マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

要約

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35 kbのユニークなmiRNAクラスターメンバー欠失の組み合わせを持つ遺伝子組み換え細胞株のパネルを迅速に生成できます。

要約

マイクロRNA(miRNA)は、がんおよび転移の重要な細胞調節因子(腫瘍抑制因子、発癌促進因子)として浮上してきた。ほとんどの発表された研究は、がんにおける小さなRNAの役割を特徴付ける際に、単一のmiRNAに焦点を当てています。しかし、ヒトmiRNA遺伝子の〜30%は、しばしば共発現されるクラスター化された単位で組織化されており、非コードRNA調節の複雑で協調的なシステムを示している。非コードの小型RNAをクリニックに翻訳する前に、クラスター化されたmiRNAネットワークが腫瘍の増殖、がんの攻撃性、および薬剤耐性を調節するためにどのように協調的に機能するかをより明確に過小評価する必要があります。

前立腺癌の文脈において、長さ約35,000 bpの遺伝子座内に位置する7つのmiRNA遺伝子のゲノムクラスターの発癌性役割を研究するために、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)媒介遺伝子編集手順の使用が採用されている。このアプローチのために、ヒト癌細胞株を、DOX含有培地中で48時間増殖させたドキシサイクリン(DOX)誘導性Cas9ヌクレアーゼ用のレンチウイルスベクターに感染させた。その後、細胞を合成トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)とゲノム部位特異的CRISPR RNA(crRNA)オリゴヌクレオチドとコンプレクテーションして同時トランスフェクトし、miRNAクラスター全体の欠失および個々のまたは組み合わせmiRNA遺伝子クラスター欠失を1回の実験で有するがん細胞株の迅速な生成を可能にした。

このハイスループット遺伝子編集システムの利点は、時間のかかるDNAベクターのサブクローニングを回避できること、24ウェルフォーマットで独自のガイドRNAの組み合わせで細胞をトランスフェクトする柔軟性、および粗細胞溶解物を使用した低コストのPCRジェノタイピングです。この合理化されたアプローチを用いた研究は、miRNAクラスターメンバー間の機能的冗長性および相乗的/拮抗的相互作用を明らかにすることを約束し、ヒト疾患に関与する複雑な小さなノンコーディングRNAネットワークを特徴付けるのに役立ち、将来の治療設計により良い情報を提供する。

概要

ヒト疾患におけるノンコーディングRNAの寄与を調査するには、より良い研究ツールが必要である。MiRNAの調節不全は、がん患者の組織および体液(血液、尿など)におけるこれらの小さなノンコーディングRNAの発現プロファイルと非がん、健常人、マイクロアレイ、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、および次世代ディープシーケンシング技術を採用した^1,2.最近の研究は、これらのmiRNAの大部分のサブセットを、腫瘍形成、疾患進行、および薬剤耐性を制御する腫瘍抑制因子、腫瘍原性因子、および転移因子として特徴付けている。miRNAの実験的過剰発現および/またはダウンレギュレーション/喪失は、これらの非コードRNAが調整する幅広い癌関連活性(増殖、アポトーシス、分化、クロマチンリモデリング、血管新生、上皮間葉(EMT)およびMET転移、代謝、および免疫応答)を反映して、細胞内で機能的および多面的結果をもたらす³。

MiRNAは、単一遺伝子としてコードされるか、またはゲノムクラスターに存在し、それらは核内で転写され、生物学的に成熟した、細胞質に局在する〜22ヌクレオチド(nt)miRNA種を生成する前に広範囲に処理される⁴。これらの小さなRNAは、転写後にその効果を発揮し、メッセンジャーRNA(mRNA)標的に配列特異的に結合する負の遺伝子調節因子として作用し、触媒RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)をmRNA部位にもたらし、mRNA分解および/またはタンパク質翻訳のブロックをもたらす。MiRNAは動物系において極めて豊富なクラスのノンコーディングRNAであり、ヒトゲノムには2,654個の成熟miRNAが存在する(miRBaseリリース22.1)⁵。MiRNAは通常、そのmRNA標的に対して不完全な相補性を有する⁴。したがって、単一のmiRNAは、数十から数百の異なるmRNA標的を調節し、広範囲の生物学的経路に機能的に影響を与えることができる。miRNAベースのメカニズムの複雑さを増すために、単一のmRNAを複数の別個のmiRNAによって調節することができる。したがって、miRNAの調節不全が身体の恒常性バランスをどのように破壊し、ヒトの悪性腫瘍につながるかを調べることは困難です。

