用于微RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

摘要

该协议描述了用于microRNA聚类网络分析的高通量簇规则间隔短回文重复（CRISPR）基因编辑工作流程，允许在单个实验中快速生成一组携带独特miRNA簇成员缺失组合的转基因细胞系。

摘要

微RNA（miRNA）已成为癌症和转移的重要细胞调节因子（肿瘤抑制因子，促致癌因子）。大多数已发表的研究在表征小RNA在癌症中的作用时都集中在单个miRNA上。然而，约30%的人miRNA基因被组织在通常共表达的簇状单元中，表明非编码RNA调控系统复杂且协调。在将非编码小RNA翻译到临床之前，需要更清楚地说明簇状miRNA网络如何协同工作以调节肿瘤生长，癌症侵袭性和耐药性。

使用高通量簇有规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）介导的基因编辑程序已被用于研究位于前列腺癌背景下长度约为35，000 bp的位点内的七个miRNA基因的基因组簇的致癌作用。对于这种方法，人类癌细胞系被多西环素（DOX）诱导的Cas9核酸酶的慢病毒载体感染，该载体在含DOX的培养基中生长48小时。随后，这些细胞与合成的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）共转染，并与基因组位点特异性CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸复合，以允许在单个实验中快速产生携带整个miRNA簇缺失和单个或组合miRNA基因簇缺失的癌细胞系。

这种高通量基因编辑系统的优点是能够避免耗时的DNA载体亚克隆，灵活地以24孔格式使用独特的引导RNA组合转染细胞，以及使用粗细胞裂解物进行低成本的PCR基因分型。使用这种简化方法的研究有望揭示miRNA集群成员之间的功能冗余和协同/拮抗相互作用，这将有助于表征涉及人类疾病的复杂小型非编码RNA网络，并更好地为未来的治疗设计提供信息。

引言

需要更好的研究工具来研究非编码RNA对人类疾病的贡献。在比较癌症患者组织和体液（例如血液、尿液）中这些小的非编码RNA的表达谱与非癌、健康个体的表达谱时，通常观察到MiRNA失调，采用微阵列、定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和下一代深度测序技术^1，2.最近的工作将这些miRNA的很大一部分表征为肿瘤抑制因子，致癌因子和转移因子，可控制肿瘤形成，疾病进展和耐药性。miRNA的实验性过表达和/或下调/丢失导致细胞中的功能性和多效性后果，反映了这些非编码RNA协调的广泛癌症相关活动 - 生长，细胞凋亡，分化，染色质重塑，血管生成，上皮至间充质（EMT）和MET过渡，代谢和免疫反应³。

MiRNA被编码为单个基因或驻留在基因组簇中，这些基因组簇在细胞核中转录并广泛处理，然后产生生物成熟的单链~22个核苷酸（nt）miRNA物种，这些物种位于细胞质⁴中。这些小RNA在转录后发挥其作用，并充当负基因调节剂，以序列特异性方式与信使RNA（mRNA）靶标结合，将催化RNA诱导的沉默复合物（RISC）带到mRNA位点，导致mRNA降解和/或蛋白质翻译中的阻断。MiRNA是动物系统中一类极其丰富的非编码RNA，人类基因组中存在2，654个成熟的miRNA（miRBase版本22....

研究方案

1. 制备CRISPR基因编辑并指导RNA设计以生成miRNA簇敲除细胞系

1. 使用DNA序列注释软件程序¹⁹创建包含感兴趣的miRNA簇区域（基因间，内旋）和至少1 kB周围基因组区域的完整基因组序列的DNA文件。
   1. 使用创建的DNA文件中 的特征 编辑工具标记目标miRNA簇位点（基因间，导入）和属于miRNA簇的每个单独的miRNA发夹序列，并记录其他附近的编码和非编码基因和/或调节特征^{5，20，21，22}。
   2. 确保靶向删除的miRNA区域不会无意中破坏附近的蛋白质编码基因、非编码基因或重要的调节DNA元件。
      注意：考虑本方案中使用的细胞系的基因组复杂性（例如，染色体重复/融合）。
2. 使用生物信息学指南 RNA 设计软件工具（例如，²³).确保在指南RNA设计工具中标注适当的Cas9酶（即 S. pyogenes 卡斯9）。
   注意：合成的crRNA将包含这个独特的5'端20 nt引导序列（与D....

结果

这种高通量CRISPR缺失方案成功地使用了Cas9诱导的LNCaP和PC3-ML人癌细胞系的转染，以及靶向miR-888集群的合成寡核苷酸指南RNA，这些RNA在前列腺癌的背景下进行了研究。miR-888簇最初在表达分析筛选中被鉴定为在患有高级别疾病的前列腺癌患者中升高，而低级别和非癌症患者^为9，10。miR-888簇跨越35，124 bp，由人类染色体Xq27.3上的七个miRNA（miR-892c，-890，-888，.......

讨论

这种CRISPR基因编辑程序允许研究人员快速生成带有独特miRNA簇缺失组合的整个细胞系组合。由5'和3'基因组位点特异性crNA组成的合成引导RNA的转染与合成tracrRNA（1：1摩尔比）退火，在该方案中避免了耗时的质粒载体亚克隆，并允许使用24孔格式进行更灵活和高通量的实验设计。携带 DOX 诱导的 Cas9 慢病毒盒的细胞系的生成可在引导 RNA 的细胞转染期间实现严格 DOX 调节和稳健的 Cas9 表达，并在后续步.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system