JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

Abstract

מיקרו-רנ"א (miRNA) התגלו כמווסתים תאיים חשובים (מדכאי גידולים, גורמים פרו-אונקוגניים) של סרטן וגרורות. רוב המחקרים שפורסמו מתמקדים ב-miRNA יחיד כאשר הם מאפיינים את תפקידם של רנ"א קטנים בסרטן. עם זאת, כ-30% מגני ה-miRNA האנושיים מאורגנים ביחידות מקובצות שלעתים קרובות מבוטאות במשותף, מה שמצביע על מערכת מורכבת ומתואמת של ויסות RNA שאינו מקודד. נדרשת הערכה ברורה יותר של האופן שבו רשתות miRNA מקובצות מתפקדות בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות של הסרטן והעמידות לתרופות לפני תרגום רנ"א קטנים שאינם מקודדים למרפאה.

השימוש בהליך עריכת גנים קצר (CRISPR) בתיווך קרינה בתפוקה גבוהה נעשה כדי לחקור את התפקיד האונקוגני של אשכול גנומי של שבעה גנים miRNA הממוקמים בתוך לוקוס המשתרע על פני כ-35,000 bp באורך של כ-35,000 bp בהקשר של סרטן הערמונית. לצורך גישה זו, קווי תאים סרטניים אנושיים היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס עבור דוקסיציקלין (DOX) - נוקלאז Cas9 הניתן להשראה שגדל במדיום המכיל DOX במשך 48 שעות. לאחר מכן התאים עברו טרנספקטציה משותפת עם רנ"א (tracrRNA) סינתטי המפעיל טרנס-רן (tracrRNA) המורכב עם אוליגונוקלאוטידים של CRISPR RNA (crRNA) ספציפיים לאתר גנומי, כדי לאפשר יצירה מהירה של קווי תאים סרטניים הנושאים את כל מחיקת אשכול ה-miRNA ומחיקות של צבירי גנים בודדים או משולבים של miRNA בניסוי יחיד.

היתרונות של מערכת עריכת גנים בתפוקה גבוהה זו הם היכולת להימנע מתת-תקצוב וקטור DNA גוזל זמן רב, הגמישות בהעברת תאים עם שילובי RNA מנחים ייחודיים בפורמט של 24 בארות, וגנוטיפ PCR בעלות נמוכה יותר באמצעות ליזטים של תאים גולמיים. מחקרים המשתמשים בגישה יעילה זו מבטיחים לחשוף יתירות תפקודית ואינטראקציות סינרגטיות/אנטגוניסטיות בין חברי אשכול miRNA, אשר יסייעו באפיון רשתות הרנ"א הקטנות המורכבות שאינן מקודדות המעורבות במחלות אנושיות ויודיעו טוב יותר על תכנון טיפולי עתידי.

Introduction

נדרשים כלי מחקר טובים יותר כדי לחקור את התרומה של רנ"א שאינם מקודדים במחלות אנושיות. דיסרגולציה של MiRNA נצפית לעתים קרובות בהפרעות אנושיות כגון סרטן כאשר משווים את פרופילי הביטוי של רנ"א קטנים אלה שאינם מקודדים ברקמות ובנוזלי הגוף (למשל, דם, שתן) של חולי סרטן לעומת אנשים שאינם סרטניים ובריאים, שימוש במיקרו-מערכים, שימוש במיקרו-מערכים, PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), וטכנולוגיות ריצוף עמוק מהדור הבא 1,2 . עבודות אחרונות אפיינו תת-קבוצה גדולה של miRNA אלה כגורמים מדכאי גידול, אונקוגניים וגרורות השולטים על היווצרות הגידול, התקדמות המחלה ועמידות לתרופות. ביטוי יתר ניסיוני ו/או הפחתה/אובדן של miRNAs גורמים להשלכות תפקודיות ופליוטרופיות בתא, המשקפות את המגוון הרחב של פעילויות הקשורות לסרטן ש-RNAs אלה אינם מקודדים מתאמים - גדילה, אפופטוזיס, התמיינות, שיפוץ כרומטין, אנגיוגנזה, אפיתל למזנכימלי (EMT) ומעברי MET, חילוף חומרים ותגובה חיסונית3.

MiRNAs מקודדים כגנים בודדים או חיים באשכולות גנומיים, אשר מתועתקים בגרעין ומעובדים באופן נרחב לפני שהם יוצרים את מיני ה-miRNA הבוגרים מבחינה ביולוגית, חד-גדיליים ~ 22 נוקלאוטידים (nt) הממוקמים בציטופלסמה4. הרנ"א הקטנים האלה מפעילים את השפעתם לאחר שעתוק ופועלים כרגולטורים של גנים שליליים הנקשרים למטרות רנ"א שליח (mRNA) באופן ספציפי לרצף כדי להביא את קומפלקס ההשתקה הקטליטי המושרה על ידי RNA (RISC) לאתר ה-mRNA, וכתוצאה מכך פירוק mRNA ו/או חסימה בתרגום חלבונים. MiRNAs הם קבוצה נפוצה ביותר של רנ"א שאינם מקודדים במערכות של בעלי חיים, ו-2,654 miRNAs בוגרים קיימים בגנום האנושי (miRBase release 22.1)5. MiRNAs בדרך כלל מקשרים עם השלמה לא שלמה למטרות ה-mRNA שלהם4. לכן, miRNA יחיד יכול לווסת עשרות למאות מטרות mRNA נפרדות ולהשפיע באופן פונקציונלי על מגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. כדי להוסיף למורכבות של מנגנונים מבוססי miRNA, mRNA יחיד יכול להיות מווסת על ידי miRNA מרובים ומובחנים. לפיכך, קשה לחקור כיצד חוסר ויסות miRNA משבש את האיזון ההומאוסטטי של הגוף ומוביל לממאירות אנושית.