発表された研究の大部分は、疾患事象におけるそれらの役割を特徴付ける際に、単一のmiRNAに焦点を当てている。しかし、ヒトmiRNA遺伝子の約30%はクラスター化された単位(典型的には約10キロ塩基[kb])で組織化されており、それらはしばしば同じ向きで転写され、共発現され、非コードRNA調節の配位した複雑な系を示す⁶。最大のポリシストロニックヒトmiRNAクラスターは、54個のmiRNA前駆体を含む14q32クラスターである。ヒト癌に関連する最もよく研究されたクラスター化されたmiRNAユニットの1つは、非コードRNA、c13orf25のイントロン3内に存在するmiR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、およびmiR-92-1からなるmiR-17-92ポリシストロニッククラスターである。miR-17-92クラスターは、造血悪性腫瘍において頻繁に増幅され、固形腫瘍において過剰発現し、細胞周期の進行、アポトーシス、および血管新生を促進する上で発癌性の役割を確立している⁷。さらに、非コード遺伝子Leu2のイントロン内に位置する腫瘍抑制性miR−15aおよびmiR−16−1クラスターは、白血病においてしばしば欠失し、広範囲の癌においてダウンレギュレートされ、抗アポトーシス遺伝子BCL2および追加の細胞周期進行遺伝子⁸を標的とすることによって腫瘍増殖を遮断するように機能する。miR-888クラスターは、高悪性度前立腺癌患者において上昇し、ヒト染色体Xq27.3 ^9,10に位置する7つのmiRNA遺伝子(miR-892c、-890、-888、-892a、-892b、-891b、および-^891a)からなる。

miR-888クラスターは、Xq27-2にまたがるHPCX1遺伝子座(遺伝性前立腺癌、X-linked 1)内にマップされ、これは遺伝性前立腺癌ファミリー血統11、12、¹³、^14、15、29の連鎖解析によって同定された。従来のmiRNAミス発現ツール(miRNA模倣物およびアンチセンス阻害剤)を用いた個々のmiR-888クラスター化メンバーの機能的特徴付けは、これらのmiRNAが前立腺腫瘍の成長および浸潤の調節において重複する役割を果たすことを示した^9,10。しかし、これらの実験方法は、複数のmiR-888クラスター化されたメンバーが、組織の恒常性および癌進行を制御するために、非コードRNAネットワークにおいて相乗的または拮抗的にどのように作用するかを研究するのに容易には役立たない。ハイスループットCRISPR遺伝子編集技術を用いたこの記載された合理化されたプロトコルは、この知識ギャップを埋めるためにヒト癌に関連するmiRNAクラスター(例えば、miR−888クラスター)を分子的に解剖するように改変される。

細菌CRISPRおよびCRISPR関連(cas)遺伝子は、バクテリオファージに対する適応免疫を媒介する¹⁶。この古代の原核生物監視システムの発見は、インビトロとインビボの両方で、任意の所望のゲノム遺伝子座を容易に標的にし、広範囲の動物系および細胞型内でDNA配列を変更するための効率的な科学的ツールとして迅速に適応された^16,17。この技術は、ヒトの疾患の文脈でmiRNAネットワークを調査する効果的な方法として大きな期待を寄せています。この目的のために、不死化ヒト前立腺癌細胞株(LNCaP、PC3-ML)におけるヒトX染色体上の〜35kbにまたがるmiR−888クラスターを研究するためのこのハイスループットCRISPR遺伝子編集プロトコルは、クラスターメンバーが癌進行経路をどのように調整するかを調査するために構築される。このアプローチは、任意のmiRNAクラスターの特性評価に適用することができ、研究者は、miRNAクラスター全体の欠失および個々のおよび組み合わせmiRNA遺伝子クラスター欠失を有するヒト細胞株を単一の実験内で迅速に生成することができる。

この手順では、ドキシサイクリン(DOX)誘導性レンチウイルス発現系を保有する安定な細胞株が確立され、これにより、研究者は構成的DOX誘導性プロモーターTRE3Gを介してストレプトコッカス・ピオゲネスCRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9(csn1)遺伝子発現を制御することができます。Tet-On 3G二者構成系は、構成的ヒト伸長因子1アルファ(hEF1α)プロモーターを含み、Tet-On 3G遺伝子とブラストシジン耐性遺伝子(ブラスト^R)の両方の転写をバイシストロニック転写産物として駆動する。Tet-On 3Gトランスアクチベータータンパク質は、DOXの存在下でのみTRE3Gプロモーターに結合し、堅牢なCas9転写をもたらす。DOXがない場合、基底Cas9発現がないか、または非常に最小限である。したがって、研究者らは、CRISPR遺伝子編集ステップ中にDOXを添加した培地で増殖させた細胞において高いCas9タンパク質産生を誘導し、DOX離脱時の迅速なCAS9タンパク質クリアランスを制御することができる。

このプロトコルはまた、miRNAクラスター全体、個々のmiRNAヘアピン(premiRNA)領域、および/またはクラスター内のmiRNA遺伝子のサブセットに隣接する領域を標的とする合成CRISPR RNA(crRNA)オリゴヌクレオチドの設計についても記載しています。各設計されたcrRNAは、固有の5'末端20ntガイド配列(標的とする目的のゲノム配列に相補的)を含み、続いて、普遍的なトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)オリゴヌクレオチド¹⁸との塩基対形成を可能にする不変22nt S. pyogenes反復配列(5'-XXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3')を含む。アニーリングされたcrRNAとtracrRNA(混合1:1の比率)は一緒になって、このプロトコルのガイドRNAとして機能します(図1A)。各実験では、2つの合成ガイドRNAをDOX誘導細胞にトランスフェクトし、細菌Cas9タンパク質を、除去対象のmiRNAクラスター領域に隣接するゲノムDNA部位(5'および3')に会合およびエスコートします(図1B)。

プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列(野生型 S. pyogenes Cas9の場合は5'-NGG-3')が細胞ゲノム中に存在し、ガイド^RNA17によって標的とされる20nt DNA配列のすぐ隣に位置していなければならない。PAM配列は結合シグナルとして機能し、エンドヌクレアーゼCas9酵素の触媒領域を標的ゲノムDNA部位に配置し、続いてPAMの〜3nt上流に位置する指向性二本鎖(ds)DNA切断をもたらす。細胞のDNA修復機構は、切断されたDNA末端を修復し、完全なライゲーションをもたらすことができるが、しばしば非相同末端結合(NHEJ)が起こり、修復部位で小さな挿入または欠失(インデル)を引き起こす。miRNAは遺伝子間領域およびイントロニック領域内に位置することが多い非コード遺伝子であるため、これらのインデルは望ましくないナンセンス/ミスセンス変異を引き起こすリスクが低い。

これらの実験でガイドRNA複合体をコードする合成RNAオリゴヌクレオチド(アニーリングされたcrRNAとtracrRNA、1:1モル比)を採用することにより、この遺伝子ノックアウト戦略は、時間のかかるDNAベクターのサブクローニングを回避し、独自のガイドRNAの組み合わせを24ウェルフォーマットで細胞にトランスフェクトする際の大きな柔軟性を可能にします。PCR遺伝子型スクリーニング用の粗細胞溶解液の調製は、高価で時間のかかるDNA精製方法を回避し、合理化されたシングルコロニー細胞株の生成および表現型解析を可能にします。実際、このハイスループットCRISPR遺伝子編集プロトコルは、培養前立腺癌細胞株(LNCaP、PC3-ML)を32のユニークなガイドRNAの組み合わせで単一の実験でトランスフェクトし、〜35 kb miR-888クラスター領域全体に対して欠失を有するノックアウト株を生成するために首尾よく使用されてきました。miR-743およびmiR-891aファミリーに属するmiR-888クラスターメンバーに対するより小さな欠失の組み合わせ;miR-888クラスター内の個々のmiRNAメンバーの欠失も同様です。このような研究は、miRNAを治療および診断ツールとして診療所に翻訳する前に、クラスター化されたmiRNAが腫瘍増殖、攻撃性、および薬剤耐性を調節するためにどのように協調的に機能するかをより明確に過小評価するのに役立つでしょう。

