研究压力诱导的海洛因复发的程序寻求惩罚强加的禁欲

摘要

描述了一种手术，该手术表明在惩罚实施禁欲后，强烈急性食物剥夺诱导海洛因复发。使用海洛因自我管理的寻找和获取链时间表成功实施了惩罚实施的禁欲模型。然后在食物剥夺应激24小时后进行海洛因寻求测试。

摘要

惩罚施加的禁欲程序模拟了人类由于与吸毒相关的不良后果而发起的自我禁欲。该模型已在使用不同类型的滥用物质（如甲基苯丙胺，可卡因和酒精）的实验中实施。然而，在受过海洛因训练的动物中，惩罚诱导的禁欲尚未得到证实。此外，急性应激是人类和动物模型复发的关键触发因素。先前已经证明，严重的食物匮乏有力地诱发了灭绝的可卡因和海洛因的恢复寻找。这里描述的程序可用于评估急性应激暴露对在惩罚实施禁欲后寻求海洛因的影响。共8只大鼠被植入慢性静脉注射（i.v.）导管，并接受自我给药训练（0.1mg / kg /输注）18天。完成寻道链接可以访问与海洛因输注配对的取样杆。寻道杆采用可变间隔60加固时间表（VI60）进行编程，而取向杠杆则以固定比率1加固时间表（FR1）进行编程。经过自我管理培训后，对已完成的寻道链接的30%而不是取向杆的延伸，进行了轻度足部冲击。脚击强度每天增加0.1 mA，从0.2 mA增加到1.0 mA。海洛因寻求测试是在食物剥夺（FD）或饱腹条件下24小时后进行的。处于急性食物匮乏状况下的老鼠在惩罚性禁欲后强烈增加海洛因。

引言

复发是药物治疗中最具挑战性的问题^1，2.然而，只有少数药物治疗被批准用于帮助避免人类复发³。北美目前面临的阿片类药物流行病就是一个突出的例子，它要求考虑对阿片类药物复发的动物模型采取不同的方法。

急性应激已被证明是人类复发的关键触发因素⁴.通常与药物成瘾相关的一个环境压力源是食物剥夺。吸毒者往往选择分配资源来获取药物而不是食物。热量缺乏已被证明与香烟⁵ 和酒精⁶ 的复发率较高有关。由于伦理和实际问题，在过去的几十年里，动物模型已经发展起来，以促进该领域的研究。在动物模型中，急性食物匮乏已被证明可以有力地恢复灭绝的海洛因寻求⁷。目前，大多数动物复发模型基于禁欲程序，这些程序要么不能代表人类禁欲（例如，基于灭绝的模型），要么仅包含由于监禁或住院治疗而被迫禁欲的一小部分吸毒者（例如，强制禁欲模型）。吸毒者选择戒毒的主要原因是与寻求毒品和服用⁸相关的负面后果。惩罚施加的禁欲是一种动物模型，它模仿了与寻求毒品相关的负面后果，对人类自我强加的禁欲。该模型引入了一种厌恶刺激，例如，轻度脚震，寻求或服用药物，导致动物自愿停止服用药物。另一个包含对药物寻求的负面影响的程序是药物戒毒和复发的电屏障冲突模型⁹。大鼠必须穿过电屏障才能执行与药物自我给药相关的操作行为。该模型被成功地用于证明自愿戒断和复发精神兴奋剂和阿片类药物^10，11。然而，在电屏障程序下，寻求药物的努力总是与令人厌恶的事件有关，这与人类状况不同。此外，吸毒本身可能与电击重叠，因为动物再次穿过屏障在输液后返回安全区域。

惩罚规定的禁欲已与其他滥用药物一起使用，如可卡因¹²，酒精¹³，甲基苯丙胺¹⁴，瑞芬太尼¹⁵，但它从未应用于海洛因训练的动物。该模型已被用于研究由启动¹⁴ 和药物相关线索¹⁶诱导的复发，但它没有整合到应激诱导的复发程序中。这里描述的程序用于证明急性食物匮乏诱导的海洛因复发，在雄性大鼠中强制戒酒后寻求惩罚。

研究方案

所有大鼠都根据加拿大动物护理委员会的指导方针进行治疗。所有实验程序的批准均由康考迪亚大学动物研究伦理委员会批准。

1. 动物

1. 获得体重275-300g（雄性）或225-250g（雌性）的长埃文斯大鼠。双家鼠在标准塑料笼子里，玉米棒垫料和碎纸，直到手术。
2. 让老鼠保持相反的光暗循环（上午9:30熄灯，晚上9:30点亮）。
3. 允许无限制地获取食物和水，但食物剥夺测试期间除外。使用普通的大鼠食物（20.9%的蛋白质，67.2%的碳水化合物和11.8%的脂肪）。

