Recuperação e Criopreservação de Ovócitos Laparoscópicos durante a Vaginoplastia para Tratamento da Síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser

Resumo

Uma equipe dedicada pode oferecer às pacientes de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser a opção de realizar estimulação ovariana controlada e criopreservação de ovócitos no momento da vaginoplastia laparoscópica.

Resumo

Em pacientes com Síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKHS) que estão programadas para vaginoplastia laparoscópica e têm desejo de maternidade biológica, propomos que seja realizada uma recuperação laparoscópica concomitante de ovócitos para criopreservação. A recuperação de ovócitos é realizada no início da laparoscopia. Posicionam-se os trocartes de 5 mm direito e esquerdo, através dos quais uma agulha de aspiração de óvulo 17 G é usada para punção dos ovários direito e esquerdo, respectivamente. Para facilitar a exposição dos folículos, os ovários são mobilizados e mantidos com pinça laparoscópica.

Ao aspirar múltiplos folículos próximos uns dos outros, a ponta da agulha é retida no ovário para reduzir o número de vezes que o córtex ovariano é transfixado e devido ao risco inerente de sangramento. As etapas subsequentes permanecem inalteradas em comparação com a técnica laparoscópica modificada de Davydov para vaginoplastia. Antes da cirurgia, a estimulação ovariana controlada é realizada com um protocolo antagonista do hormônio liberador de hormônio gonadotrofina (Gn-RH), e o procedimento concomitante de recuperação de ovócitos e vaginoplastia é agendado 36 h após o gatilho final da maturação folicular. O líquido folicular é coletado nos mesmos tubos estéreis de 10 mL usados durante a recuperação de ovócitos transvaginais e transferido em um bloco de aquecimento (37 °C) para o laboratório de reprodução assistida, onde os oócitos maduros (metáfase II) são vitrificados.

Neste caso, uma série de 23 mulheres com MRKH, oócitos foram recuperados com sucesso e criopreservados em todos os pacientes; a vaginoplastia foi realizada posteriormente, sem modificações, e os cuidados pós-operatórios hospitalares e ambulatoriais (dia da retirada do cateter urinário, dia da alta hospitalar, uso do dilatador e conforto no seguimento) permaneceram inalterados. Uma complicação pós-operatória ocorreu em um paciente (febre se desenvolvendo no 5º dia após a cirurgia e detecção de líquido intraperitoneal na ultrassonografia transabdominal) e resolvida após tratamento conservador. Em vez de realizar vaginoplastia cirúrgica e retardar a recuperação de ovócitos em pacientes com MRKH, essa abordagem combina ambos os procedimentos em uma única laparoscopia, minimizando assim a invasividade cirúrgica e os riscos anestesiológicos.

Introdução

Com uma incidência de aproximadamente 1 em 4-10.000 mulheres, o MRKHS é a causa de 15% dos casos de amenorreia primária. A MRKHS é caracterizada pela ausência congênita do segmento superior da vagina e do útero, enquanto as anomalias do trato urinário e do esqueleto estão associadas variavelmente. Mais especificamente, uma abóbada vaginal com uma profundidade de 1-2 cm geralmente está presente, e dois chifres uterinos rudimentares podem ser encontrados¹.

No passado, o principal interesse médico na MRKHS era permitir relações sexuais normais, o que geralmente requer a construção de uma neovagina por abordagens não cirúrgicas ou cirúrgicas². No entanto, os avanços na medicina reprodutiva atualmente permitem a maternidade genética em pacientes com MRKHS, seja por meio de barriga de aluguel^3,4 ou, mais recentemente^, transplante de útero⁵. Embora o transplante de útero ainda seja um procedimento experimental, a gestação de substituição está disponível em muitos países do mundo⁶, e os resultados obstétricos e psicossociais relatados são comparáveis aos da fertilização in vitro padrão e da doação de ovócitos⁷.