רוב המחקרים שפורסמו התמקדו ב-miRNA יחיד כאשר הם מאפיינים את תפקידם באירועי מחלה. עם זאת, כ-30% מגני ה-miRNA האנושיים מאורגנים ביחידות מקובצות באשכולות (בדרך כלל כ-10 קילו-בייסים [kb]) שלעתים קרובות מתועתקות באותו כיוון ומבוטאות במשותף, מה שמצביע על מערכת מתואמת ומורכבת של תקנת RNAלא מקודדת 6. צביר ה-miRNA האנושי הפוליציסטרוני הגדול ביותר הוא צביר 14q32 הכולל מבשרי miRNA של 54 miRNA. אחת מיחידות ה-miRNA המקובציות הנחקרות ביותר הקשורות לסרטן אנושי היא הצביר הפוליציסטרוני miR-17-92 המורכב מ-miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ו-miR-92-1 השוכנים בתוך אינטרון 3 של ה-RNA הלא מקודד, c13orf25. אשכול miR-17-92 מוגבר לעתים קרובות בממאירות המטופויאטית ומתבטא יתר בגידולים מוצקים וביסס תפקידים אונקוגניים בקידום התקדמות מחזור התא, אפופטוזיס ואנגיוגנזה7. בנוסף, אשכול miR-15a ו-miR-16-1 הנמצא בתוך האינטרון של הגן הלא מקודד Leu2 נמחק לעתים קרובות בלוקמיה ומופחת בוויסות במגוון רחב של סוגי סרטן, ומתפקד כדי לחסום את צמיחת הגידול על ידי התמקדות בגן האנטי-אפופטוטי BCL2 ובגנים נוספים של התקדמות מחזור התא8. אשכול miR-888 מוגבר בחולים עם סרטן ערמונית בדרגה גבוהה ומורכב משבעה גנים miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ו--891a) הממוקמים על כרומוזום אנושי Xq27.3 9,10.

אשכול miR-888 ממפה בתוך לוקוס HPCX1 (סרטן ערמונית תורשתי, X-linked 1) המשתרע על Xq27-2, אשר זוהה על ידי ניתוח הצמדה של אילן יוחסין משפחתי תורשתי של סרטן הערמונית 11,12,13,14,15,29. אפיון פונקציונלי של חברים בודדים באשכולות miR-888 באמצעות כלי ביטוי שגוי קונבנציונליים של miRNA - חיקויים של miRNA ומעכבי אנטיסנס - הצביע על כך ש-miRNA אלה ממלאים תפקידים חופפים בוויסות צמיחת גידול הערמונית ופלישהל-9,10. עם זאת, שיטות ניסיוניות אלה אינן מתאימות בקלות לחקר האופן שבו חברים מקובצים מרובים של miR-888 פועלים בסינרגיה או באופן אנטגוניסטי ברשת RNA שאינה מקודדת כדי לשלוט בהומאוסטזיס של רקמות ובהתקדמות הסרטן. פרוטוקול יעיל זה המתואר באמצעות טכנולוגיית עריכת גנים CRISPR בתפוקה גבוהה משתנה כדי לנתח מולקולרית אשכולות miRNA הקשורים לסוגי סרטן אנושיים (למשל, אשכול miR-888) כדי לגשר על פער הידע הזה.

גנים של קריספר חיידקי וקריספר (cas) מתווכים חסינות אדפטיבית נגד בקטריופאג'ים16. הגילוי של מערכת מעקב פרוקריוטית עתיקה זו הותאם במהירות ככלי מדעי יעיל כדי למקד בקלות כל לוקוס גנומי רצוי ולבצע שינויים ברצף הדנ"א במגוון רחב של מערכות בעלי חיים וסוגי תאים הן במבחנה והן ב- in vivo16,17. טכניקה זו טומנת בחובה הבטחה גדולה כשיטה יעילה לחקור רשתות miRNA בהקשר של מחלות אנושיות. לשם כך, פרוטוקול עריכת גנים זה של CRISPR בתפוקה גבוהה לחקר אשכול miR-888 המשתרע על פני כ-35 קילו-בייט על כרומוזום X אנושי בקווי תאים אנושיים מונצחים של סרטן הערמונית (LNCaP, PC3-ML) בנוי כדי לחקור כיצד חברי אשכול מתאמים את מסלולי התקדמות הסרטן. ניתן ליישם גישה זו לאפיון כל צביר miRNA ומאפשרת לחוקרים ליצור במהירות קווי תאים אנושיים הנושאים את כל מחיקת אשכול ה-miRNA ואת המחיקות של צבירי גנים בודדים ומשולבים של miRNA בניסוי יחיד.

בהליך זה, קווי תאים יציבים נוצרים הנושאים מערכת ביטוי לנטי-ויראלית בלתי ניתנת להשראה של דוקסיציקלין (DOX) המאפשרת לחוקר לשלוט בסטרפטוקוקוס פיוגנס קריספר הקשור לאנדונוקלאז Cas9 (csn1) באמצעות מקדם הגנים המכונן DOX-inducible TRE3G. מערכת Tet-On 3G bipartite כוללת גורם התארכות אנושי מכונן 1 אלפא (hEF1alpha) כדי להניע את השעתוק הן של הגן Tet-On 3G והן של הגן העמידות לבלצימידין (BlastR) כתעתיק דו-קריסטלוני. חלבון הטרנסאקטיבטור Tet-On 3G נקשר רק למקדם TRE3G בנוכחות DOX, וכתוצאה מכך נוצר שעתוק Cas9 חזק. בהיעדר DOX, אין ביטוי Cas9 בסיסי או מינימלי מאוד. לכן, החוקר יכול לגרום לייצור גבוה של חלבון Cas9 בתאים הגדלים במדיה בתוספת DOX במהלך שלבי עריכת הגנים של CRISPR ובקרה לפינוי מהיר של חלבוני CAS9 עם נסיגת DOX.

פרוטוקול זה מתאר גם את התכנון של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים של CRISPR RNA (crRNA) המכוונים לאזורים המכוונים לאזורים המקיפים את כל צביר ה-miRNA, אזורי סיכת שיער (premiRNA) בודדים של miRNA ו/או תת-קבוצות של גנים של miRNA בתוך הצביר. כל crRNA מתוכנן מכיל רצף מדריך ייחודי של 5'-terminal 20 nt (משלים לרצף הגנומי של עניין שיש להתמקד בו), ואחריו רצף חוזר אינווריאנטי של 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') המאפשר זיווג בסיסים עם האוליגונוקלאוטידים האוניברסליים של CRISPR RNA (tracrRNA) המפעילים טרנס-אקטיב18. יחד, ה-crRNA וה-tracrRNA המחושלים (יחס מעורב של 1:1) מתפקדים כרנ"א המנחה לפרוטוקול זה (איור 1A). בכל ניסוי, שני רנ"א מנחים סינתטיים מועברים לתאים המושרים על-ידי DOX כדי לקשר וללוות את חלבון ה-Cas9 החיידקי לאתרי הדנ"א הגנומיים (5' ו-3') המקיפים את אזור צביר ה-miRNA המיועד להסרה (איור 1B).

