Una procedura per studiare la ricaduta indotta dallo stress della ricerca di eroina dopo l'astinenza imposta dalla punizione

Riepilogo

Viene descritta una procedura che dimostra una robusta ricaduta acuta indotta dalla privazione alimentare alla ricerca di eroina dopo l'astinenza imposta dalla punizione. Un modello di astinenza imposta dalla punizione è stato implementato con successo utilizzando il programma di catena cerca e prendi per l'autosomministrazione di eroina. I test per la ricerca di eroina vengono quindi eseguiti dopo 24 ore di stress da privazione alimentare.

Abstract

La procedura di astinenza imposta dalla punizione modella l'astinenza autoimposta che gli esseri umani iniziano a causa delle conseguenze negative associate all'assunzione di droghe. Questo modello è stato implementato in esperimenti che utilizzano diversi tipi di sostanze di abuso come metanfetamine, cocaina e alcol. Tuttavia, l'astinenza indotta dalla punizione negli animali addestrati all'eroina non è stata dimostrata. Inoltre, lo stress acuto è un fattore scatenante chiave per la ricaduta negli esseri umani e nei modelli animali. In precedenza era stato dimostrato che la privazione acuta del cibo induceva in modo robusto il ripristino della ricerca di cocaina ed eroina estinte. La procedura qui descritta può essere utilizzata per valutare gli effetti dell'esposizione acuta allo stress sulla ricerca di eroina dopo l'astinenza imposta dalla punizione. Un totale di 8 ratti sono stati impiantati con cateteri cronici per via endovenosa (e.v.) e addestrati ad auto-somministrarsi eroina (0,1 mg / kg / infusione) per 18 giorni secondo un programma di concatenamento di ricerca-prelievo. Il completamento del link di ricerca ha dato accesso alla leva di presa, che è stata abbinata a un'infusione di eroina. La leva di ricerca è stata programmata con un intervallo variabile 60 di schema di rinforzo (VI60), e la leva di presa è stata programmata con un programma di rinforzo a rapporto fisso 1 (FR1). Dopo l'allenamento di auto-somministrazione, è stato erogato un lieve shock al piede sul 30% dei collegamenti di ricerca completati invece dell'estensione della leva di presa. L'intensità del footshock è stata aumentata di 0,1 mA per sessione giornaliera da 0,2 mA a 1,0 mA. I test per la ricerca di eroina sono stati eseguiti dopo 24 ore di privazione alimentare (FD) o condizioni sazie. I ratti in condizioni di deprivazione alimentare acuta hanno aumentato notevolmente la ricerca di eroina dopo l'astinenza imposta dalla punizione.

Introduzione

La recidiva è il problema più impegnativo nel trattamento del consumo di droga ^1,2. Tuttavia, solo una manciata di trattamenti farmacologici sono approvati per aiutare a evitare la ricaduta negli esseri umani³. L'epidemia di oppioidi che il Nord America sta attualmente affrontando ne è un esempio lampante e richiede di considerare diversi approcci su modelli animali di ricaduta agli oppioidi.

Lo stress acuto ha dimostrato di essere un fattore scatenante chiave per la ricaduta negli esseri umani⁴. Un fattore di stress ambientale che è spesso associato alla tossicodipendenza è la privazione del cibo. I tossicodipendenti spesso scelgono di destinare risorse all'approvvigionamento di droghe anziché di cibo. È stato dimostrato che il deficit calorico è correlato a una maggiore ricaduta alle sigarette⁵ e all'uso di alcol⁶. A causa di questioni etiche e pratiche, negli ultimi decenni sono stati sviluppati modelli animali per facilitare la ricerca sul campo. Nei modelli animali, è stato dimostrato che la privazione acuta del cibo ripristina in modo robusto l'eroina estinguente che cerca⁷. Attualmente, la maggior parte dei modelli animali di recidiva si basa su procedure di astinenza che non sono rappresentative dell'astinenza umana (ad esempio, modelli basati sull'estinzione) o comprendono solo la piccola percentuale di consumatori di droghe che sono costretti ad astenersi a causa della detenzione o del trattamento ospedaliero (ad esempio, modelli di astinenza forzata). Il motivo principale per cui i consumatori di droga scelgono di astenersi sono le conseguenze negative associate alla ricerca e all'assunzione di^{stupefacenti 8}. L'astinenza imposta dalla punizione è un modello animale che imita le conseguenze negative associate alla ricerca di droghe sull'astinenza autoimposta negli esseri umani. Questo modello introduce uno stimolo avversivo, ad esempio un lieve colpo di piede, con ricerca o assunzione di droghe, che porta l'animale a interrompere l'assunzione volontaria del farmaco. Un'altra procedura che incorpora conseguenze negative per la ricerca di droga è il modello di conflitto di barriera elettrica per l'astinenza e la recidiva^9. Il ratto deve attraversare una barriera elettrica per eseguire il comportamento operante legato all'auto-somministrazione del farmaco. Il modello è stato utilizzato con successo per dimostrare l'astinenza volontaria e la ricaduta a farmaci psicostimolanti e oppioidi^10,11. Tuttavia, sotto la procedura di barriera elettrica, gli sforzi di ricerca di droga sono sempre associati a un evento avversivo, a differenza della condizione umana. Inoltre, l'assunzione di droghe stessa potrebbe sovrapporsi alla scossa elettrica mentre l'animale ritorna nell'area sicura dopo l'infusione attraversando nuovamente la barriera.