プロトコル

1. CRISPR遺伝子編集の準備とmiRNAクラスターノックアウト細胞株作製のためのガイドRNA設計

1. DNA配列アノテーションソフトウェアプログラム¹⁹を用いて、目的のmiRNAクラスター領域(遺伝子間、イントロニック)および周囲のゲノム領域の少なくとも1 kBの完全なゲノム配列を含むDNAファイルを作成する。
   1. 作成したDNAファイルの特徴編集ツールを使用して、標的miRNAクラスター遺伝子座(遺伝子間、イントロニック)およびmiRNAクラスターに属する個々のmiRNAヘアピン配列をマークし、他の近くのコード遺伝子および非コード遺伝子および/または調節特徴^5,20,21,22を記します。
   2. 欠失の標的となるmiRNA領域が、近くのタンパク質コード遺伝子、非コード遺伝子、または重要な調節DNA要素を誤って破壊しないようにします。
      注:このプロトコルで使用される細胞株のゲノムの複雑さ(染色体の重複/融合など)を考慮してください。
2. バイオインフォマティックガイドRNA設計ソフトウェアツール(例えば、²³).適切なCas9酵素がガイドRNA設計ツールに記されていることを確認する(すなわち、 S. pyogenes Cas9)。
   注:合成されたcrRNAは、このユニークな5'末端20ntガイド配列(DNA標的に相補的)を含み、その後に不変の22ntが続く S. pyogenes 合成されたユニバーサルtracrRNAオリゴヌクレオチドとの塩基対形成を可能にする反復配列。一緒にアニーリングされ、それらはこのプロトコールにおけるガイドRNAとして機能するであろう。
   1. 作成したDNAファイルを参照し(ステップ1.1)、欠失対象となるmiRNAヘアピン/クラスター遺伝子座のすぐ上流(5')または下流(3')に存在する約150ntのDNA配列をバイオインフォマティックガイドRNA設計ソフトウェアツール²³に入力する。
      注:この設計ツールは、PAM配列のすぐ隣(非標的DNA鎖上)に存在するcrRNAオリゴヌクレオチド設計のためのユニークな20 nt配列(例えば、S. pyogenes Cas9 PAM配列NGG)を同定します。以下に、mir-891a遺伝子座のすぐ上流(5')の部位(具体的には代表的な結果のセクションおよび表1で議論された5A(891a))を標的とするcrRNA設計の例を示す。
      1. ガイドRNA設計ソフトウェアツール²³を開く。
      2. 「名前の入力」ウィンドウに名前 5A(891a) を入力します 。
      3. 「DNA 配列を入力」ウィンドウに、mir-891a 前駆体遺伝子のすぐ上流 (5') に存在する 150 nt のゲノム配列を入力します。5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. [特異性チェックを有効にする] のチェックボックスをオンにして、プログラムによって計算的に検出されたオフターゲティング サイトを除外します。適切な生物(すなわち、ヒト[ホモサピエンス])を選択します。
      5. 研究に使用された正しいCas9酵素PAM(この場合は 、連鎖球菌ピオゲネス Cas9-PAM:NGG)を指定して、次のデフォルト設定を生成します:ターゲットに対するPAM:後;繰り返しシーケンス: グウウアガグクアウグググウグガイドに対する相対: 3;標的配列の長さ:20;ターゲット 5' 開始に対して相対的にカット: センス 17 アンチセンス 17.
      6. [ 次へ ]ボタンをクリックして、合成crRNA合成の結果を表示します。
         注:この例では、合成される推奨crRNAは、DNA標的 ATACATGCTGATAGTTACAC を認識し、PAM:AGGに隣接して配置されます。
   2. DNA ファイル (ステップ 1.1 で作成) を参照して、欠失する miRNA 遺伝子座に最も近い位置にあり、目的のゲノム標的に対して最も高い特異性を持つ、crRNA 20 nt 標的配列の最良の候補を決定します。
      1. 計算的オフターゲティング解析ツールを使用して、候補crRNA特異性を評価し、標的miRNAクラスター領域とは無関係のゲノム遺伝子座における潜在的なオフターゲティング部位を予測します(例:²⁴、^25、26、27)。
      2. PCRによってシングルコロニーCRISPRクローン細胞株をジェノタイピングする際に、後で参照できるように潜在的なオフターゲティング結果を記録する(ステップ4.2.6。
         注:設計されたcrRNAオリゴヌクレオチドとゲノム標的配列の間で共有される配列相補性の程度は、Cas9酵素がその遺伝子座でゲノムをどの程度選択的に切断するかを決定する。ガイドRNAは3'~5'方向にゲノム標的にアニールするため、DNA標的配列の5'末端(最初の8~10塩基)の不一致は、Cas9を介した切断をしばしばブロックします。ゲノム標的配列がDNA配列の最初の8塩基以内を除いて、別のゲノム遺伝子座と相同性を共有する場合、このガイドRNAは、この部位でオフターゲティングの可能性が低いと予測される。
      3. 各標的miRNA遺伝子座に対して4つのユニークなcrRNAを設計する:miRNAヘアピン/クラスターの5'の相補的DNA配列(5'A、5'B)を標的とする2つの設計されたcrRNA、およびmiRNAヘアピン/クラスターの3'のすぐ3'の相補的DNA配列を標的とする2つの設計crRNA(3'A、3'B)。
         注:CRISPRトランスフェクション(セクション3)を実行する場合、4つの可能な5'および3'ガイドRNAペアの組み合わせ(5'A + 3'A;5'A + 3'B;5'B + 3'A;5'B + 3'B)が各標的miRNA遺伝子座についてテストされ、1回の実験でmiRNA遺伝子座の欠失が成功する確率を高めます。
      4. 作成したDNAファイル の特徴編集ツール (ステップ1.1.)を使用して、合成する各設計crRNAのDNA標的配列(隣接するPAMを含む)をマークします。
3. CRISPR細胞株のジェノタイピングのために標的miRNAクラスター領域に隣接するPCRプライマー(順方向、逆方向)を設計および合成します(そして、作成したDNAファイル内のプライマーを標識します)。
   1. 密接にクラスター化された miRNA または個々の miRNA に対して小さなゲノム欠失を有するジェノタイピング細胞株の場合、Cas9 切断部位/ノックアウト領域の両側に約 150 bp 存在する PCR プライマー (順方向、逆方向) を設計し、ゲル電気泳動による 1 回の PCR 反応で野生型 (~600 bp) とノックアウト (~300 bp) の両方の DNA 断片を検出できるようにします。
   2. miRNA前駆体の組み合わせまたはmiRNAクラスター全体に対して大きなゲノム欠失を有するジェノタイピング細胞株については、Cas9切断/ノックアウト部位の両側に約150 bp存在するPCRプライマー(順方向、逆方向)を再度設計します。標的 miRNA クラスターの欠失の長さが >4 kb に及ぶ場合、PCR 反応では、より小さい方 (~300 bp) のノックアウト DNA 断片のみが検出され、野生型 DNA 断片は検出されない可能性が高いことに注意してください。したがって、スクリーニングプロセスを支援し、ホモ接合型ノックアウト細胞株を検証するために、内部miRNAクラスター遺伝子の有無を検出できる追加のPCRプライマー(順方向、逆方向)を設計します。