רצף מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) (5'-NGG-3' עבור סוג פראי S. pyogenes Cas9) חייב להיות נוכח בגנום התא וממוקם מיד בסמוך לרצף הדנ"א של 20 nt המיועד על ידי ה-RNA המנחה17. רצף ה-PAM משמש כאות מקשר וממקם את האזור הקטליטי של האנזים אנדונוקלאז Cas9 באתר הדנ"א הגנומי הממוקד, מה שמוביל לאחר מכן לביקוע דנ"א מכוון ודו-גדילי (ds) הממוקם כ-3 nt במעלה הזרם של ה-PAM. מנגנון תיקון הדנ"א של התא מתקן את קצוות הדנ"א המנוקבים, מה שעלול לגרום לקשירת קשר מושלמת, אך לעתים קרובות מתרחשת הצטרפות סוף לא הומולוגית (NHEJ), מה שגורם להכנסות קטנות או מחיקות (אינדלים) באתר התיקון. מאחר ש-miRNAs הם גנים שאינם מקודדים הממוקמים לעתים קרובות באזורים אינטרגניים ואינטרוניים, האינדלים האלה נושאים סיכון נמוך ליצירת מוטציות לא רצויות של שטויות/מיסנס.

על ידי שימוש בקידוד RNA OLIgonucleotides סינתטיים (crRNA ו-tracrRNA מחושלים, יחס טוחן של 1:1) עבור קומפלקס הרנ"א המנחה בניסויים אלה, אסטרטגיית נוקאאוט גנים זו נמנעת מתת-תקצוב וקטור DNA גוזל זמן רב ומאפשרת גמישות עצומה בהעברת שילובי RNA מנחים ייחודיים לתאים בפורמט של 24 בארות. הכנת ליזטים של תאים גולמיים לסינון גנוטיפ PCR גם נמנעת משיטות טיהור דנ"א יקרות וגוזלות זמן רב, תוך שהיא מאפשרת יצירת קו יעיל של תאי מושבה בודדים וניתוח פנוטיפי יעיל. ואכן, פרוטוקול עריכת גנים זה של CRISPR בתפוקה גבוהה שימש בהצלחה כדי לבצע טרנספקטציה של קווי תאי סרטן ערמונית בתרבית (LNCaP, PC3-ML) עם 32 שילובי RNA מנחים ייחודיים בניסוי יחיד וליצור קווי נוקאאוט הנושאים מחיקות עבור כל אזור האשכול miR-888 של ~35 kb; צירופי מחיקה קטנים יותר עבור חברי אשכול miR-888 השייכים למשפחות miR-743 ו-miR-891a; כמו גם מחיקות עבור חברי miRNA בודדים בתוך אשכול miR-888. מחקרים כאלה יספקו הדגשה ברורה יותר של האופן שבו miRNA מקובצים מתפקדים בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות והעמידות לתרופות לפני תרגום miRNA למרפאה ככלים טיפוליים ואבחוןיים.

Protocol

1. הכנה לעריכת גנים של CRISPR ותכנון RNA מנחה ליצירת קווי תאים נוקאאוטים של צבירי miRNA