L'astinenza imposta dalla punizione è stata usata con altre droghe d'abuso come la cocaina¹², l'alcol 13, la metanfetamina 14, il remifentanil¹⁵, ma non è mai stata applicata agli animali addestrati all'eroina. Il modello è stato utilizzato per studiare la recidiva indotta dal priming¹⁴ e i segnali associati al farmaco¹⁶, ma non è stato integrato in una procedura di recidiva indotta dallo stress. La procedura qui descritta viene utilizzata per dimostrare la ricaduta acuta indotta dalla privazione alimentare alla ricerca di eroina dopo l'astinenza imposta dalla punizione nei ratti maschi.

Protocollo

Tutti i ratti sono trattati secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care. L'approvazione per tutte le procedure sperimentali è stata concessa dal Comitato Etico per la Ricerca Animale della Concordia University.

1. Animali

1. Acquisire ratti Long Evans del peso di 275-300 g (maschi) o 225-250 g (femmine). Topi domestici doppi in gabbie di plastica standard con lettiera di pannocchie e carta triturata fino all'intervento chirurgico.
2. Tenere i ratti su un ciclo chiaro-buio invertito (luci spente alle 9:30, luce accesa alle 21:30).
3. Consentire l'accesso illimitato a cibo e acqua, tranne durante il test di privazione alimentare. Utilizzare rat chow normale (20,9% di proteine, 67,2% di carboidrati e 11,8% di grassi).

2. Interventi chirurgici per via endovenosa

1. Costruire cateteri ed eseguire interventi chirurgici per via endovenosa come descritto in Sedki et al. 2013¹⁷ con le seguenti differenze: 1) Utilizzare isofluorano 2-2,5% per l'anestesia, 2) Modificare la dose di penicillina somministrata durante l'intervento chirurgico a 60 000 UI / ratto, tramite iniezione sottocutanea, e 3) Aumentare la dose di gentamicina nella miscela di eparina e gentamicina utilizzata per lavare i cateteri a 7,5 UI + 800 μg; 0,2- 0,3 ml.
2. Iniettare ketoprofene o carprofene, un analgesico antinfiammatorio, per via intraperitoneale o sottocutanea (5 mg/kg) immediatamente dopo l'intervento chirurgico (prima del recupero dall'anestesia) e nei 3 giorni successivi. Durante il periodo di recupero di 2 giorni, somministrare purè di cibo e calore (se necessario) per aiutare con il recupero. Pesare e sorvegliare quotidianamente gli animali per verificare eventuali perdite improvvise di peso o altri segni di problemi di salute.