2. DOX誘導性Cas9発現カセットを有する安定なレンチウイルス細胞株の作製

注:BSL2手順と無菌技術を使用して、認定されたバイオセーフティフードですべての細胞培養およびウイルス作業を実行します。

1. CRISPR研究のための適切な細胞株タイプおよび好ましい増殖培地を決定する。
   注:このプロトコルは、ヒト前立腺癌細胞株LNCaP(好ましい培地:RPMI、10%ウシ胎児血清[FBS])およびPC3-ML(好ましい培地:DMEM、10%FBS)のために開発されました。
2. ブラストサイジン「死」曲線を実行して、ブラストサイジン耐性遺伝子カセットを保有するレンチウイルス感染細胞について選択する最適な薬物濃度を決定する(ステップ2.3。
   1. プレート細胞を24ウェルプレートの11ウェルに、37°C、好ましい培地中で5%_CO2 が約75%コンフルエントになるまで増殖させる。
   2. ブラストサイジン(作業ストック1mg/mL)を、最終濃度が0、1、10μg/mLの範囲の好ましい培地で希釈し、1μg/mL単位で希釈する。
   3. 播種した24ウェルプレートのウェルに1から11までのラベルを付けた。ウェルから増殖培地を取り出し、適切なブラストサイジン濃度と交換する。
   4. 適切なブラストサイジン濃度の培地を1日おきに7〜10日間交換する。
   5. 時間経過中に毎日細胞を調べ、5〜7日以内にすべての細胞を死滅させるために必要な最小ブラストサイジン濃度を決定する。
      注:CRISPR遺伝子編集実験に使用された特定の細胞株ごとに、ブラストサイジンの「死滅」曲線を実行する必要があります。
3. DOX誘導性Cas9発現カセットを担持したレンチウイルスで細胞を感染させ、工程2.2で決定した最適濃度を用いてブラストサイジン選択を行う。
   1. 6ウェルプレートの3ウェルにおいて、種子5×1ウェルあたり¹⁰⁴ 細胞を、37°C、5%_CO2 一晩(ON)で好ましい培地中で増殖させる。
   2. 翌日、DOX誘導性Cas9(Lenti-iCas9)のレンチウイルス発現ベクターを氷上で解凍する。穏やかに混ぜる(ウイルス粒子を渦巻き込まないでください)。
      注:レンチウイルスを-80°Cのアリコートに保管して、複数回の凍結/融解サイクルを回避し、ウイルス力価と感染効率が低下します。
   3. ウイルス力価濃度に基づいて、感染の多重度0.3(MOI = 0.3)でウイルスで5×¹⁰⁴ 個の細胞を形質導入するのに必要な体積を計算します。
   4. 適切なウイルス量を250 μL(ウェルあたり)の無血清および抗生物質を含まない好ましい培地にピペッティングし、0.8 μg/mLの臭化ヘキサジメトリンを添加した。優しく混ぜる。
      注:臭化ヘキサジメトリンは、ウイルス吸着および感染効率を増加させることが見出されたカチオン性ポリマーである。
   5. メディアを取り出します。Lenti-iCas9ウイルス(MOI = 0.3)で調製した形質導入培地250 μLを細胞に加え、37°C、5%_CO2でONにインキュベートした。(細胞がウイルス関連の毒性作用を示す場合は、インキュベーション時間を4〜6時間に短縮します。
   6. 培地を新鮮な好ましい培地と交換し、細胞を1〜2日間回復させる。
   7. ステップ2.2で説明した「死滅」曲線に由来する最適なブラストサイジン濃度を使用して、感染細胞に対して10〜14日間ブラストサイジン選択を実行します。
      1. 並行して、ウイルス選択のための陽性対照として使用される最適なブラストサイジン濃度を有する培地中で非感染細胞を増殖させる。
   8. 選択時間経過中に3日ごとに最適なブラストサイジン濃度を添加した培地を交換し、死細胞を除去した。
      注:ブラストサイジン選択を生存する細胞のみがレンチウイルスベクターを組み込んでいる。
   9. ブラストサイジン選択Lenti-iCas9細胞株を展開する。
      メモ: 展開のたびにセル通過番号を記録します。
      1. Lenti-iCas9細胞の一部を、長期凍結保存のために10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を添加した好ましい培地で凍結する。
      2. ウェスタン^ブロット9によりLenti-iCas9細胞の一部を分析し、最も堅牢なDOX誘導性Cas9タンパク質レベルを示す細胞株を同定する(ステップ2.3参照。
4. 新しく樹立されたLenti-iCas9細胞株についてドキシサイクリン濃度曲線を実行し、Cas9タンパク質誘導の最適条件を決定する。
   1. このDOX濃度時間経過を実行するために試験した各細胞株に対して4つの独立した6ウェルプレートをセットアップした。プレート5×各6ウェルプレートの1ウェルあたり¹⁰⁴ 細胞を、37°C、好ましい培地中で5%_CO2 で24時間増殖させた。
   2. DOX(作業ストック1mg/mL)を、0、50、100、150、250~500ng/mLの範囲の最終DOX濃度曲線を有する好ましい培地で希釈する。
   3. 各播種した6ウェルプレートのウェルに1から6までのラベルを貼る。培地を取り出し、適切なDOX濃度と交換してください。プレート1〜4を次の時点まで成長させる:24時間、48時間、および72時間DOX誘導;DOX離脱後120時間(当初はDOX誘発72時間)。
   4. 適切な方法(例えば、トリプシン処理)を用いて各時点でプレートのウェルを収穫する。セルペレットを-80°Cで保存する。 細胞ペレットをRIPAバッファー中で処理し、溶解物単離およびCas9ウェスタンブロット分析を行います。
      1. 変性 4%-12% Bis-Tris ゲルを使用して、DOX 誘導時間経過の各サンプルに対して 40 μg の細胞溶解液を実行し、タンパク質をイムノブロット膜に移します。
      2. Cas9に対する一次抗体でイムノブロット膜をハイブリダイズし、160kDaタンパク質を検出した。 GAPDH (37kDa)などのハウスキーピング遺伝子を使用してCas9レベルを正常化します。
   5. ウェスタンブロット結果に基づいて、Lenti-iCas9細胞株においてCas9を誘導するのに最適なDOX濃度を決定する。
      注:この時間コースでは、DOX除去後120時間でCas9発現がどれほど厳しく規制されているかも明らかにします。
   6. CRISPRトランスフェクションを最適化するために、堅牢なCas9タンパク質発現を示すLenti-iCas9細胞株の単一細胞コロニーを確立します(セクション3)。