Tanto a barriga de aluguel quanto o transplante de útero requerem recuperação de ovócitos e fertilização in vitro, mas não existe consenso sobre como realizar a coleta de óvulos em pacientes com MRKHS. A abordagem transvaginal pode ser inviável devido à^{elasticidade vaginal} insuficiente8 mesmo após a vaginoplastia, localização atípica dos ovários⁹ ou distância excessiva entre os ovários e o manguito vaginal ^4,10. Nesses casos, a recuperação laparoscópica de ovócitos representa a abordagem ideal em termos de acesso cirúrgico. No entanto, como a maioria dos pacientes com MRKHS atualmente é submetida à neovaginoplastia laparoscópica, sugerimos a realização de uma recuperação laparoscópica de ovócitos no momento da cirurgia para vaginoplastia¹¹, seguida de criopreservação de ovócitos para uso futuro, minimizando assim a invasividade ao combinar o tratamento da função sexual e reprodutiva de pacientes com MRKHS.

Dados demográficos dos pacientes
Vinte e três pacientes com MRKH foram submetidos a tratamento com este protocolo até o momento. Os achados anamnésticos, instrumentais e laboratoriais dos pacientes estão resumidos na Tabela 1. A menos que especificado na Tabela 1, não foram encontradas anomalias congênitas associadas.

Protocolo

O comitê de ética local do centro terciário de referência para MRKHS (IRCCS San Raffaele University Hospital, Milão, Itália) foi notificado e aprovou o protocolo antes de sua implementação em julho de 2017. Todos os pacientes ou responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para recuperação e criopreservação de ovócitos laparoscópicos durante a vaginoplastia e para o uso de dados clínicos/laboratoriais anônimos para fins científicos.

1. Composição da equipe

1. Designe uma equipe dedicada, composta por um cirurgião laparoscópico experiente, um cirurgião vaginal experiente, um especialista em infertilidade, um psicólogo dedicado e uma enfermeira comprometida.
2. Auxiliar o paciente como uma equipe durante toda a configuração e execução do procedimento.

2. Investigação diagnóstica e aconselhamento

1. Realizar ultrassonografia transabdominal pélvica e abdominal na paciente para visualização dos ovários e estimativa da Contagem de Folículos Antrais (AFC). Avaliar os níveis sanguíneos de hormônio anti-Mülleriano (AMH) para otimizar a dose inicial de gonadotrofina para estimulação ovariana controlada. Realizar testes sorológicos para doenças infecciosas (HIV-Ab, HCV-Ab, HBV-Ab, RPR-TPHA) de acordo com protocolos nacionais/locais de criopreservação de tecidos/gametas.
2. Aconselhar a paciente sobre os aspectos sexuais e reprodutivos da MRKHS, incluindo a vaginoplastia não cirúrgica e cirúrgica, os custos e a legislação relacionados à barriga de aluguel, a perspectiva do transplante uterino no contexto de um programa experimental, as diferentes abordagens disponíveis para a recuperação de ovócitos e a realização da criopreservação de ovócitos em termos de taxas de nascidos vivos.
3. Oferecer à paciente avaliação psicológica para apoiá-la durante o procedimento e avaliar a estabilidade emocional, o comprometimento e o desejo de uma futura maternidade. Obtenha o consentimento assinado e informado para recuperação concomitante de ovócitos laparoscópicos, criopreserva de gametas e vaginoplastia laparoscópica. No caso de um paciente menor de idade, realize as avaliações clínicas na presença dos pais que também assinam o termo de consentimento livre e esclarecido.

3. Agendamento do procedimento cirúrgico e da estimulação ovariana controlada

1. Agende o procedimento de recuperação concomitante de ovócitos laparoscópicos, criopreserva de gametas e vaginoplastia laparoscópica, levando em consideração a disponibilidade da equipe clínica (ver acima), bem como a da equipe de laboratório que realiza a vitrificação de ovócitos.
2. Iniciar a estimulação ovariana controlada (COS) no dia -14 a partir do dia da cirurgia, levando em consideração uma duração planejada de COS de n = 12 dias e as 36 h necessárias entre o desencadeamento da ovulação e a recuperação e vitrificação dos ovócitos.
3. Caso o COS exija uma duração diferente da esperada, remarque a cirurgia de acordo.