3. Procedura comportamentale

1. Camere di condizionamento operanti:
   1. Impostare le camere di condizionamento operante come descritto in Sedki et al. 2013¹⁷.
2. Giorno di assuefazione:
   1. Ospitare i ratti nelle camere di addestramento operanti dopo il recupero dall'intervento chirurgico e consentire agli animali di abituarsi alla camera per 24 ore prima di iniziare qualsiasi protocollo. Tenere gli animali alloggiati nelle camere operatorie durante l'intero esperimento.
   2. Non attaccare i ratti alla molla metallica e non avviare alcun protocollo sperimentale (la cue-light, il tono e le leve non sono disponibili durante il giorno di assuefazione).
3. Autosomministrazione di eroina:
   1. Collegare il connettore 5-up al tubo Tygon e alla molla metallica.
   2. Impostare sessioni di allenamento giornaliere di 6 ore di autosomministrazione di eroina (0,1 mg/kg/infusione) secondo la procedura descritta di seguito.
   3. Iniziare sessioni di allenamento giornaliere all'inizio della fase oscura del ciclo di luce inversa (intorno alle 9:30 nei risultati rappresentativi) con l'estensione della leva di ricerca (o prendere la leva nei primi 2 giorni; vedi sotto), oltre a spegnere la luce domestica.
   4. Autosomministrazione con la sola leva di presa disponibile a rapporto fisso 1 (FR1; 2 giorni)
      1. Programma ogni prova per iniziare con l'inserimento della leva di presa.
      2. Una volta che il topo preme una volta la leva di presa (FR1), ritrarre la leva di presa, accendere la spia di cue sopra la leva e il tono per un periodo di timeout di 20 s, spegnere la luce domestica e consentire l'erogazione di un'infusione di eroina (0,1 mg / kg in 0,13 ml)
      3. Programma un intervallo inter-prova di 30 s in cui non vengono presentati segnali, la luce domestica viene spenta e la leva viene retratta. Per l'inizio della prova successiva, inserire la leva di presa e accendere la luce di casa.
   5. Autosomministrazione con catena di ricerca-cattura sotto FR1 (5 giorni)
      1. Programmare il sistema di allenamento operante per inserire solo la leva di ricerca e accendere la luce domestica per segnalare l'inizio della sessione. La leva di presa è in uno stato retratto.
      2. Una volta che il ratto preme una volta (FR1) sulla leva di ricerca, il programma ritrae la leva di ricerca e inserisce la leva di presa.
      3. Una pressione sulla leva di presa (FR1) ritrae la leva di presa e avvia la stessa procedura del punto 3.3.4.2 e un intervallo interprova di 30 s.
      4. Programmare il sistema di addestramento operante per inserire la leva di ricerca al termine dell'intervallo tra le prove e accendere la luce domestica per segnalare l'inizio della prova successiva.
      5. Programmare il sistema di addestramento operante per avviare l'intervallo inter-trial se un ratto non riesce a completare la catena di ricerca-presa durante 10 minuti (senza premere la leva di ricerca o presa) per rappresentare la fine di una sperimentazione e la perdita dell'opportunità di somministrare il farmaco.
   6. Autosomministrazione con catena di ricerca-acquisizione a intervalli variabili (VI5, VI30 e VI60)
      1. Programmare tutti i passaggi nella sezione 3.3.5, ma introdurre un intervallo variabile di 5 (VI5) come nuovo schema di rinforzo sulla leva di ricerca, anziché FR1. Consentire l'allenamento di autosomministrazione secondo il programma VI5 per 3 giorni.
      2. Impostare il software per consentire alla prima pressione sulla leva di ricerca di attivare il programma VI5. Per la pianificazione VI5, lasciare che il software selezioni casualmente un intervallo da un elenco di 0,1 s, 5 s e 10 s, il che si traduce in un intervallo medio di 5 s. La prima pressione della leva di ricerca dopo che è trascorso l'intervallo selezionato, ritrae la leva di ricerca ed estende la leva di presa.
      3. Seguire i passaggi 3.3.4.2, 3.3.5.4., 3.3.5.5. per prendere la leva e le istruzioni di fine prova.
      4. Successivamente, addestra i ratti per 5 giorni sotto il programma VI30 per il link di ricerca, seguito da 3 giorni sotto il programma VI60.
      5. Per la pianificazione VI30, consentire al software di selezionare casualmente un orario da un elenco di 15 s, 30 s e 45 s, per una media di 30 s, mentre per il programma VI60, il software seleziona casualmente un tempo da un elenco di 45 s, 60 s e 75 s.
      6. Variare gli intervalli tra i processi lungo i diversi programmi di rinforzo. Iniziare l'intervallo tra le prove a 30 s durante FR1 e VI5, ma aumentare gradualmente a 7 minuti durante VI30 e VI60.
4. Astinenza imposta dalla punizione
   1. Inizia le sessioni di punizione con l'inserimento della leva di ricerca e l'accensione della luce di casa. Consentire sessioni di punizione per 8 giorni, con una supervisione regolare per garantire che gli animali non mostrino segni di dolore anormale o problemi di salute.
   2. Programmare il sistema di addestramento operante in modo che, dopo aver completato il collegamento di ricerca sotto VI60, la leva di ricerca si ritragga, la luce domestica venga spenta e venga somministrato un leggero footshock sul 30% dei collegamenti di ricerca completati invece dell'inserimento della leva di presa. La leva di presa si estende sull'altro 70% dei collegamenti di ricerca completati, come in un normale studio di auto-somministrazione.
   3. Programmare un intervallo inter-prova di 7 minuti con tutti i segnali e la luce domestica spenta prima di inserire la leva di ricerca e accendere la luce domestica per segnalare l'inizio della prova successiva.
   4. Impostare l'intensità del footshock a 0,2 mA e aumentare di 0,1 mA per giorno di punizione fino a 1,0 mA.
   5. Dopo che i ratti hanno premuto la leva di presa (nelle prove quando è disponibile), ripetere il punto 3.3.4.2 per la retrazione della leva, l'erogazione dell'infusione di eroina e la presentazione dei segnali, seguita da un intervallo interprocesso di 7 minuti.
   6. Inizia la prova successiva con l'inserimento della leva di ricerca e l'accensione della luce di casa.
   7. Se il ratto non preme alcuna leva per 10 minuti, seguire il punto 3.3.5.5.
5. Deprivazione alimentare acuta (24 h)
   1. Il giorno successivo all'ultimo giorno di astinenza imposta dalla punizione, dividere i ratti in due gruppi abbinati (in base al peso corporeo e al numero medio di leve e infusi negli ultimi 3 giorni di allenamento di auto-somministrazione): Food Deprived (FD) e Sazia.
   2. Rimuovere le tramogge di cibo dalle camere (intorno alle 9:30) per i ratti sottoposti a test di recidiva indotta dalla privazione del cibo e mantenere tramogge di cibo per il gruppo sazio che ha accesso illimitato al cibo. Fornire accesso illimitato all'acqua in entrambi i gruppi e sorvegliare gli animali per garantire che non mostrino problemi di salute durante il periodo di privazione del cibo.
6. Test di ricerca dell'eroina indotta dalla privazione alimentare
   1. La mattina dopo le 24 ore di privazione del cibo, eseguire un test di ricerca di eroina di 3 ore, sotto un programma VI60 con un intervallo inter-prova di 7 minuti senza shock o infusioni di eroina in esecuzione. Restituire le tramogge di cibo ai ratti privi di cibo dopo la sessione di 3 ore.
   2. La mattina dopo il primo test di ricerca dell'eroina, rimuovere le tramogge di cibo dalle camere dei ratti che sono stati sazi al primo test di ricaduta. Consentire ai ratti che in precedenza erano privi di cibo accesso illimitato al cibo (condizione sazia) prima e durante il test.
   3. Eseguire un altro test di ricerca dell'eroina di 3 ore il giorno successivo (dopo 24 ore di privazione del cibo), come al punto 3.6.1.
   4. Il giorno dopo il test eutanasia i ratti usando una camera di anidride carbonica (100% CO₂ a velocità di riempimento del 30-70% del volume della camera al minuto).