3. ハイスループットフォーマットを用いた細胞のCas9誘導および合成ガイドRNAトランスフェクションによるCRISPR反応の実行

メモ: ワークフロー図を 図 1 に示します。

1. 紙の上で、miRNAクラスター全体、さまざまなクラスター化されたmiRNA遺伝子の組み合わせ、および個々のmiRNAクラスターメンバーを標的とする24ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクトされるcrRNAペアの組み合わせをマッピングします。
   1. マップ上で、標的miRNA遺伝子座あたり4つのウェルに標識する。各ウェルがトランスフェクション反応を表し、2つのユニークなcrRNAが所望のmiRNAノックアウトゲノム遺伝子座およびtracrRNAの5'および3'に位置する(アニーリングされた1:1モル比)。
   2. 4つの標識ウェルのそれぞれが、トランスフェクション用の固有のcrRNAペアを表していることを確認してください(例えば、5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B)。
      注:各標的miRNA遺伝子座(セクション1)に隣接する2つの5'crRNAと2つの3'crRNAの設計により、トランスフェクション反応において4つの可能な5'および3'ガイドRNAペアの生成が可能になります。
2. Lenti-iCas9細胞株を、最適化されたDOX濃度を含む好ましい培地(ステップ^2.4 で決定)の24ウェルプレートの5 x 104細胞/ウェルでプレートします。細胞を37°Cで24〜48時間増殖させ、5%_CO2 でCas9タンパク質発現を誘導する。
3. Lenti-iCas9細胞を、調製した5'および3'ガイドRNAでトランスフェクトします。
   1. 合成したcrRNAおよびtracrRNAオリゴヌクレオチドをヌクレアーゼフリー水で再構成し、ストック濃度10μMになるように-80°Cで長期間保存する。
   2. ステップ3.1で設計した実験マップに基づいて、標的miRNA遺伝子座あたり4本の1.5mL微量遠心チューブに標識し、4つの可能な5'および3'crRNAペアの組み合わせ(5'A + 3'A;5'A + 3'B;5'B + 3'A;5'B + 3'B)を表す。
   3. 各チューブで、tracrRNA と固有の crRNA (5' および 3') の 1:1 モル比を一緒に混合し、以下の反応 (最終容量 10 μL) を使用して 2 μM ガイド RNA 複合体を形成します。
      1. 2.5 μL の tracrRNA (10 μM ストック)、1.25 μL の 5' 位置 crRNA (10 μM ストック)、1.25 μL の 3' 位置 crRNA (10 μM ストック)、および pH 7.5 の 10 mM TRIS-HCL pH 5 μL を 1.5 mL 遠沈管に加えます。微量遠心分離機で16,000 × g で30秒間混合する。室温(RT)で5分間インキュベートする。
   4. 各チューブに、40 μL の還元血清培地 (例: Opti-MEM) を 10 μL のガイド RNA 複合体反応 (全容量 50 μL) に加えます。上下にピペッティングしてやさしく混ぜます。
   5. 清潔な 1.5 mL 遠沈管で、2 μL のトランスフェクション試薬 28 (注 3.3.5.1 を参照) と⁴⁸ μL の還元血清培地 (Opti-MEM、最終容量 50 μL など) を上下にピペッティングして穏やかに混合します。RTで5分間インキュベートする。
      1. 試薬(2 μL)と減少した血清培地(例えば、Opti-MEM、48 μL)の量にトランスフェクションするウェル数を掛け、わずかなピペッティングの不正確さを考慮して10%の余分な容量を加えて、トランスフェクション試薬のマスターミックスを調製します。
         注: 低分子 RNA および CRISPR RNA オリゴヌクレオチドのトランスフェクション、および細胞株²⁸ 型に最適化されたトランスフェクション試薬を選択してください。
   6. 50 μL のガイド RNA ミックスを含む各チューブに (ステップ 3.3.4 から)、希釈したトランスフェクション試薬 50 μL を追加します (ステップ 3.3.5 から)。混合物をゆっくりと上下に1回ピペッティングして混合します。RTで20分間インキュベートする。