2. 静脉手术

1. 建立导管并进行静脉内手术，如Sedki等人2013¹⁷ 中所述，具有以下差异:1）使用异氟烷2-2.5%进行麻醉，2）通过皮下注射将手术期间给予的青霉素剂量更改为60 000 IU / 大鼠，以及3）将用于冲洗导管的肝素和庆大霉素混合物中的庆大霉素的剂量增加到7.5 IU + 800μg;0.2- 0.3毫升
2. 在手术后立即（从麻醉中恢复之前）和随后3天腹膜内或皮下注射酮洛芬或卡洛芬，一种抗炎镇痛药（5mg / kg）。在2天的恢复期间，给予捣碎的食物和热量（如有必要）以帮助恢复。每天称重并监督动物，以检查是否有任何突然的体重减轻或任何其他健康问题的迹象。

3. 行为程序

1. 操作性调节室:
   1. 设置操作条件反射室，如Sedki等人2013¹⁷中所述。
2. 习惯日:
   1. 手术后将大鼠安置在手术室中，并允许动物在开始任何方案之前习惯于室24小时。在整个实验过程中，将动物饲养在手术室中。
   2. 不要将大鼠连接到金属弹簧上，也不要启动任何实验方案（在习惯化日期间，提示光，音调和杠杆不可用）。
3. 海洛因自我管理:
   1. 将 5 个以上的连接器连接到 Tygon 管和金属弹簧。
   2. 根据下述程序设置6小时海洛因自我给药（0.1mg / kg /输注）的每日训练课程。
   3. 在反向光周期的暗阶段开始时（在代表性结果中约为上午9:30），使用寻找杆的延伸（或在前2天使用杠杆，见下文）开始每日训练，以及关闭房灯。
   4. 在固定比率1（FR1; 2天）下仅提供取样杆进行自我管理
      1. 对每次试验进行编程，从插入取样杆开始。
      2. 一旦大鼠按下服用杆一次（FR1），收回服用杆，打开杠杆上方的提示灯并调音20秒超时，关闭家用灯，并允许输送海洛因输注（0.1 mg / kg在0.13 mL中）
      3. 对30秒的试验间隔进行编程，其中没有提示，室灯关闭，杠杆缩回。在下一次试验开始时，插入取向杆，然后打开室内灯。
   5. FR1 下使用寻道链进行自我管理（5 天）
      1. 对操作训练系统进行编程，使其仅插入寻道杆并打开室内灯以指示会话开始。取样杆处于缩回状态。
      2. 一旦大鼠按下一次（FR1）在寻道杆上，程序就会收回寻道杆并插入取向杆。
      3. 一键按下取样杆（FR1）即可收回取样杆，并启动与步骤3.3.4.2相同的程序和30秒的试验间隔。
      4. 对操作训练系统进行编程，在试验间隔结束时插入寻道杆，并打开室内灯以指示下一个试验的开始。
      5. 对操作训练系统进行编程，如果大鼠未能在10分钟内完成寻道 - 取向链（不按寻道或取样杆），则启动试验间隔，以表示试验结束并失去给药的机会。
   6. 在可变间隔（VI5、VI30 和 VI60）下使用寻道-取链进行自我管理
      1. 对第 3.3.5 节中的所有步骤进行编程，但引入 5 （VI5） 的可变间隔作为寻道杆上的新加固时间表，而不是 FR1。允许根据VI5时间表进行为期3天的自我管理培训。
      2. 将软件设置为允许第一次按下寻道杆以激活VI5时间表。对于VI5计划，让软件从0.1 s，5 s和10 s的列表中随机选择间隔时间，这导致平均间隔为5 s。在选定间隔过后，第一次按下寻道杆，收回寻道杆并伸出取向杆。
      3. 按照步骤 3.3.4.2、3.3.5.4.、3.3.5.5。用于获取杠杆和试用结束说明。
      4. 接下来，在VI30计划下训练大鼠5天进行寻找链接，然后在VI60计划下训练3天。
      5. 对于VI30计划，允许软件从15秒，30秒和45秒的列表中随机选择一个时间，平均为30秒，而对于VI60时间表，软件从45秒，60秒和75秒的列表中随机选择一个时间。
      6. 根据不同的强化时间表改变试验间隔。在FR1和VI5期间以30秒开始试验间隔，但在VI30和VI60期间逐渐增加到7分钟。
4. 惩罚性禁欲
   1. 通过插入寻找杆并打开家灯来开始惩罚会话。允许8天的惩罚会议，并定期监督，以确保动物不会出现异常疼痛或任何健康问题的迹象。
   2. 对操作训练系统进行编程，以便在VI60下完成寻道链接后，寻道杆缩回，关闭室内灯，并在已完成的寻道链接的30%上施加轻度脚震，而不是插入取向杆。取样杆延伸到其他70%已完成的寻求链接上，就像在正常的自我管理试验中一样。
   3. 在插入寻道杆并打开室内灯之前，在关闭所有提示和室内灯的情况下，对试验间隔进行7分钟的间隔，以表示下一次试验的开始。
   4. 将脚震强度设置为0.2 mA，每个惩罚日增加0.1 mA，直到1.0 mA。
   5. 在大鼠按下服用杆后（在可用时进行试验），重复步骤3.3.4.2以收回杠杆，提供海洛因输注和呈现线索，然后进行7分钟的试验间隔。
   6. 通过插入寻道杆并打开室内灯开始下一个试验。
   7. 如果大鼠10分钟内没有按下任何杠杆，请按照步骤3.3.5.5操作。
5. 急性食物匮乏（24小时）
   1. 在惩罚实施禁欲的最后一天的第二天，将大鼠分成两个匹配的组（根据体重和过去3天自我管理训练的平均寻道杆和输液次数）:食物被剥夺（FD）和Sated。
   2. 从腔室中取出食物料斗（上午9:30左右），用于接受食物剥夺诱导的复发测试的大鼠，并为可以无限制地获得食物的满足组保留食物料斗。为两组动物提供无限制的水源，并监督动物，以确保它们在食物匮乏期间不会出现任何健康问题。
6. 食物匮乏诱发的海洛因寻求检测
   1. 在食物剥夺24小时后的第二天早上，根据VI60时间表进行3小时海洛因寻找测试，试验间隔为7分钟，没有电击或海洛因输注。在3小时后将食物斗返回给食物匮乏的大鼠。
   2. 在第一次海洛因寻求测试后的早晨，从第一次复发测试中放置的老鼠的腔室中取出食物料斗。在测试之前和测试期间，允许以前食物匮乏的大鼠无限制地获得食物（饱和状态）。
   3. 第二天（在24小时食物剥夺后）进行另一次3小时海洛因寻求测试，如步骤3.6.1所示。
   4. 测试后的第二天使用二氧化碳室对大鼠实施安乐死（100%CO₂ ，填充率为每分钟室体积的30-70%）。