Risultati

I ratti maschi hanno dimostrato un aumento delle pressioni a leva di ricerca man mano che il programma di rinforzo aumentava durante i giorni di addestramento e un numero affidabile e costante di infusioni di eroina durante i giorni di allenamento (Figura 1). Durante la punizione, i ratti hanno diminuito il numero di presse e infusioni della leva di ricerca con l'aumento dell'intensità della scossa di piede in 8 giorni di punizione (Figura 2). La condizione di ...

Discussione

Ci sono due importanti dimostrazioni in questo documento. In primo luogo, la convalida dell'astinenza imposta dalla punizione usando la catena cerca e prendi con l'eroina. In secondo luogo, è stato dimostrato che la ricaduta indotta dallo stress potrebbe essere osservata in una procedura di astinenza imposta dalla punizione. Queste sono dimostrazioni importanti perché (i) la procedura di astinenza indotta dalla punizione imita più da vicino la condizione umana in quanto si traduce in astinenza volontaria, cioè non do...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anafen Injection 100 mg/mL Vial/50 mL	MERIAL Canada, Inc.	1938126	anti-inflammatory drug
Balance arm	Coulbourn Instruments	H29-01
Cannulae (22 G, 5-up)	Plastics One	C313G-5up
Environment connection board & Linc cable	Coulbourn Instruments	H03-04
Fixed speed infusion pump (3.3 RPM)	Coulbourn Instruments	A73-01-3.3
GE Marine Silicon	GE	SE-1134
Graphic State Notation 3	Coulbourn Instruments	GS3	Software
Habitest universal Linc	Coulbourn Instruments	H02-08
Heroin HCl	National Institute for Drug Abuse, Research Triangle Park, NC, USA
House light-Rat	Coulbourn Instruments	H11-01R
Isofluorane USP 99.9% Vial/250 mL	Fresenius Kabi Canada Ltd	2237518
Liquid Swivels, Plastic, 22 G	Lomir Biomedical, Inc.	RSP1
Rat test cage	Coulbourn Instruments	H10-11R-TC	Operant conditioning chambers
Retractable lever-Rat	Coulbourn Instruments	H23-17RA
Silastic tubing (ID 0.02, OD 0.037)	Fisher Scientific (Canada)	1118915A
Single high-bright cue-Rat	Coulbourn Instruments	H11-03R
Sound attenuation boxes	Concordia University	Home made
Stainless steal grid floor	Coulbourn Instruments	H10-11R-TC-SF
System controller 2	Coulbourn Instruments	SYS CTRL 2
System power base	Coulbourn Instruments	H01-01
Tone module 2.9 KHz	Coulbourn Instruments	H12-02R-2.9
Tygon tubing (ID 0.02, OD 0.060)	VWR	63018-044