   7. DOX (最適濃度) を添加した抗生物質フリー培地 400 μL を、ガイド RNA/トランスフェクションミックス 100 μL を含む各チューブに追加します。ピペットをやさしく混ぜる。
4. DOX誘導性Lenti-iCas9細胞から培地を除去する(ステップ3.2。24ウェルプレートの実験マップに基づいて、500 μLの培地/DOX/guide RNA/トランスフェクションミックスを追加します(ステップ3.1)。トランスフェクトした細胞を37°C、5%_CO2で48時間インキュベートする。
5. 培地をDOXを含まない新鮮な好ましい培地と交換する(細胞からCas9タンパク質を消去する)。細胞が37°C、5%CO2でさらに24〜48時間回復するのを待ち_ます。
6. トランスフェクトされた細胞を回収し(トリプシン化)、ジェノタイピングおよび単一細胞希釈を準備する。
   注:細胞は、トランスフェクトされたCRISPR遺伝子編集細胞およびトランスフェクトされていない野生型細胞を含む混合集団を表す。このステップは、単一細胞コロニー拡張に時間/リソースを投資する前に、CRISPR編集の効率を決定する。
   1. 細胞を1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1x洗浄する。細胞を100 μLのトリプシン中で37°C、5%_CO2 で5分間インキュベートし、1 mLの培地を含む清潔な1.5 mL遠沈管に細胞を移します。
   2. 転倒して細胞を混合し、20°Cで200× g で5分間微量遠心分離する。 培地を除去し、細胞ペレットを1mLのPBSに再懸濁した。
   3. 洗浄した細胞を20°Cで200× g で5分間微量遠心分離する。 PBSを除去し、細胞ペレットを150μLの好ましい培地に再懸濁する。
7. 血球計数器または自動細胞計数器を使用して、再懸濁細胞150μLのマイクロリットルあたりの細胞数を決定する。
8. 150 μLの再懸濁細胞を3つの部分に分けます。
   1. トランスフェクトした細胞の 1/3 (50 μL) を培地で凍結し、クライオバイアルで 10% DMSO (最終容量 150 μL) を加え、将来の拡張/長期保存に備えます。
   2. トランスフェクトした細胞の 1/3 個 (50 μL) を清潔な 0.2 mL PCR チューブに移してジェノタイピングします。
      1. 細胞を4°Cで200× g で5分間微量遠心分離し、培地を除去した。
      2. 細胞ペレットを100 μLのPBSに再懸濁する。
      3. 細胞を4°Cで200× g で5分間微量遠心分離し、PBSを除去した。混合集団細胞ペレットを-80°Cで長期間保存する。
      4. セクション 4 のワークフローを使用して、ジェノタイピング用の細胞ペレットを処理します。
   3. 細胞の最終 1/3 (50 μL) を希釈用に準備し、96 ウェルプレート形式でプレーティングして単一細胞コロニーを生成します。
      1. ステップ 3.7 の細胞数に基づいて、96 ウェルプレートの 1 ウェルあたり 100 μL の培地で 10、5、2、および 1 細胞を達成するために必要な希釈率を計算します。
      2. 12 チャネルマルチピペッターおよび滅菌試薬リザーバーを使用して、各希釈液 (1 ウェルあたり 10、5、2、または 1 細胞) ごとに 2 列のプレート (合計 24 ウェル) に 1 ウェルあたり 100 μL の希釈細胞を追加します。細胞が単一細胞コロニー拡張のためにコンフルエントになるまで成長するのに4〜6週間かかる。毎週、光学顕微鏡で細胞を観察し、コロニーが単一細胞コロニーまたは複数細胞コロニーを表しているかどうかに注意してください。
      3. ジェノタイピングのために〜10〜15個の単一細胞コロニーを収集する(セクション4)。標的miRNA遺伝子座ごとに少なくとも3つの独立したノックアウト単一細胞コロニー株を同定する。野生型単一細胞株を対照として保持する。
         注:スクリーニング数は、細胞株タイプおよびmiRNAノックアウト表現型が細胞増殖/生存率に及ぼす影響に依存する。