结果

雄性大鼠在训练日内随着强化时间表的增加而显示出寻找杠杆压力的增加，并且在训练日内输注海洛因的可靠，一致（图1）。在惩罚期间，随着8个惩罚日内脚震强度的增加，大鼠减少了寻找杠杆压力和输注的数量（图2）。食物匮乏状况显著增加海洛因在惩罚后强制禁欲（喂养条件:F_{（1， 7）} = 7.12，p = .0.03， d = 1.3; 图 3A<...

讨论

本文有两个重要的演示。首先，使用寻找和获取带有海洛因的链条来验证惩罚强加的禁欲。其次，证明在惩罚实施的禁欲程序中可以观察到压力诱导的复发。这些都是重要的证明，因为（i）惩罚诱导的禁欲程序更接近于人类状况，因为它导致自愿禁欲，即不是由于寻求药物的灭绝或被迫从吸毒环境中移除¹⁸，（ii）使用生态相关的压力源证明了可靠的复发:急性食物剥夺压力。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anafen Injection 100 mg/mL Vial/50 mL	MERIAL Canada, Inc.	1938126	anti-inflammatory drug
Balance arm	Coulbourn Instruments	H29-01
Cannulae (22 G, 5-up)	Plastics One	C313G-5up
Environment connection board & Linc cable	Coulbourn Instruments	H03-04
Fixed speed infusion pump (3.3 RPM)	Coulbourn Instruments	A73-01-3.3
GE Marine Silicon	GE	SE-1134
Graphic State Notation 3	Coulbourn Instruments	GS3	Software
Habitest universal Linc	Coulbourn Instruments	H02-08
Heroin HCl	National Institute for Drug Abuse, Research Triangle Park, NC, USA
House light-Rat	Coulbourn Instruments	H11-01R
Isofluorane USP 99.9% Vial/250 mL	Fresenius Kabi Canada Ltd	2237518
Liquid Swivels, Plastic, 22 G	Lomir Biomedical, Inc.	RSP1
Rat test cage	Coulbourn Instruments	H10-11R-TC	Operant conditioning chambers
Retractable lever-Rat	Coulbourn Instruments	H23-17RA
Silastic tubing (ID 0.02, OD 0.037)	Fisher Scientific (Canada)	1118915A
Single high-bright cue-Rat	Coulbourn Instruments	H11-03R
Sound attenuation boxes	Concordia University	Home made
Stainless steal grid floor	Coulbourn Instruments	H10-11R-TC-SF
System controller 2	Coulbourn Instruments	SYS CTRL 2
System power base	Coulbourn Instruments	H01-01
Tone module 2.9 KHz	Coulbourn Instruments	H12-02R-2.9
Tygon tubing (ID 0.02, OD 0.060)	VWR	63018-044