero richiedono il prelievo degli ovociti e la fecondazione in vitro, ma non esiste un consenso su come eseguire la raccolta degli ovociti nei pazienti con MRKHS. Un approccio transvaginale può essere impraticabile a causa dell'insufficiente elasticità vaginale⁸ anche dopo vaginoplastica, posizione atipica delle ovaie⁹ o distanza eccessiva tra le ovaie e il bracciale vaginale ^4,10. In questi casi, il prelievo laparoscopico degli ovociti rappresenta l'approccio ottimale in termini di accesso chirurgico. Tuttavia, poiché la maggior parte dei pazienti MRKHS attualmente sottoposti a neovaginoplastica laparoscopica, suggeriamo di eseguire un prelievo laparoscopico degli ovociti al momento dell'intervento chirurgico per vaginoplastica¹¹, seguito dalla crioconservazione degli ovociti per uso futuro, riducendo così al minimo l'invasività e combinando il trattamento della funzione sessuale e riproduttiva dei pazienti MRKHS.

Dati demografici dei pazienti
Ventitré pazienti MRKH sono stati sottoposti finora a trattamento con questo protocollo. I risultati anamnestici, strumentali e di laboratorio dei pazienti sono riassunti nella Tabella 1. Se non specificato nella Tabella 1, non sono state riscontrate anomalie congenite associate.

Protocollo

Il comitato etico locale presso il centro di riferimento terziario per MRKHS (IRCCS Ospedale Universitario San Raffaele, Milano, Italia) è stato informato e approvato il protocollo prima della sua attuazione nel luglio 2017. Tutti i pazienti o i tutori hanno dato il consenso informato firmato per il prelievo laparoscopico degli ovociti e la crioconservazione durante la vaginoplastica e per l'uso di dati clinici / di laboratorio anonimizzati per scopi scientifici.

1. Composizione del team

1. Designare un team dedicato, composto da un chirurgo laparoscopico esperto, un chirurgo vaginale esperto, un esperto di infertilità, uno psicologo dedicato e un'infermiera impegnata.
2. Assistere il paziente come squadra durante l'intera configurazione ed esecuzione della procedura.

2. Lavoro diagnostico e consulenza

1. Eseguire l'ecografia pelvica e addominale transaddominale sulla paziente per la visualizzazione delle ovaie e la stima della conta dei follicoli antrali (AFC). Valutare i livelli ematici di ormone anti-Mülleriano (AMH) per ottimizzare la dose iniziale di gonadotropina per la stimolazione ovarica controllata. Eseguire test sierologici per malattie infettive (HIV-Ab, HCV-Ab, HBV-Ab, RPR-TPHA) secondo protocolli nazionali/locali per la crioconservazione di tessuti/gameti.
2. Consigliare il paziente sugli aspetti sessuali e riproduttivi della MRKHS, compresa la vaginoplastica non chirurgica e chirurgica, i costi e la legislazione relativi alla maternità surrogata, la prospettiva del trapianto uterino nel contesto di un programma sperimentale, i diversi approcci disponibili per il recupero degli ovociti e le prestazioni della crioconservazione degli ovociti in termini di tassi di nascita vivi.
3. Offrire alla paziente una valutazione psicologica per sostenerla attraverso la procedura e valutare la stabilità emotiva e l'impegno e il desiderio di maternità futura. Ottenere il consenso informato firmato per il concomitante recupero laparoscopico degli ovociti, la crioconservazione dei gameti e la vaginoplastica laparoscopica. Nel caso di paziente minorenne, eseguire le valutazioni cliniche in presenza dei genitori che sottoscrivono anche il relativo consenso informato.

3. Programmazione della procedura chirurgica e della stimolazione ovarica controllata

1. Programmare la procedura di recupero laparoscopico concomitante degli ovociti, crioconservazione dei gameti e vaginoplastica laparoscopica, tenendo conto della disponibilità del team clinico (vedi sopra) e del personale di laboratorio che esegue la vitrificazione degli ovociti.
2. Iniziare la stimolazione ovarica controllata (COS) il giorno -14 dal giorno dell'intervento, tenendo conto di una durata pianificata della COS di n = 12 giorni e delle 36 ore necessarie tra l'innesco dell'ovulazione e il prelievo e la vitrificazione degli ovociti.
3. Nel caso in cui la COS richieda una durata diversa da quella prevista, riprogrammare l'intervento di conseguenza.