  1. צור קובץ דנ"א המכיל את הרצף הגנומי המלא של אזור העניין של צביר miRNA (אינטרגני, אינטרוני) ולפחות 1 kB של אזורים גנומיים מסביב באמצעות תוכנת ביאור רצף DNA19.
    1. השתמש בכלי לעריכת תכונות בקובץ הדנ"א שנוצר כדי לסמן את לוקוס צביר miRNA ממוקד (אינטרגני, אינטרוני) ואת כל רצף סיכות השיער של miRNA השייך לאשכול ה-miRNA, וכן לציין גנים אחרים של קידוד וקידוד ו/או תכונות רגולטוריות סמוכות אחרות 5,20,21,22.
    2. ודא שאזורי ה-miRNA המיועדים למחיקה אינם משבשים בשוגג גנים סמוכים המקודדים חלבונים, גנים שאינם מקודדים או רכיבי דנ"א רגולטוריים חשובים.
      הערה: שקול את הסיבוכיות הגנומית (למשל, כפילויות/היתוך של כרומוזומים) של קו התאים המשמש בפרוטוקול זה.
  2. תכנון crRNA סינתטיים המכוונים ל-20 nt של רצף דנ"א גנומי המקיף את כל אשכול ה-miRNA, אזורים בודדים של סיכות שיער miRNA (pre-miRNA) ו/או תת-קבוצות של גנים miRNA בתוך הצביר באמצעות כלי תוכנה לתכנון RNA מנחה ביואינפורמטי (לדוגמה,23). ודא שהאנזים Cas9 המתאים מצוין בכלי תכנון הרנ"א המנחה (כלומר, S. pyogenes קאס9).
    הערה: ה-crRNA המסונתז יכיל את רצף המדריך הייחודי הזה של 5'-טרמינל 20 nt (משלים למטרת דנ"א) ואחריו אינווריאנטי 22 nt S. pyogenes חזור על רצף כדי לאפשר זיווג בסיסים עם ה- tracrRNA האוניברסלי המסונתז oligonucleotide. יחד, הם יתפקדו כרנ"א המנחה בפרוטוקול זה.
    1. בהתייחס לקובץ הדנ"א שנוצר (שלב 1.1.), הזן כ-150 nt של רצף דנ"א השוכן במעלה הזרם (5') או במורד הזרם (3') של סיכת השיער/לוקוס האשכול miRNA המיועד למחיקה לכלי התוכנה לתכנון RNA מדריך ביואינפורמטי23.
      הערה: כלי התכנון יזהה רצפים ייחודיים של 20 nt עבור תכנון crRNA oligonucleotide השוכנים בצמוד לרצף PAM (על גדיל הדנ"א הלא ממוקד) (לדוגמה, S. pyogenes Cas9 PAM sequence NGG). להלן דוגמה לתכנון crRNA המכוון לאתר במעלה הזרם (5') של לוקוס הגן mir-891a (במיוחד 5A(891a) הנדון בסעיף התוצאות המייצגות ובטבלה 1).
      1. פתח את המדריך RNA עיצוב תוכנה כלי23.
      2. הזן את השם 5A(891a) בחלון Enter Name .
      3. בחלון Enter a DNA sequence , הזן 150 nt של רצף גנומי השוכן מיד במעלה הזרם (5') של הגן המבשר mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. סמן את התיבה המסומנת אפשר ספציפיות בדוק כדי לא לכלול אתרים מחוץ למיקוד שזוהו באופן חישובי על-ידי התוכנית. בחר את האורגניזם המתאים (כלומר, האדם [הומו ספיינס]).
      5. ציין את האנזים הנכון Cas9 PAM המשמש למחקרים, במקרה זה, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, כדי ליצור את הגדרות ברירת המחדל הבאות: PAM ביחס למטרה: אחרי; רצף חוזר: GUUUUAGAGCUAUGCUCUGUUUUG; יחסית למדריך: 3; אורך רצף היעד: 20; חיתוך ביחס ליעד 5' התחלה: חוש 17 אנטי-חוש 17.
      6. לחץ על הבא כפתור כדי להציג את התוצאות עבור סינתזת crRNA סינתטי.
        הערה: בדוגמה זו, ה-crRNA המוצע לסינתזה יזהה את מטרת הדנ"א ATACATGCTGATAGTTACAC וימוקם בצמוד ל-PAM:AGG.
    2. התייחס לקובץ הדנ"א (שנוצר בשלב 1.1.) כדי לקבוע את רצפי המטרה הטובים ביותר של crRNA 20 nt הנמצאים הכי קרוב למוקד ה-miRNA להימחק ובעלי הספציפיות הגבוהה ביותר עבור המטרה הגנומית המיועדת.
      1. השתמש בכלי ניתוח חישוביים מחוץ למיקוד כדי להעריך את הספציפיות של ה-crRNA המועמד ולחזות אתרים פוטנציאליים מחוץ למיקוד בלוקים גנומיים שאינם קשורים לאזור העניין של אשכול miRNA ממוקד (לדוגמה, 24,25,26,27).
      2. תעד תוצאות פוטנציאליות מחוץ למיקוד לצורך ייחוס מאוחר יותר בעת גנוטיפ של קווי תאים תלתוניים של CRISPR של מושבה אחת על ידי PCR (שלב 4.2.6.).
        הערה: מידת ההשלמה של הרצף המשותפת בין ה-crRNA אוליגונוקלאוטיד המתוכנן לבין רצף המטרה הגנומית תכתיב עד כמה האנזים Cas9 מבקע את הגנום באופן סלקטיבי באותו מוקד. מאחר שהרנ"א המנחה מתקרב למטרה הגנומית בכיוון של 3' עד 5', אי-התאמות בקצה ה-5' של רצף המטרה של הדנ"א (8-10 הבסיסים הראשונים) יחסמו לעתים קרובות את המחשוף בתיווך Cas9. אם רצף המטרה הגנומית חולק הומולוגיה עם לוקוס גנומי אחר, למעט בתוך שמונת הבסיסים הראשונים של רצף הדנ"א, רנ"א מנחה זה צפוי להיות בעל סיכוי נמוך לצאת מההתמקדות באתר זה.
      3. תכנן ארבעה crRNA ייחודיים עבור כל מוקד miRNA ממוקד: שני crRNA מתוכננים כדי להתמקד ברצפי דנ"א משלימים באופן מיידי 5' של סיכת השיער/אשכול miRNA (5'A, 5'B) ושני crRNA מתוכננים כדי לכוון לרצפי דנ"א משלימים באופן מיידי 3' של סיכת השיער/אשכול miRNA (3'A, 3'B).
        הערה: בעת ביצוע טרנספקציות הקריספר (בסעיף 3), ייבדקו ארבעה צירופי זוגות RNA מנחים אפשריים של 5' ו-3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) עבור כל לוקוס miRNA ממוקד כדי להגדיל את ההסתברות ליצירת מחיקות מוצלחות של לוקוס miRNA בניסוי יחיד.
      4. השתמש בכלי לעריכת תכונות בקובץ הדנ"א שנוצר (שלב 1.1.) כדי לסמן את רצף המטרה של הדנ"א (עם PAM סמוך) עבור כל crRNA מתוכנן להיות מסונתז.
  3. תכנן ותסנתז פריימרים PCR (קדימה, אחורה) לצד אזורי אשכול miRNA ממוקדים לצורך גנוטיפ של קווי תאי קריספר (ותייג את הפריימרים בקובץ הדנ"א שנוצר).
    1. עבור קווי תאים גנוטיפיים הנושאים מחיקות גנומיות קטנות עבור miRNAs מקובצים היטב או בודדים, תכנן פריימרים PCR (קדימה, אחורה) השוכנים בערך 150 bp בכל צד של אתר המחשוף Cas9 / אזור נוקאאוט שיאפשרו זיהוי הן של מקטעי הדנ"א של הסוג הפראי (~600 bp) והן של נוקאאוט (~300 bp) בתגובת PCR אחת באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.
    2. עבור גנוטיפ של קווי תאים הנושאים מחיקות גנומיות גדולות עבור שילובי מבשרי miRNA או עבור כל צביר ה-miRNA, תכננו שוב פריימרים של PCR (קדימה, אחורה) השוכנים כ-150 bp בכל צד של אתר המחשוף/נוקאאוט Cas9. שים לב שאם מחיקת אשכול ה-miRNA הממוקד משתרעת על פני >4 קילו-באורך, סביר להניח שתגובת ה-PCR תזהה רק את מקטע הדנ"א הקטן יותר (כ-300 bp) אך לא את מקטע ה-DNA של wildtype. לכן, תכנן פריימרים נוספים של PCR (קדימה, אחורה) שיכולים לזהות נוכחות או היעדרות של גנים פנימיים של צבירי miRNA כדי לסייע בתהליך ההקרנה ולאמת עבור קווי תאי נוקאאוט הומוזיגוטיים.

2. יצירת קווי תאים לנטי-ויראליים יציבים הנושאים את קלטת הביטוי Cas9 הניתנת להשראה של DOX

הערה: בצע את כל עבודות תרביות התאים והווירוסים במכסה מנוע בטיחות ביולוגית מוסמך באמצעות נהלי BSL2 וטכניקה אספטית.