4. Estimulação ovariana controlada: dose inicial, ajustes de dose e monitorização, desencadeamento da maturação final dos ovócitos

1. Inicie o COS em qualquer fase do ciclo ovariano, como comumente feito no contexto de protocolos de "início aleatório" para preservação da fertilidade.
2. Escolha a dose inicial de hormônio folículo-estimulante (FSH)/gonadotrofina da menopausa humana (hMG) com base na AFC e AMH do paciente e instrua o paciente a continuar as injeções subcutâneas diárias autoadministradas. Realizar ajustes de dose individualizados subsequentemente com base na resposta ovariana.
3. Monitore a resposta ovariana por ultrassonografia transabdominal seriada e medidas concomitantes de E₂ e P (dia 1, dia 6, dia 8, dia 10 e dia 12).
4. Desencadear maturação final de ovócitos pela administração subcutânea de 0,2 mL de um análogo de Gn-RH (Triptorelina).

5. Procedimento clínico (laparoscopia): recuperação de ovócitos

1. Posicione o paciente em posição de litotomia dorsal modificada, o que permite excelente acesso simultâneo ao abdome e ao períneo. Induzir anestesia geral e administrar 2 g de Cefazolin por via intravenosa de acordo com a profilaxia antibiótica intraoperatória de rotina. Posicione um cateter de Foley intravesical.
2. Estabelecer pneumoperitônio com uma agulha Veress periumbilical, posicionar um trocarte umbilical de 10 mm para inserção do laparoscópio e dois trocartes de 5 mm nos quadrantes superiores direito e esquerdo. Sob visão laparoscópica, use uma agulha de lúmen único de 17 G conectada a uma bomba de aspiração, como comumente empregado para recuperação transvaginal, através dos trocartes direito e esquerdo para punção do ovário direito e esquerdo, respectivamente.
3. Levante e segure os ovários com pinça laparoscópica para facilitar a exposição dos folículos. Ao aspirar múltiplos folículos que estão próximos um do outro, retenha a ponta da agulha no ovário para reduzir o número de vezes que o córtex ovariano é transfixado e o risco inerente de sangramento.

6. Procedimento clínico (laparoscopia): vaginoplastia

NOTA: As etapas da vaginoplastia permanecem inalteradas em comparação com a técnica laparoscópica modificada de Davydov¹².

1. Dissecar o peritônio levantando e incidindo a fita peritoneal transversalmente entre os dois cornos uterinos rudimentares e, em seguida, estendendo a incisão anteriormente, lateralmente e posteriormente.
2. Iniciar uma sutura em arco de bolsa em monofilamento de polidioxanona sintética absorvível (PDS) 2-0 em cada hemipelve, a partir do peritônio mobilizado acima da bexiga, com transfixação consecutiva do ligamento redondo, do istmo tubário, do ligamento uteroovariano e da folha peritoneal lateral. Em seguida, inclua nas duas suturas a face lateral do mesoreto e a face anterior da serosa retal, imediatamente abaixo da junção retossigmoide.
3. Exponha a covinha vaginal na abordagem perineal e realize uma incisão em forma de H e crie um espaço neovaginal por dissecção afiada e contundente do espaço vesiorretal. Em seguida, puxe as margens peritoneais dissecadas até a borda do vestíbulo vaginal. A posição interrompeu as suturas em PDS 3-0 para a anastomose peritoneal-vestibular. Por fim, coloque uma gaze revestida de parafina na neovagina revestida de peritônio.

7. Laboratório de FIV: um dia antes da recuperação do ovócito

1. Preparar 2 a 5 tubos de fundo redondo com 9 ml de Quinn's Advantage Medium com HEPES (suplementado com 5% de albumina sérica humana [HSA]) de acordo com o número de folículos esperados e incubá-los durante a noite a 37 °C.
2. Preparar uma ou duas placas de 4 poços com 0,5 mL/poço de Meio de Fertilização (suplementado com 5% de HSA), coberto com 0,5 mL de óleo mineral para cultura embrionária e incubá-lo durante a noite a 37 °C em atmosfera controlada (6% CO 2, 5% O₂).
3. Preparar um prato contendo 9 (30 μL) gotas de meio de Cultura Única Contínua (CSCM) (suplementado com suplemento substituto sérico a 10% [SSS]) coberto com 6 mL de óleo mineral. Incubá-lo durante a noite a 37 °C em atmosfera controlada (6% CO 2, 5% O₂).