4. 粗細胞溶解物を用いたCRISPR細胞株のPCRジェノタイピング

1. 96ウェルプレートのほぼコンフルエントなウェルから個体の単一細胞コロニーを採取する。
   メモ:これらの手順で説明する培地/PBSの除去は、バイオセーフティキャビネットの真空アスピレーターを使用して手動で実行できますが、交差汚染を避けるように注意してください。吸引するときは、96ウェルプレートの各ウェルに新しい滅菌「黄色」200μLピペットマンチップを使用し、交換された黄色の各チップを真空アスピレーターに取り付けられた滅菌ガラス牧草地ピペットの端部にしっかりと配置します。
   1. ウェルを100 μLのPBSで1x洗浄します。PBSを吸引します。
   2. 50 μLのトリプシンを加え、37°C、5%CO2で₂〜5分間インキュベートする。
   3. 穏やかにピペットを上下にピペットし、再懸濁した細胞を1 mLの培地を含む1.5 mLの遠沈管に移します。
   4. 反転して細胞を20°Cで200× g で5分間微量遠心分離機中で混合し、穏やかにペレット化する。
   5. 培地を取り出し、PBSを1mL加える。チューブを静かにフリックしてペレットを乱し、数回反転させて混合します。
   6. 20°Cで200× g で5分間の微量遠心分離機で、細胞をペレット化した。
   7. PBSを取り出し、ペレットを300μLの新鮮なPBSに再懸濁する。
   8. 300 μL サンプルを 2 つの部分に分割します。
      1. 200 μLの細胞(ペレットの2/3)を、1 mLの好ましい培地を含む24ウェルプレートのウェルに移す。遺伝子型が検証されたら、これらの細胞を使用して、機能解析のためにCRISPR媒介ノックアウト細胞株を拡張します。
      2. 100 μL の細胞 (ペレットの 1/3) を 0.2 mL PCR チューブに移します。4°Cで3,000 x g で5分間の微量遠心分離機。 PBS を取り外します。ペレットを-80°Cで保存する。
2. ステップ1.3で設計したPCRプライマーを使用して、ジェノタイピングおよび配列解析用の粗細胞溶解物を調製する。これらの実験には、野生型陽性対照として使用するためにトランスフェクトされていない細胞から調製した細胞溶解物が含まれる。
   1. 細胞ペレットを 4 μL の 5 x DNA ポリメラーゼバッファー ( 材料表、最終濃度 1x)、1 μL のプロテイナーゼ K (20 ng/mL ストック)、1 μL の RNase A (10 ng/mL ストック)、およびヌクレアーゼフリーの水に全量 20 μL まで再懸濁します。
   2. PCRプログラムを使用してサーモサイクラーで細胞を溶解する:56°Cで30分間、96°Cで5分間。細胞溶解液を-20°Cで保存する。
   3. ガイドRNAの5'および3'ガイドRNA標的部位に隣接する設計のPCRプライマー(前方、後方)を使用してPCR反応を行います(表1)。
      注:DNAポリメラーゼバッファーおよびサーモサイクラーの条件は、PCR反応に使用されるTaq DNAポリメラーゼ酵素によって異なります。このプロトコルは、Phusion HF DNA ポリメラーゼ用に最適化されました。
      1. PCR 反応ミックスを氷上でセットアップします: 5 μL の 5x DNA ポリメラーゼバッファー、0.5 μL のフォワード PCR プライマー (10 μM ストック)、0.5 μL のリバース PCR プライマー (10 μM ストック)、0.5 μL の 10 mM dNTP、0.25 μL の DNA ポリメラーゼ、1 ~ 4 μL の細胞溶解液、およびヌクレアーゼフリー水を全容量 25 μL まで。
      2. PCR反応は、98°Cで3分間、98°Cで10秒間、62°Cで15秒間、72°Cで15秒間、次いで72°Cで10分間のプログラムを使用して、サーモサイクラーでPCR反応を実行します。4°Cに保持する。 注 4.2.3 を参照してください。上。
   4. PCR 産物を 1% アガロースゲルにロードして電気泳動分析を行います。
   5. ノックアウト(および野生型)遺伝子型について予測された分子サイズの単離されたPCR断片からDNAを抽出します。DNA シーケンシング用のサンプルを準備します。
   6. CRISPR反応が成功したことを検証し、単離されたPCR断片のDNAシーケンシングを実行して、Cas9切断部位を同定し、miRNA遺伝子座の欠失を確認します。
      1. CRISPRによって標的とされる各miRNA遺伝子座について少なくとも3つの独立したノックアウト細胞株を単離する。下流の機能研究における対照として使用する野生型(およびヘテロ接合型)細胞株を保持する。
      2. qRT-PCRまたはノーザンブロット解析を実行して、ノックアウト細胞株が欠失遺伝子座に対して成熟miRNAを発現しないことを確認します。
         注:全ゲノムシーケンシング(WGS)は、CRISPR遺伝子編集とオフターゲティングを検証するための最も決定的な方法です。
      3. PCRによるCRISPRオフターゲティング効果の検定は、計算上予測された(ステップ1.2.3)。^24,25,26,27。
      4. 広範な単一細胞コロニースクリーニングがヘテロ接合性遺伝子型のみをもたらす場合、単一細胞ヘテロ接合株においてガイドRNAトランスフェクションを繰り返す。
         注:ホモ接合型ノックアウト細胞株を入手できないことは、さらなる分析を必要とする親細胞株のmiRNA損失または固有のゲノムの複雑さ(染色体の重複/融合など)による致命的な影響を示す可能性があります。

結果

このハイスループットCRISPR欠失プロトコルは、前立腺癌の関連で研究されたmiR-888クラスターを標的とする合成オリゴヌクレオチドガイドRNAを用いたCas9誘導性LNCaPおよびPC3-MLヒト癌細胞株のトランスフェクションを用いて首尾よく採用された。miR-888クラスターは、発現プロファイリングスクリーニングにおいて、低悪性度および非癌患者と比較して、高悪性度疾患を有する前立腺癌患者にお?...

ディスカッション

このCRISPR遺伝子編集手順により、研究者は、ユニークなmiRNAクラスター欠失の組み合わせを持つ細胞株のパネル全体を迅速に生成することができます。このプロトコルでは、合成tracrRNA(1:1モル比)でアニーリングされた5'および3'ゲノム部位特異的crRNAで構成される合成ガイドRNAのトランスフェクションにより、時間のかかるプラスミドベクターのサブクローニングが回避され、24ウェル形式を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system