  1. קבע את סוג קו התא המתאים למחקרי הקריספר ולמדיית הגדילה המועדפת.
    הערה: פרוטוקול זה פותח עבור קווי תאי סרטן הערמונית האנושיים LNCaP (המדיום המועדף: RPMI, 10% סרום בקר עוברי [FBS]) ו- PC3-ML (המדיום המועדף: DMEM, 10% FBS).
  2. בצע עקומת "מוות" של בלסטיקידין כדי לקבוע את ריכוז התרופה האופטימלי לבחירה עבור תאים נגועים בנגיף הלנטי הנושאים את קלטת הגנים לעמידות לבלצימידין (שלב 2.3.).
    1. תאי צלחת לתוך 11 בארות של צלחת 24 בארות וגדלים ב 37 °C (77 °C), 5% CO2 במדיום המועדף עד כ 75% מפגש.
    2. דיללו את הבלסטיקידין (מלאי עבודה של 1 מ"ג/מ"ל) בתווך המועדף עם ריכוז סופי הנע בין 0, 1 ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ומדולל במרווחים של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. סמן את הבארות של צלחת 24 הבארות שנזרעה מ-1 עד 11. הסר את מדיום הגדילה מהבארות והחלף בריכוזי הבלסטיקידין המתאימים.
    4. שנה את המדיום עם ריכוזי הבלסטיקידין המתאימים כל יומיים למשך 7-10 ימים.
    5. בחנו את התאים מדי יום במהלך מהלך הזמן וקבעו את ריכוז הבלסטיקידין המינימלי הנדרש כדי להרוג את כל התאים תוך 5-7 ימים.
      הערה: יהיה צורך לבצע עקומת "הריגה" של בלסטיקידין עבור כל קו תאים ספציפי המשמש לניסויים בעריכת גנים של CRISPR.
  3. הדביקו את התאים בנגיף לנטי הנושא את קלטת הביטוי Cas9 הניתנת להשראה של DOX ובצעו בחירת בלסטיקידן באמצעות הריכוז האופטימלי שנקבע בשלב 2.2.
    1. בשלוש בארות של צלחת של 6 בארות, זרע 5 × 104 תאים לכל באר וגדל במדיום המועדף ב 37 °C (64 °F), 5% CO2 לילה (ON).
    2. למחרת, להפשיר את וקטור הביטוי lentivirus עבור Cas9 (Lenti-iCas9) הניתן להשראה של DOX על קרח. מערבבים בעדינות (אין לערבב חלקיקי וירוס מערבולת).
      הערה: אחסנו את נגיף הלנטי ב-aliquots בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הקפאה/הפשרה מרובים, אשר יפחיתו את הטיטרים הנגיפיים ואת יעילות הזיהום.
    3. חשב את הנפח הדרוש כדי להתמר 5 × 104 תאים עם וירוס בריבוי של זיהום של 0.3 (MOI = 0.3) בהתבסס על ריכוז הטיטר הנגיפי.
    4. פיזרו את נפח הנגיף המתאים ל-250 מיקרול"ל (לכל באר) של מדיום מועדף ללא סרום וללא אנטיביוטיקה בתוספת 0.8 מיקרוגרם/מ"ל הקסדימתרין ברומיד. מערבבים בעדינות.
      הערה: הקסדימתרין ברומיד הוא פולימר קטיוני שנמצא כמגביר את ספיגת הנגיף ואת יעילות הזיהום.
    5. הסר את המדיום. הוסף את 250 μL של מדיום התמרה מוכן עם וירוס Lenti-iCas9 (MOI = 0.3) לתאים ודגירה ON ב 37 °C, 5% CO2. (קצר את זמן הדגירה ל-4-6 שעות אם התאים מפגינים השפעות רעילות הקשורות לנגיף.)
    6. החלף את המדיום במדיום מועדף טרי ואפשר לתאים להתאושש במשך 1-2 ימים.
    7. בצע את בחירת הבלסטיקידינים על התאים הנגועים במשך 10-14 יום באמצעות ריכוז הבלסטיקידינים האופטימלי הנגזר מעקומת ה"הרג" המתוארת בשלב 2.2.
      1. במקביל, לגדל את התאים הלא נגועים במדיום עם ריכוז בלסטיצידין אופטימלי שישמש כבקרה חיובית לבחירה הנגיפית.
    8. שנה את המדיום בתוספת ריכוז הבלסטיצידין האופטימלי כל 3 ימים במהלך מסלול זמן הבחירה כדי להסיר תאים מתים.
      הערה: רק תאים ששורדים את בחירת הבלסטיקידין ישלבו את הווקטור הלנטי-ויראלי.
    9. הרחב את קווי התאים Lenti-iCas9 שנבחרו על-ידי בלסטיקידין.
      הערה: הקלט את מספר המעבר הסלולרי בכל הרחבה.
      1. הקפיאו חלק מתאי Lenti-iCas9 במדיום מועדף בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לאחסון קריוביאלי לטווח ארוך.
      2. נתחו חלק מתאי Lenti-iCas9 על ידי כתםמערבי 9 כדי לזהות את קו התאים המציג את רמות החלבון Cas9 החזקות ביותר הניתנות להשראה של DOX (ראו שלב 2.3)."
  4. בצע עקומת ריכוז דוקסיציקלין על קווי תאים חדשים של Lenti-iCas9 כדי לקבוע את התנאים האופטימליים להשראת חלבון Cas9.
    1. הגדר ארבע צלחות עצמאיות בעלות 6 בארות עבור כל קו תאים שנבדק כדי לבצע קורס זמן זה של ריכוז DOX. צלחת 5 × 104 תאים לכל באר של כל צלחת 6 בארות ולגדול ב 37 °C (84 °F), 5% CO2 במדיום המועדף במשך 24 שעות.
    2. דילול DOX (מלאי עבודה של 1 מ"ג/מ"ל) במדיום המועדף עם עקומת ריכוז DOX סופית הנעה בין 0, 50, 100, 150, 250 עד 500 ננוגרם/מ"ל.
    3. סמן את הבארות של כל צלחת 6 בארות שנזרעה מ-1 עד 6. הסר את המדיום והחלף בריכוזי DOX המתאימים. הגדל לוחות 1-4 עד לנקודות הזמן הבאות: 24 שעות, 48 שעות ואינדוקציה DOX של 72 שעות; ו-120 שעות לאחר נסיגת DOX (בתחילה 72 שעות המושרה על ידי DOX).
    4. קוצרים את הבארות של הצלחת בכל נקודת זמן בשיטות מתאימות (למשל, טריפסיניזציה). אחסן את כדורי התא בטמפרטורה של -80 °C (80 °F). לעבד את כדורי התאים במאגר RIPA לבידוד ליזט ולניתוח כתמי מערבי Cas9.
      1. הפעילו 40 מיקרוגרם של ליזאט תאים עבור כל דגימה של קורס זמן האינדוקציה של DOX באמצעות ג'ל Bis-Tris של 4%-12% דה-טורינג והעבירו את החלבונים לקרום אימונובלוט.
      2. הכלאה של קרום האימונובלוט עם נוגדן ראשוני נגד Cas9 כדי לזהות את החלבון 160 kDa. נרמל את רמות Cas9 באמצעות גן משק בית כגון GAPDH (37 kDa).
    5. בהתבסס על תוצאות הכתם המערבי, קבעו את ריכוז ה-DOX האופטימלי כדי לגרום ל-Cas9 בקווי התאים של Lenti-iCas9.
      הערה: קורס זמן זה גם יחשוף עד כמה ביטוי Cas9 מווסת באופן הדוק עם הסרת DOX של 120 שעות לאחר מכן.
    6. הקימו מושבות חד-תאיות עבור קווי התאים Lenti-iCas9 המציגים ביטוי חזק של חלבון Cas9 כדי לייעל את טרנספקציות הקריספר (בסעיף 3).