8. Laboratório de FIV: procedimento de recuperação de ovócitos

1. Preparar uma solução de Quinn's Advantage Medium com HEPES (suplementado com HSA a 5%) com heparina a uma concentração final de 10 UI/ml na qual serão recolhidos aspirados foliculares.
2. Semelhante à rotina de recuperação de ovócitos transvaginais 13, coletar os aspirados foliculares em tubos de fundo redondo de 10 mL, mantidos aquecidos (37 °C) em incubadora portátil e imediatamente transportados para o laboratório de embriologia, com tempo de transporte de aproximadamente¹⁰ min.
3. Examine o fluido folicular em uma placa de Petri estéril pré-aquecida de 90 mm para identificar complexos cumulus-ovócitos (COC). Uma vez detectado um COC, enxágue-o em um prato de poço central preenchido com 1 mL de Quinn's Advantage Medium pré-aquecido com HEPES (suplementado com 5% de HSA).
4. Como todos os COCs são coletados, coloque-os no prato de 4 poços contendo o Meio de Fertilização e rotule a tampa e o fundo com dados relacionados à identidade do paciente.
5. Incubá-los a 37 °C em atmosfera controlada (6% CO 2, 5% O₂).
6. Certifique-se de que uma verificação dupla do procedimento seja realizada por um segundo membro da equipe do laboratório.

9. Desnudamento de ovócitos

1. Realizar a remoção de células cumulus/corona dentro de 38 h após o gatilho da ovulação.
2. Preparar uma solução de Quinn's Advantage Medium com HEPES (suplementado com HSA a 5%) com Hialuronidase a uma concentração final de 10 UI/ml.
3. Prepare um prato de poço central com 1 mL de Quinn's Advantage Medium pré-aquecido com HEPES (suplementado com 5% de HSA) contendo Hialuronidase e outro com 1 mL de meio pré-aquecido tamponada com HEPES (suplementado com 5% de HSA).
4. Rotule as placas de desnudamento de ovócitos com dados de identificação do paciente.
5. Coloque os COCs no poço central que contém a enzima para dispersar as células cumulus com uma pipeta Pasteur de vidro, pipetando suavemente a solução contendo COCs para cima e para baixo por até 30 s.
6. Mova os ovócitos para o segundo prato do poço central contendo apenas o meio tamponada com HEPES, certificando-se de deslocar uma quantidade mínima da enzima.
7. Remova as células corona restantes usando pipetas de desnudamento com diâmetros internos decrescentes (170-140 μm).
8. Avaliar o estágio de maturação dos ovócitos, separando os oócitos da metáfase II (MII), caracterizados pela extrusão do primeiro corpo polar, dos oócitos da metáfase I (IM) e das vesículas germinativas (GV).
9. Transferir os oócitos MII em uma placa de Petri de 60 mm de cultura de FIV contendo nove (30 μL) gotas de meio de Cultura Única Contínua (CSCM) (suplementado com suplemento substituto sérico a 10% [SSS]) coberto com 6 mL de óleo mineral.
10. Incubá-los a 37 °C em atmosfera controlada (6% CO 2, 5% O₂).

10. Vitrificação de ovócitos

1. Realizar a vitrificação dos oócitos MII imediatamente após o desnudamento dos ovócitos, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante do kit de vitrificação.
2. Levar à temperatura ambiente (25-27 °C): a solução de equilíbrio (ES), a solução de vitrificação (VS) e a solução de lavagem (WS), quase 30 min antes do procedimento.
   NOTA: Conforme relatado pelos fabricantes, ES contém 7,5% de DMSO, 7,5% de etilenoglicol, 20% de suplemento sérico de dextrano (DSS), gentamicina em meio tamponada com HEPES M-199; VS contém 15% de DMSO, 15% de etilenoglicol, 0,5 M de sacarose, 20% de DSS, gentamicina em um meio tamponada com HEPES M-199 e WS contém 20% de DSS, gentamicina em um meio tamponada com HEPES M-199.
3. Para um criodispositivo, use Cryotop que consiste em uma tira fina de filme transparente presa a uma alça de plástico.
4. Rotule os criodispositivos com o nome do paciente, data de nascimento, identificação, data de criopreserva e número de ovócitos carregados em qualquer dispositivo.
5. Rotule o prato de vitrificação com o nome e o documento de identificação do paciente.
6. Certifique-se de que um operador testemunha verifique os dados corretos do paciente nos criodispositivos e no prato.
7. Encha uma caixa de resfriamento até o topo com nitrogênio líquido fresco e cubra até o uso para minimizar a dispersão e a evaporação.
8. Use uma pipeta decapante com um diâmetro interno de 170 μm para evitar danificar os oócitos durante a manipulação.
9. Agite suavemente cada frasco para injetáveis de ES, VS e WS para misturar o conteúdo antes de utilizar.
10. Prepare a tampa de uma placa de Petri de 60 mm com uma gota de 50 μL de WS1 (Figura 1A).
11. Coloque gotas imediatamente antes do uso para limitar a evaporação do meio.
12. Pegue o prato de ovócitos da incubadora e transfira os oócitos MII (até 3 de cada vez) com volume mínimo de meio do prato de cultura para os 50 μL de WS.
13. Dispensar gotas de 50 μL de WS2, ES1 e ES2 nas proximidades e transferir oócitos da gota WS1 para a gota WS2 (Figura 1B).
14. Mescle a queda de ES1 para WS2 e aguarde 2 min para a mistura espontânea de ambas as soluções.
15. Em seguida, mescle a queda de ES2 com as gotas mescladas anteriormente e deixe por mais 2 minutos.
16. Finalmente, mescle uma nova gota de 100 μL de ES3 com as gotas mescladas anteriormente e deixe por mais 1 minuto.
17. Colocar os ovócitos numa gota de 100 μL de ES4 durante 10 min (Figura 1C).
18. Dispensar duas gotas de 50 μL de VS e uma de 100 μL de VS (Figura 1D).
19. Mova os ovócitos sequencialmente para as três gotas de VS por 60 s para que os oócitos permaneçam em cada gota por ~20 s.
20. Quando aproximadamente 10 s forem deixados antes do final dos 60 s de incubação, coloque o criodispositivo sob o microscópio.
21. Carregue os ovócitos na ponta da pipeta e coloque-os no criodispositivo com a quantidade mínima de VS.
22. Aspirar o excesso de VS, deixando os ovócitos cobertos por uma fina camada de VS.
23. Mergulhe o criodispositivo diretamente no nitrogênio líquido e mova-o rapidamente. Mantenha o dispositivo em nitrogênio líquido e cubra-o com a tampa protetora.
24. Armazene o criodispositivo em um sistema de armazenamento (por exemplo, visiotube) e coloque-o no tanque criogênico. Registre os dados de criopreservação no banco de dados e na folha do laboratório.

11. Cuidados pós-operatórios de internação

1. Remova o cateter urinário e a gaze revestida de parafina vaginal 48 h após a cirurgia.
2. Explorar digitalmente a neovagina das pacientes após a remoção e instruir a paciente sobre como realizar a exploração digital. Em seguida, cubra um molde vaginal (9 cm de comprimento e 2 cm de diâmetro) com gel de estrogênio (para favorecer a epitelização) e instrua a paciente sobre como inserir e manter o molde.
3. A partir do dia 3 pós-operatório e em cada dia seguinte, instrua o paciente sobre como posicionar o molde e mantê-lo no lugar por pelo menos 2 h diárias.
4. Se não ocorrerem complicações, dê alta ao paciente no dia 5-6 após a cirurgia.

12. Cuidados pós-operatórios ambulatoriais

1. Instruir a paciente sobre como realizar a dilatação neovaginal por 2 meses com o mesmo molde (9 cm de comprimento e 2 cm de diâmetro) utilizado durante a internação hospitalar e, em seguida, um maior (11 cm de comprimento e 2,5 cm de diâmetro).
2. Após a visita de 3 meses, permita que a paciente inicie a atividade sexual e informe-a para continuar usando os moldes nos dias em que não há relação sexual.

13. Acompanhamento

1. Agende visitas de acompanhamento aos 1, 3, 6 e 12 meses após o procedimento.
2. Em cada visita de acompanhamento, avalie a adesão aos exercícios de dilatação e pergunte ao paciente se ele experimentou alguma limitação em suas atividades de vida diária, dor, sintomas urinários ou disfunção sexual (a partir da visita após o terceiro mês pós-cirurgia). Realizar exame ginecológico em cada visita de acompanhamento para medir a largura, comprimento, suspensão e mobilidade vaginais dos anexos.

Resultados

A Tabela 2 inclui os dados de estimulação ovariana das pacientes, enquanto os principais resultados cirúrgicos e funcionais estão descritos na Tabela 3. Os procedimentos laparoscópicos concomitantes de recuperação de ovócitos e vaginoplastia foram combinados com sucesso em todos os pacientes. Uma média de 11,4 ± 5,4 (média ± DP) foram recuperados, e 9,6 ± 4,3 oócitos MII foram criopreservados (Tabela 3). Em nossa experiência com a criopreservação de ovó...

Discussão

Este protocolo reduz a invasividade no tratamento da MRKHS combinando os procedimentos de vaginoplastia e recuperação de ovócitos. Para este propósito, é crucial que uma equipe dedicada seja designada para garantir que o tempo de COS, o procedimento cirúrgico e a vitrificação de ovócitos sejam programados de forma eficiente.

As pacientes com MRKHS para as quais se espera que esse método laparoscópico combinado seja mais benéfico são aquelas nas quais uma recuperação transvaginal...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oocyte retrieval procedure
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Portable incubator	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
14 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352057
4-well dish	Nunc	144444
60 mm Petri dish	Nunc	FA9150270
90 mm Petri dish	Nunc	FA9150360
Human Serum Albumin 100 mg/ml in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage Fertilization medium SAGE	Origio	1020
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Sterile glass pasteur pipettes
Oocyte denudation
Equipment
CO2 O2 Incubator	Sanyo
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674
Incubator	Thermo Scientific
Laminar Flow Hood	Cooper Surgical
Stereomicroscope	Nikon
Consumables
4-well dish	Nunc	144444
CSCM (Continuos single culture) medium	Fujifilm irvine Scientific	90165
Human Albumin 100 mg/mL in Normal Saline (5%)	Origio	3001
Hyaluronidase	Fujifilm Irvine Scientific	90101
IVF culture 60 mm petri dish	Nunc	FA9150270
Mineral oil for embryo culture	Origio	4008
One Well Dish	Oosafe	OOPW-CW05
Quinn’s Advantage medium with HEPES	Origio	1024
Serum Substitute Supplement	Fujifilm irvine Scientific	99193
Sterile glass pasteur pipettes
Stripping pipette tips (140 μm)	Cook	K-FPIP-1140-10BS-5
Stripping pipette tips (170 μm)	Cook	K-FPIP-1170-10BS-5
Oocyte vitrification
35 mm Petri dish	NUNC	150255
60 mm Petri dish	NUNC	150270
90 mm Petri dish	NUNC	150360
Container for Cooling rack	Kitazato
Cryodevice/cryotop	Kitazato	81111
Electronic timer
Flexipet	COOK	K- 1000
Gilson Pipetman	Gilson	F123601
Lab Printer LabXpert	Brady	XSL-86-461
Tips 20-200 µL	Thermo Scientific	2160G
Tips 2-20 µL	Thermo Scientific	2139-HR
Visotubes	Cryo Bio System	20
Vitrification Freeze Kit	Fujifilm Irvine Scientific	90133-SO
Vitrification Thaw kit	Fujifilm Irvine Scientific	90137-SO