4. Stimolazione ovarica controllata: dose iniziale, aggiustamenti della dose e monitoraggio, innesco della maturazione finale degli ovociti

1. Iniziare la COS in qualsiasi fase del ciclo ovarico, come comunemente fatto nel contesto dei protocolli di "avvio casuale" per la conservazione della fertilità.
2. Scegliere la dose iniziale di ormone follicolo-stimolante (FSH)/gonadotropina della menopausa umana (hMG) in base all'AFC e all'AMH del paziente e istruire il paziente a continuare le iniezioni sottocutanee quotidiane autosomministrate. Eseguire successivamente aggiustamenti personalizzati della dose in base alla risposta ovarica.
3. Monitorare la risposta ovarica mediante ecografia transaddominale seriale e misurazioni concomitanti di E₂ e P (giorno 1, giorno 6, giorno 8, giorno 10 e giorno 12).
4. Innescare la maturazione finale degli ovociti mediante somministrazione sottocutanea di 0,2 mL di un analogo del Gn-RH (Triptorelina).

5. Procedura clinica (laparoscopia): prelievo ovocitario

1. Posizionare il paziente in posizione di litomia dorsale modificata, che consente un eccellente accesso simultaneo all'addome e al perineo. Indurre l'anestesia generale e somministrare 2 g di Cefazolin per via endovenosa come da profilassi antibiotica intraoperatoria di routine. Posizionare un catetere Foley intravescicale.
2. Stabilire lo pneumoperitoneo con un ago Veress peri-ombelicale, posizionare un trocar ombelicale da 10 mm per l'inserimento del laparoscopio e due trocar da 5 mm nei quadranti superiori destro e sinistro. Sotto visione laparoscopica, utilizzare un ago a lume singolo da 17 G collegato a una pompa di aspirazione, come comunemente impiegato per il recupero transvaginale, attraverso i trocar destro e sinistro per la puntura dell'ovaio destro e sinistro, rispettivamente.
3. Sollevare e tenere le ovaie con una pinza laparoscopica per facilitare l'esposizione dei follicoli. Quando si aspirano più follicoli vicini l'uno all'altro, mantenere la punta dell'ago nell'ovaio per ridurre il numero di volte in cui la corteccia ovarica viene trafitta e il rischio intrinseco di sanguinamento.

6. Procedura clinica (laparoscopia): vaginoplastica

NOTA: Le fasi della vaginoplastica rimangono invariate rispetto alla tecnica laparoscopica modificata di Davydov¹².

1. Sezionare il peritoneo sollevando e incidendo il filamento peritoneale trasversalmente tra le due corna uterine rudimentali, quindi estendendo l'incisione anteriormente, lateralmente e posteriormente.
2. Iniziare una sutura a corda di borsa in polidiossanone sintetico assorbibile (PDS) 2-0 monofilamento in ciascun emipelvi, dal peritoneo mobilizzato sopra la vescica, con trasfissione consecutiva del legamento rotondo, dell'istmo tubarico, del legamento uteroovarico e della foglia peritoneale laterale. Quindi, includere nelle due suture l'aspetto laterale del mesoretto e l'aspetto anteriore della sierosa rettale, immediatamente sotto la giunzione rettosigmoideo.
3. Esporre la fossetta vaginale sull'approccio perineale ed eseguire un'incisione a forma di H e creare uno spazio neovaginale mediante una dissezione netta e smussata dello spazio vescicorettale. Quindi, tirare giù i margini peritoneali sezionati fino al bordo del vestibolo vaginale. Suture interrotte di posizione in PDS 3-0 per l'anastomosi peritoneale-vestibolare. Infine, posizionare una garza rivestita di paraffina nella neovagina rivestita di peritoneo.