3. ביצוע תגובות קריספר על ידי אינדוקציה Cas9 וטרנספקציה סינתטית של RNA מנחה של תאים באמצעות פורמט תפוקה גבוהה

הערה: דיאגרמת זרימת עבודה מוצגת באיור 1.

  1. על הנייר, מיפו את צירופי זוגות ה-crRNA שיועתקו לכל באר של לוחית בת 24 בארות המכוונת לכל צביר ה-miRNA, שילובי גנים שונים של miRNA מקובצים באשכולות, כמו גם חברי אשכולות miRNA בודדים.
    1. על המפה, סמן ארבע בארות לכל מוקד miRNA ממוקד. כל באר מייצגת תגובת טרנספקציה, כאשר שני crRNA ייחודיים ממוקמים 5' ו-3' של הלוקוס הגנומי הרצוי של miRNA וה-tracrRNA (יחס טוחנת של 1:1).
    2. ודא שכל אחת מארבע הבארות המסומנות מייצגת זוג crRNA ייחודי עבור טרנספקציה (לדוגמה, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      הערה: העיצוב של שני crRNA של 5' ושני crRNA של 3' הצדדים לכל לוקוס miRNA ממוקד (סעיף 1) מאפשר יצירת ארבעה זוגות RNA מנחים אפשריים של 5' ו-3' בתגובת הטרנספקציה.
  2. צלחת את קו התאים Lenti-iCas9 ב 5 x 104 תאים / באר של לוחית 24 בארות במדיום המועדף המכיל את ריכוז DOX הממוטב (נקבע בשלב 2.4.). לגדל את התאים במשך 24-48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לגרום לביטוי חלבון Cas9.
  3. תעבירו את תאי Lenti-iCas9 עם ה-RNA המנחים המוכנים של 5' ו-3'.
    1. שחזרו את ה-crRNA המסונתז ואת האוליגונוקלאוטידים של tracrRNA עם מים נטולי נוקלאז לריכוז מלאי של 10 μM. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך.
    2. סמן ארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לכל מוקד miRNA ממוקד בהתבסס על מפת הניסוי שתוכננה בשלב 3.1., המייצגת את ארבעת הצירופים האפשריים של זוגות crRNA 5' ו- 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. בכל צינור, ערבבו יחס טוחן של 1:1 של tracrRNA ו-crRNA ייחודי (5' ו-3') יחד כדי ליצור את קומפלקס ה-RNA המנחה של 2 μM באמצעות התגובה הבאה (נפח סופי של 10 μL):
      1. הוסף 2.5 μL של tracrRNA (מלאי 10 μM), 1.25 μL של 5' ממוקם crRNA (10 μM מלאי), 1.25 μL של 3' ממוקם crRNA (10 μM מלאי), ו 5 μL של 10 mM TRIS-HCL pH 7.5 לצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. Microcentrifuge במשך 30 שניות ב 16,000 × גרם לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
    4. לכל צינור, הוסיפו 40 μL של מדיום מופחת בסרום (למשל, Opti-MEM) ל-10 μL של תגובת קומפלקס RNA מנחה (נפח כולל של 50 μL). מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.
    5. בצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל, יש לערבב 2 μL של מגיב הטרנספקציה28 (ראה הערה 3.3.5.1.) ו-48 μL של מדיום סרום מופחת (לדוגמה, Opti-MEM, נפח סופי של 50 μL) בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה. דגירה ב- RT למשך 5 דקות.
      1. הכינו תערובת ראשית של ריאגנט הטרנספקציה על ידי הכפלת הריאגנט (2 μL) והפחתת מדיום הסרום (לדוגמה, Opti-MEM, 48 μL) בכמויות במספר הבארות שיש לבצע טרנספקט, בתוספת 10% נפח נוסף כדי להסביר אי דיוקים קלים בצנרת.
        הערה: בחר ריאגנט טרנספקציה המותאם לטרנספקציות קטנות של RNA וקריספר RNA אוליגונוקלאוטיד, כמו גם עבור סוג קו התא28.
    6. לכל צינור המכיל את 50 μL של תערובת RNA מנחה (משלב 3.3.4.), הוסף את 50 μL של מגיב הטרנספקציה המדולל (משלב 3.3.5.). מטפטפים את התערובת באיטיות למעלה ולמטה פעם אחת כדי לערבב. דגירה ב- RT למשך 20 דקות.
    7. הוסיפו 400 μL של מדיום ללא אנטיביוטיקה בתוספת DOX (ריכוז אופטימלי) לכל צינור המכיל את ה-100 μL של תערובת ה-RNA/טרנספקציה המנחה. פיפט בעדינות לערבוב.
  4. הסר את המדיום מתאי Lenti-iCas9 המושרים על ידי DOX (שלב 3.2.). הוסף 500 μL של מדיה / DOX / RNA מנחה / תערובת טרנספקציה המבוססת על מפת הניסוי של 24 לוחות בארות (שלב 3.1.). דגירה של התאים שעברו טרנספקציה במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  5. החליפו את המדיום במדיום המועדף הטרי ללא DOX (כדי לנקות את חלבון Cas9 מהתאים). אפשר לתאים להתאושש עוד 24-48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  6. קוצרים את התאים שעברו טרנספקציה (טריפסיניזציה) ומתכוננים לגנוטיפ ולדילולים של תאים בודדים.
    הערה: תאים מייצגים אוכלוסייה מעורבת המכילה תאים שעברו עריכה גנטית של קריספר שעברו עריכה גנטית ובלתי מתורגמים. שלב זה יקבע את היעילות של עריכת CRISPR לפני השקעת זמן/משאבים בהרחבת מושבה חד-תאית.
    1. שטפו את התאים פי 1 עם 1 מ"ל של מלח בעל מאגר פוספט (PBS). דגירה של התאים ב-100 μL של טריפסין למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 והעבירה את התאים לצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מדיום.
    2. הפוך כדי לערבב ומיקרוצנטריפוזיה של התאים במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את המדיום ובצע החייאה של גלולת התא ב-1 מ"ל של PBS.
    3. Microcentrifuge את התאים שטופים במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 20 מעלות צלזיוס. הסר את ה- PBS ובצע החייאה של גלולת התא ב- 150 μL של המדיום המועדף.
  7. קבע את מספר התא למיקרוליטר של 150 μL של תאים שעברו החייאה באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים אוטומטי.
  8. הפרד את 150 μL של תאים מוחזרים לשלושה חלקים.
    1. הקפא 1/3 של תאים שעברו טרנספקציה (50 μL) במדיום בתוספת 10% DMSO (נפח סופי של 150 μL) בקריוביאלים להרחבה עתידית/אחסון לטווח ארוך.
    2. העבר 1/3 של תאים שעברו טרנספקציה (50 μL) לתוך צינור PCR נקי של 0.2 מ"ל לגנוטיפ.
      1. Microcentrifuge את התאים במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 4 °C (84 °F) ולהסיר את המדיום.
      2. החייאת גלולת התא ב-100 μL של PBS.
      3. Microcentrifuge את התאים במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 4 °C ולהסיר את PBS. אחסן כדורי תאים בעלי אוכלוסייה מעורבת לטווח ארוך בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      4. לעבד את גלולת התא לצורך גנוטיפ באמצעות זרימת העבודה בסעיף 4.
    3. הכינו את ה-1/3 הסופי של התאים (50 μL) לדילול וציפוי בתבנית של צלחת של 96 בארות כדי ליצור מושבות חד-תאיות.
      1. בהתבסס על ספירת התאים בשלב 3.7., חשב את הדילולים הנדרשים כדי להשיג 10, 5, 2 ו-1 תאים ב-100 μL של בינוני לכל באר של לוח של 96 בארות.
      2. באמצעות שימוש ב-12 ערוצים רב-צינוריים ובמאגר ריאגנטים סטרילי, הוסיפו 100 μL של תאים מדוללים לכל באר לשתי שורות של הלוח (24 בארות בסך הכל) עבור כל דילול (10, 5, 2 או 1 תאים לכל באר). אפשרו 4-6 שבועות עד שהתאים יגדלו למפגש להרחבת המושבה החד-תאית. התבוננו בתאים מדי שבוע תחת מיקרוסקופ אור ושימו לב אם המושבות מייצגות מושבות חד-תאיות או מרובות תאים.
      3. אסוף כ-10-15 מושבות חד-תאיות לצורך גנוטיפ (סעיף 4). זהה לפחות שלושה קווי מושבה חד-תאיים בלתי תלויים, נוקאאוטים, עבור כל מוקד miRNA ממוקד. שמור על קווים חד-תאיים מסוג פראי כפקדים.
        הערה: מספר ההקרנה יהיה תלוי בסוג קו התא ובהשפעה של פנוטיפ הנוקאאוט miRNA על גדילת/כדאיות התא.

4. גנוטיפ PCR של קווי תאי קריספר באמצעות ליזטים של תאים גולמיים

  1. קציר מושבות בודדות, חד-תאיות, מבארות קרובות למפגש של צלחת בת 96 בארות.
    הערה: ניתן לבצע באופן ידני הסרה של מדיום/PBS המתואר בשלבים אלה באמצעות שאיפת ואקום בארון הבטיחות הביולוגית, אך יש להיזהר כדי למנוע זיהום צולב. השתמש בקצה פיפטמן "צהוב" "צהוב" חדש של 200 μL עבור כל באר של צלחת 96 הבאר בעת השאיפה, שבה כל קצה צהוב מוחלף ממוקם היטב בקצה פיפטה מרעה זכוכית סטרילית המחוברת לשאפת הוואקום.
    1. שטפו את הבארות 1x עם 100 μL של PBS. שאפו ל-PBS.
    2. הוסף 50 μL של טריפסין ודגירה למשך 2-5 דקות ב 37 °C (64 °F), 5% CO2.
    3. מקטרים בעדינות למעלה ולמטה ומעבירים את התאים המוחזרים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מדיום.
    4. הפוך כדי לערבב ולהעיף בעדינות את התאים במיקרו-צנטריפוג' למשך 5 דקות ב-200 × גרם ב-20 מעלות צלזיוס.
    5. הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של PBS. סובבו בעדינות את הצינור כדי לשבש את הכדור והתהפכו מספר פעמים כדי לערבב.
    6. Microcentrifuge במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 20 °C (76 °F) כדי לזרוק את התאים.
    7. הסר את ה- PBS והחייא את הכדור ב- 300 μL של PBS טרי.
    8. פצל את דגימת ה-300 μL לשני חלקים.
      1. מעבירים 200 μL של התאים (2/3 מהכדור) לבאר של לוחית של 24 בארות המכילה 1 מ"ל מהמדיום המועדף. לאחר אימות הגנוטיפ, השתמש בתאים אלה כדי להרחיב את קווי תאי הנוקאאוט בתיווך קריספר לצורך ניתוח פונקציונלי.
      2. מעבירים 100 μL של התאים (1/3 מהכדור) לצינור PCR של 0.2 מ"ל. Microcentrifuge במשך 5 דקות ב 3,000 x g ב 4 °C (64 °F). הסר את ה- PBS. אחסן את הכדור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. הכינו ליזטים של תאים גולמיים לגנוטיפ ולניתוח רצפים באמצעות פריימרים PCR שתוכננו בשלב 1.3. כלול את ה-lysates של התאים שהוכנו מתאים לא מתורגמים בניסויים אלה כדי להשתמש בהם כבקרות חיוביות מסוג פראי.
    1. בצעו החייאה של גלולת התא ב-4 מיקרול"ל של מאגר פולימראז 5x DNA (ראו טבלת החומרים, ריכוז סופי 1x), 1 μL של פרוטאינאז K (מלאי של 20 ננוגרם/מ"ל), 1 μL של RNase A (מלאי של 10 ננוגרם/מ"ל) ומים נטולי נוקלאז עד לנפח כולל של 20 μL.
    2. שוכב את התאים בתרמוציפלר באמצעות תוכנית PCR: 56 °C (56 ° C) למשך 30 דקות ו- 96 ° C למשך 5 דקות. אחסנו את התאים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    3. בצעו תגובת PCR באמצעות פריימרים מתוכננים של PCR (קדימה, אחורה) שמקיפים את אתרי ה-RNA המכוונים RNA 5' ו-3' (טבלה 1).
      הערה: מאגר ה-DNA פולימראז ותנאי התרמוציקלר יהיו תלויים באנזים הפולימראז Taq DNA המשמש לתגובת ה-PCR. פרוטוקול זה הותאם עבור Phusion HF DNA פולימראז.
      1. הגדר את תערובת תגובת ה-PCR על קרח: 5 μL של מאגר פולימראז DNA 5x, 0.5 μL של פריימר PCR קדמי (מלאי של 10 μM), 0.5 μL של פריימר PCR הפוך (מלאי 10 μM), 0.5 μL של 10 mM dNTPs, 0.25 μL של DNA פולימראז, 1-4 μL של ליזאט תאים, ומים ללא נוקלאז עד לנפח כולל של 25 μL.
      2. הפעל את תגובת ה- PCR ב thermocycler באמצעות התוכנית: 98 ° C במשך 3 דקות, ו 35 מחזורים של 98 ° C עבור 10 s, 62 ° C עבור 15 s, 72 ° C עבור 15 s, ולאחר מכן 72 ° C עבור 10 דקות. החזק במשך 4 מעלות צלזיוס. ראה הערה 4.2.3. מעל.
    4. טען את מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז 1% לניתוח אלקטרופורזה.
    5. חילוץ דנ"א מקטעי ה-PCR המבודדים בגודל המולקולרי החזוי עבור הגנוטיפים של הנוקאאוט (והסוג הפראי). הכינו את הדגימות לריצוף דנ"א.
    6. אמתו שתגובת הקריספר הצליחה ובצעו ריצוף דנ"א של מקטעי ה-PCR המבודדים כדי לזהות את אתר הבקיעה של Cas9 ולאשר את מחיקת ה-miRNA locus.
      1. בודדו לפחות שלושה קווי תאי נוקאאוט עצמאיים עבור כל לוקוס miRNA שמכוון על ידי קריספר. שמור על קווי תאים מסוג בר (והטרוזיגוס) שישמשו כבקרה במחקרים פונקציונליים במורד הזרם.
      2. בצע ניתוח qRT-PCR או כתם צפוני כדי לאשר שקווי תאי הנוקאאוט אינם מבטאים miRNA בוגר עבור הלוקוס שנמחק.
        הערה: ריצוף גנום שלם (WGS) הוא השיטה הסופית ביותר לאימות עריכת גנים של CRISPR ו-off-targeting.
      3. בדיקת השפעות מחוץ למיקוד קריספר על ידי PCR, שנחזו באופן חישובי (שלב 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. אם סריקה נרחבת של מושבה חד-תאית גורמת רק לגנוטיפים הטרוזיגוטיים, חזור על טרנספקציית הרנ"א המנחה בקווים ההטרוזיגוסיים החד-תאיים.
        הערה: חוסר יכולת להשיג קווי תאי נוקאאוט הומוזיגוטיים יכול להצביע על השפעות קטלניות עקב אובדן miRNA או סיבוכיות גנומית מובנית (למשל, כפילויות/היתוך כרומוזומים) של קו התא ההורי הדורשים ניתוח נוסף.