7. Laboratorio FIV: il giorno prima del prelievo degli ovociti

1. Preparare da 2 a 5 provette a fondo tondo con 9 ml di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con albumina sierica umana al 5% [HSA]) in base al numero di follicoli attesi e incubarli per una notte a 37 °C.
2. Preparare uno o due piatti a 4 pozzetti con 0,5 ml/pozzetto di terreno di fecondazione (integrato con HSA al 5%), coperto con 0,5 ml di olio minerale per coltura embrionale e incubarlo per una notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O₂).
3. Preparare un piatto contenente 9 (30 μL) gocce di terreno di coltura singola continua (CSCM) (integrato con un integratore sostitutivo del siero al 10% [SSS]) coperto con 6 ml di olio minerale. Incubarlo per una notte a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O₂).

8. Laboratorio FIVET: procedura di prelievo degli ovociti

1. Preparare una soluzione di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con HSA al 5%) con eparina ad una concentrazione finale di 10 UI/mL in cui verranno raccolti aspirati follicolari.
2. Analogamente al prelievo transvaginale di routine degli ovociti 13, raccogliere gli aspirati follicolari in tubi a fondo tondo da 10 ml, tenuti caldi (37 °C) in un'incubatrice portatile e immediatamente trasportati al laboratorio di embriologia, con un tempo di trasporto di circa¹⁰ minuti.
3. Esaminare il liquido follicolare in una capsula di Petri sterile preriscaldata da 90 mm per identificare i complessi cumulo-ovocita (COC). Una volta rilevato un COC, sciacquarlo in un piatto a pozzetto centrale riempito con 1 ml di Quinn's Advantage Medium preriscaldato con HEPES (integrato con HSA al 5%).
4. Man mano che tutti i COC vengono raccolti, posizionarli nel piatto a 4 pozzetti contenente il Mezzo di Fecondazione ed etichettare il coperchio e il fondo con i dati relativi all'identità del paziente.
5. Incubarli a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O₂).
6. Assicurarsi che un secondo membro del personale del laboratorio esegua un doppio controllo della procedura.

9. Denudazione degli ovociti

1. Eseguire la rimozione delle cellule cumuliformi / corona entro 38 ore dal trigger dell'ovulazione.
2. Preparare una soluzione di Quinn's Advantage Medium con HEPES (integrato con HSA al 5%) con ialuronidasi ad una concentrazione finale di 10 UI/ml.
3. Preparare un piatto a pozzetto centrale con 1 ml di Quinn's Advantage Medium preriscaldato con HEPES (integrato con HSA al 5%) contenente ialuronidasi e un altro con 1 ml di terreno preriscaldato tamponato HEPES (integrato con HSA al 5%).
4. Etichettare le piastre di denudazione degli ovociti con i dati di identificazione della paziente.
5. Posizionare i COC nel pozzetto centrale contenente l'enzima per disperdere le cellule del cumulo con una pipetta Pasteur di vetro, pipettando delicatamente la soluzione contenente COC su e giù per un massimo di 30 s.
6. Spostare gli ovociti nel secondo piatto centrale contenente solo terreno tamponato HEPES, assicurandosi di spostare una quantità minima dell'enzima.
7. Rimuovere le restanti celle corona utilizzando pipette denudate con diametri interni decrescenti (170-140 μm).
8. Valutare lo stadio di maturazione degli ovociti, separando gli ovociti in metafase II (MII), caratterizzati dall'estrusione del primo corpo polare, dagli ovociti in metafase I (MI) e dalle vescicole germinali (GV).
9. Trasferire gli ovociti MII in una coltura IVF 60 mm capsula di Petri contenente nove (30 μL) gocce di terreno di coltura singola continua (CSCM) (integrato con supplemento sostitutivo sierico al 10% [SSS]) coperto con 6 ml di olio minerale.
10. Incubarli a 37 °C in atmosfera controllata (6% CO 2, 5% O₂).

10. Vitrificazione degli ovociti

1. Eseguire la vitrificazione degli ovociti MII subito dopo la denudazione degli ovociti, seguendo il protocollo fornito dal produttore del kit di vitrificazione.
2. Portare a temperatura ambiente (25-27 °C): la soluzione di equilibrazione (ES), la soluzione di vetrificazione (VS) e la soluzione di lavaggio (WS), circa 30 minuti prima della procedura.
   NOTA: Come riportato dai produttori, ES contiene il 7,5% di DMSO, il 7,5% di glicole etilenico, il 20% di supplemento di destrano siero (DSS), la gentamicina nel mezzo tamponato HEPES M-199; VS contiene il 15% di DMSO, il 15% di glicole etilenico, 0,5 M di saccarosio, il 20% di DSS, la gentamicina in un terreno tamponato con HEPES M-199 e WS contiene il 20% di DSS, gentamicina in un terreno tamponato con HEPES M-199.
3. Per un criodispositivo, utilizzare Cryotop costituito da una sottile striscia di pellicola trasparente attaccata a un manico di plastica.
4. Etichettare i criodispositivi con il nome della paziente, la data di nascita, l'ID, la data di crioconservazione e il numero di ovociti caricati su ogni singolo dispositivo.
5. Etichettare il piatto di vitrificazione con il nome e l'ID del paziente.
6. Assicurarsi che un operatore testimone controlli i dati corretti del paziente sui criodispositivi e sulla parabola.
7. Riempire una scatola di raffreddamento fino alla parte superiore con azoto liquido fresco e coprire fino all'uso per ridurre al minimo la dispersione e l'evaporazione.
8. Utilizzare una pipetta stripper con un diametro interno di 170 μm per evitare di danneggiare gli ovociti durante la manipolazione.
9. Agitare delicatamente ogni flaconcino di ES, VS e WS per mescolare il contenuto prima dell'uso.
10. Preparare il coperchio di una capsula di Petri da 60 mm con una goccia di 50 μL di WS1 (Figura 1A).
11. Posizionare le gocce appena prima dell'uso per limitare l'evaporazione del mezzo.
12. Prelevare il piatto ovocitario dall'incubatrice e trasferire gli ovociti MII (fino a 3 alla volta) con un volume minimo di terreno dal piatto di coltura nei 50 μL di WS.
13. Erogare 50 μL di gocce di WS2, ES1 ed ES2 in prossimità e trasferire gli ovociti dalla goccia WS1 alla goccia WS2 (Figura 1B).
14. Unire la goccia di ES1 a WS2 e attendere 2 minuti per la miscelazione spontanea di entrambe le soluzioni.
15. Quindi, unire la goccia di ES2 alle gocce precedentemente unite e lasciare per altri 2 minuti.
16. Infine, unire una nuova goccia da 100 μL di ES3 alle gocce precedentemente unite e lasciare agire per 1 minuto aggiuntivo.
17. Posizionare gli ovociti in una goccia di 100 μL di ES4 per 10 minuti (Figura 1C).
18. Erogare due gocce da 50 μL di VS e una da 100 μL di VS (Figura 1D).
19. Spostare gli ovociti in sequenza nelle tre gocce di VS per 60 s in modo che gli ovociti rimangano in ogni goccia per ~ 20 s.
20. Quando rimangono circa 10 s prima della fine dei 60 s di incubazione, posizionare il criodispositivo al microscopio.
21. Portare gli ovociti sulla punta della pipetta e posizionarli sul criodispositivo con la quantità minima di VS.
22. Aspirare l'eccesso di VS, lasciando gli ovociti coperti da un sottile strato di VS.
23. Immergere il criodispositivo direttamente nell'azoto liquido e spostarlo rapidamente. Conservare il dispositivo in azoto liquido e coprirlo con il coperchio protettivo.
24. Conservare il criodispositivo in un sistema di stoccaggio (ad esempio, visiotube) e posizionarlo nel serbatoio criogenico. Registrare i dati di crioconservazione sul database e sul foglio di laboratorio.

11. Assistenza postoperatoria ospedaliera

1. Rimuovere il catetere urinario e la garza vaginale rivestita di paraffina 48 ore dopo l'intervento chirurgico.
2. Esplorare digitalmente la neovagina delle pazienti dopo la rimozione e istruire la paziente su come eseguire l'esplorazione digitale. Quindi, rivestire uno stampo vaginale (9 cm di lunghezza e 2 cm di diametro) con gel di estrogeni (per favorire l'epitelizzazione) e istruire la paziente su come inserire e mantenere lo stampo.
3. A partire dal giorno 3 dopo l'intervento e ogni giorno successivo, istruire il paziente su come posizionare lo stampo e mantenerlo in posizione per almeno 2 ore al giorno.
4. Se non si verificano complicazioni, dimettere il paziente il giorno 5-6 dopo l'intervento.

12. Assistenza postoperatoria ambulatoriale

1. Istruire la paziente su come eseguire la dilatazione neovaginale per 2 mesi con lo stesso stampo (9 cm di lunghezza e 2 cm di diametro) utilizzato durante la degenza ospedaliera, e poi uno più grande (11 cm di lunghezza e 2,5 cm di diametro).
2. Dopo la visita di 3 mesi, consentire alla paziente di iniziare l'attività sessuale e informarla di continuare a utilizzare gli stampi nei giorni in cui non ci sono rapporti sessuali.

13. Seguito dato

1. Pianifica visite di follow-up a 1, 3, 6 e 12 mesi dopo la procedura.
2. Ad ogni visita di follow-up, valutare la conformità con gli esercizi di dilatazione e chiedere al paziente se ha sperimentato limitazioni alle sue attività della vita quotidiana, dolore, sintomi urinari o disfunzione sessuale (a partire dalla visita dopo il terzo mese dopo l'intervento). Eseguire un esame ginecologico ad ogni visita di follow-up per misurare la larghezza vaginale, la lunghezza, la sospensione e la mobilità degli annessi.

Risultati

La Tabella 2 include i dati di stimolazione ovarica delle pazienti, mentre i principali esiti chirurgici e funzionali sono descritti nella Tabella 3. Le procedure laparoscopiche concomitanti di prelievo degli ovociti e vaginoplastica sono state combinate con successo in tutte le pazienti. Sono stati recuperati in media 11,4 ± 5,4 (media ± DS) ovociti e 9,6 ± 4,3 ovociti MII sono stati crioconservati (Tabella 3). Nella nostra esperienza con la crioconservazione degli o...

Discussione

Questo protocollo riduce l'invasività nel trattamento della MRKHS combinando le procedure di vaginoplastica e recupero degli ovociti. A tal fine, è fondamentale che venga designato un team dedicato per garantire che i tempi della COS, la procedura chirurgica e la vitrificazione degli ovociti siano programmati in modo efficiente.

I pazienti MRKHS per i quali questo metodo laparoscopico combinato dovrebbe essere più vantaggioso sono quelli in cui un recupero transvaginale sarebbe considerato ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oocyte retrieval procedure
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Portable incubator	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
14 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352057
4-well dish	Nunc	144444
60 mm Petri dish	Nunc	FA9150270
90 mm Petri dish	Nunc	FA9150360
Human Serum Albumin 100 mg/ml in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage Fertilization medium SAGE	Origio	1020
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Sterile glass pasteur pipettes
Oocyte denudation
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
4-well dish	Nunc	144444
CSCM (Continuos single culture) medium	Fujifilm irvine Scientific	90165
Human Albumin 100 mg/mL in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101
IVF culture 60 mm petri dish	Nunc	FA9150270
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Serum Substitute Supplement	Fujifilm irvine Scientific	99193
Sterile glass pasteur pipettes
Stripping pipette tips (140 μm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-5
Stripping pipette tips (170 μm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5
Oocyte vitrification
35 mm Petri dish	NUNC	150255
60 mm Petri dish	NUNC	150270
90 mm Petri dish	NUNC	150360
Container for Cooling rack	Kitazato
Cryodevice/cryotop	Kitazato	81111
Electronic timer
Flexipet	COOK	K- 1000
Gilson Pipetman	Gilson	F123601
Lab Printer LabXpert	Brady	XSL-86-461
Tips 20-200 µL	Thermo Scientific	2160G
Tips 2-20 µL	Thermo Scientific	2139-HR
Visotubes	Cryo Bio System	20
Vitrification Freeze Kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-SO
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-SO