תוצאות

פרוטוקול מחיקת קריספר בתפוקה גבוהה זה הופעל בהצלחה באמצעות טרנספקציה של קווי תאי סרטן אנושיים מסוג LNCaP ו-PC3-ML הניתנים להשראה של Cas9 עם רנ"א מנחי אוליגונוקלאוטידים סינתטיים המכוונים לאשכול miR-888, שנחקרו בהקשר של סרטן הערמונית. אשכול miR-888 זוהה בתחילה בבדיקת פרופיל ביטוי כגבוהה בחולי סרטן הערמו...

Discussion

הליך עריכת גנים זה של קריספר מאפשר לחוקר ליצור במהירות פאנל שלם של קווי תאים הנושאים שילובים ייחודיים של מחיקת אשכולות miRNA. הטרנספקציה של רנ"א מנחים סינתטיים המורכבים מ-crRNA גנומיים ספציפיים לאתר 5' ו-3' המחושלים ב-tracrRNA סינתטי (יחס טוחנות של 1:1) בפרוטוקול זה מונעת תת-קלונינג של וקטור פלסמיד הגו?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

קווי תאים PC3-ML סופקו בחביבות על ידי מארק סטרן (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל). ג'סטין טוקסי סייע בגנוטיפ PCR. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן ברידן אדמס, קרן מחקר תרגומית של ריאן, ומענק של מועצת המחקר לבריאות של חבר העמים הבריטי (CHRB-274-11-20) ל- AE-K.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubes, flat capFisher14-230-225Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge TubesSeal-Rite1615-5500Plasticware
24-well tissue culture plateCorning Costar 09761146Plasticware
5x Phusion HF BufferThermo ScientificF-518LPCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plateFisherFB012927Plasticware
96-well tissue culture plateFalcon08-772-2CPlasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonalAbCamab191468Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engineNational Center for Biotechnology InformationNAFreeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenesCalbiochemCAS 589205CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogenA50298Equipment; Cell counter
Cryogenic tubesThermo Scientific50001012Plasticware
Dharmacon CRISPR Design ToolHorizon Discovery Ltd.NAFreeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2Dharmacon, Inc.T-2002-02Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher BP231100Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10013CVTisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made SolutionSigma-AldrichD3072-1MLCRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designedDharmacon, Inc.U-002005-20CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		Dharmacon, Inc.crRNA-460XXXCRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mLDharmacon, Inc.VCAS11227CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewerEnsemblNAFreeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonalSanta Cruz Biotechnologysc25778Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction KitIBI ScientificIB47010Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certifiedGibco16000044Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromideMilliporeSigmaH9268CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF MembraneMilliporeSigmaIPFL10100Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking BufferLI-COR927-60001Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211Western blot reagent
MicrocentrifugeEppendorf 5425 RPlasticware
miRBase microRNA viewermiRBaseNAFreeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-wellInvitrogenNP0321BOXWestern blot reagent
Odyssey CLx Imaging SystemLI-CORCLxEquipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum MediumGibco31985062Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis SystemOwlD2-BPEquipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)Integrated DNA TechnologyNAPCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)Thermo ScientificF530SPCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10xMilliporeSigma20-188Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA gradeInvitrogen25530049PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)Thermo ScientificEN0531PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 MediumGibcoMT10041CVTisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene ViewerSnap GeneNAFreeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol redGibco12563029Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure AgaroseInvitrogen16500100Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal CyclerThermoFisher Scientific4375305Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis SystemInvitrogenEI0001Equipment; Protein gel electrophoresis system

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
  20. . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
  23. . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
  24. . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
  25. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  26. . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
  27. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  28. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  29. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  30. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

182Cas9miR 888

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved