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  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

这里描述的协议提供了有关如何在用户友好的UCSC基因组浏览器上使用PhyloCSF分析微蛋白编码潜力的感兴趣基因组区域的详细说明。此外，建议使用几种工具和资源来进一步研究已鉴定的微蛋白的序列特征，以深入了解其假定的功能。

摘要

下一代测序（NGS）推动了基因组学领域的发展，并为许多动物物种和模式生物产生了全基因组序列。然而，尽管有如此丰富的序列信息，但全面的基因注释工作已被证明具有挑战性，特别是对于小蛋白质。值得注意的是，传统的蛋白质注释方法被设计成有意排除由长度小于300个核苷酸的短开放阅读框（sORFs）编码的推定蛋白质，以过滤掉整个基因组中呈指数级增长的虚假非编码SORF。结果，数百种称为微蛋白的功能性小蛋白质（长度<100个氨基酸）被错误地归类为非编码RNA或完全被忽略。

在这里，我们提供了一个详细的协议，以利用免费的，公开可用的生物信息学工具，根据进化保护来查询基因组区域的微蛋白编码潜力。具体而言，我们提供了有关如何在用户友好的加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器上使用系统发育密码子替换频率（PhyloCSF）检查序列保存和编码潜力的分步说明。此外，我们还详细介绍了有效生成已鉴定微蛋白序列的多个物种比对的步骤，以可视化氨基酸序列保存，并推荐分析微蛋白特征的资源，包括预测的结构域结构。这些强大的工具可用于帮助鉴定非正统基因组区域中的推定微蛋白编码序列，或排除在感兴趣的非编码转录本中存在具有翻译潜力的保守编码序列。

引言

自人类基因组计划启动以来，基因组中全套编码元件的鉴定一直是一个主要目标，并且仍然是了解生物系统和基于遗传的疾病的病因学的中心目标1，2，3，4。NGS技术的进步导致为大量生物体（包括脊椎动物，无脊椎动物，酵母和植物）生成全基因组序列5.此外，高通量转录测序方法进一步揭示了细胞转录组的复杂性，并鉴定了数千种具有蛋白质编码和非编码功能的新型RNA分子6，7。解码如此大量的序列信息是一个持续的过程，全面的基因注释工作仍然存在挑战8.

最近开发的翻译分析方法，包括核糖体分析9，10和多核糖体测序11，已经提供了证据，表明数百个非规范翻译事件映射到整个基因组中当前未注释的SORFs，有可能产生称为微蛋白或微肽的小蛋白质12，13，14，15，16，17. 微蛋白已成为一类新颖的多功能蛋白质，由于其体积小（<100个氨基酸）和缺乏经典的蛋白质编码基因特征而被标准基因注释方法所忽视8，12，18，19，20。微蛋白已经在几乎所有生物体中都有描述，包括酵母21，22，苍蝇17，23，24和哺乳动物25，26，27，28，并且已被证明在各种过程中起关键作用，包括发育，代谢和应激信号传导19，20，29，30，31，32，33，34.因此，必须继续为这一类长期被忽视的功能小蛋白质的其他成员挖掘基因组。

尽管人们普遍认识到微蛋白的生物学重要性，但这类基因在基因组注释中仍然远远不足，它们的准确鉴定仍然是一个持续的挑战，阻碍了该领域的进展。最近开发了各种计算工具和实验方法来克服与识别微蛋白编码序列相关的困难（在几个综合综述8，35，36，37中广泛讨论）。最近的许多微蛋白鉴定研究38，39，40，41，42，43，44，45，46，47都严重依赖使用一种称为PhyloCSF48，49的算法。，一种强大的比较基因组学方法，可用于区分基因组的保守蛋白质编码区域和非编码区域。

PhyloCSF使用多物种核苷酸比对和系统发育模型来比较密码子取代频率（CSF），以检测蛋白质编码基因的进化特征。这种基于经验模型的方法依赖于这样一个前提，即蛋白质主要在氨基酸水平而不是核苷酸序列上是保守的。因此，编码相同氨基酸的同义词密码子取代或对具有保守性质（即电荷，疏水性，极性）的氨基酸的密码子取代被评分为正，而非同义取代，包括错义和无意义取代，得分为负数。PhyloCSF在全基因组数据上进行训练，并已被证明在分离于完整序列的编码序列（CDS）的短部分方面是有效的，这在分析微蛋白或标准蛋白质编码基因的单个外显子48，49时是必需的。

值得注意的是，最近在加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组浏览器49，50，51中集成了PhyloCSF跟踪中心，使所有背景的研究人员都可以轻松访问用户友好的界面，以查询感兴趣的基因组区域，以获得蛋白质编码潜力。下面概述的协议提供了有关如何在UCSC基因组浏览器上加载PhyloCSF跟踪中心并随后询问感兴趣的基因组区域以探测高置信度蛋白质编码区域（或缺乏高置信度蛋白质编码区域）的详细说明。此外，在观察到阳性PhyloCSF评分的情况下，描述步骤以进一步分析微蛋白编码潜力并有效地生成已鉴定氨基酸序列的多个物种比对，以说明跨物种序列守恒。最后，在讨论中引入了几个额外的公开资源和工具，以调查已鉴定的微蛋白特征，包括预测的结构域结构和对假定微蛋白功能的见解。

研究方案

下面概述的协议详细介绍了在UCSC基因组浏览器（由Mudge等人生成）上加载和导航PhyloCSF浏览器轨道的步骤。有关UCSC基因组浏览器的一般问题，可以在此处找到广泛的基因组浏览器用户指南:https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html。

1. 将系统级社群跟踪中心加载到 UCSC 基因组浏览器

  1. 打开互联网浏览器窗口并导航到UCSC基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/）。
  2. 在" 我们的工具 "标题下，选择" 跟踪中心 "选项。
    注意:" 跟踪中心 "选项也可以在" 我的数据 "选项卡下找到。
  3. 在"公共中心"选项卡中，在"搜索词"框中键入"PhyloCSF"。单击"搜索公共中心"按钮。
  4. 通过单击中心名称系统CSF的" 连接 "按钮 连接到系统类 （描述:由系统类CSF测量的进化蛋白质编码电位）。
    注:此轨道集线器将加载到许多组件，包括人体（hg19 和 hg38）和鼠标（mm10 和 mm39）。
  5. 单击 "连接"后，等待重定向到 UCSC 基因组浏览器网关页面（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）。

2. 使用基因标识符导航到感兴趣的基因

  1. 选择要查询的物种和基因组组合。要查询其他物种（例如鼠标），请通过单击相应的图标在 "浏览/选择物种" 标题下选择感兴趣的物种，或者在文本框中键入物种， 输入物种、公用名或程序集 ID。
    注: 程序集直接列在 "查找位置" 标题下。通常，默认值为人体大会（例如，2009 年 12 月 [GRCh37/hg19]）。
  2. 使用下拉菜单在 "查找位置" 标题下选择要搜索的组件。
  3. 在"位置/搜索词"框中输入位置、基因符号或 搜索词， 然后单击" 转到 "以在"基因组浏览器"上导航到感兴趣的基因。
  4. 如果搜索结果有多个匹配项，请等待重定向到需要选择感兴趣位置的页面。单击 相应的目的基因。

3. 使用序列信息导航到感兴趣的基因组区域

  1. 导航到UCSC基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/），然后在我们的工具标题下选择BLAST样比对工具（BLAT），以查询特定的DNA或蛋白质序列。或者，将光标悬停在"工具"选项卡上，然后选择"Blat"选项或单击以下链接:https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat。
  2. 使用下拉菜单选择感兴趣的物种（基因组）和 组装 。
  3. 使用下拉菜单定义 查询类型 。
  4. 将感兴趣的序列粘贴到 "BLAT 搜索基因组 "文本框中，然后单击" 提交"。
  5. 单击 ACTIONS 标题下的浏览器链接以导航到感兴趣的基因组区域。

4. 使用系统级数跟踪数据识别保守的随机对冲量程

  1. 目视扫描感兴趣的基因组区域，以对系统CSF区域进行正评分（图1）。
    注意:有关如何在UCSC基因组浏览器上直观地解释PhyloCSF评分的详细说明，请参阅下面的代表性结果部分。
  2. 使用缩放功能放大感兴趣的区域以检查序列特征并搜索开始/停止密码子。要手动放大，请按住 Shift 键，单击并按住鼠标按钮，同时沿感兴趣区域拖动。或者，使用页面顶部的放大和缩小按钮进行导航（提供 1.5 倍、3 倍、10 倍或基本变焦选项）。
    注意:在使用 放大/缩小 按钮之前，有必要重新定位基因，以便感兴趣的区域位于屏幕的中间。要执行此操作，请单击图像并将其向左或向右拖动以根据需要水平移动基因组区域，或使用页面顶部的 移动 箭头。
  3. 放大，直到核苷酸（碱基）序列可见。
    注意:核苷酸序列将直接出现在 +1 平滑系统 CSF 评分的上方。
  4. 目视扫描正评分的 PhyloCSF 区域的开头和结尾附近的核苷酸序列，以识别假定的起始 （ATG） 和停止 （TGA/TAA/TAG） 密码子。
    注意:如果目的基因位于 DNA 的负链上，则起始和终止密码子将是反向补体（即，CAT 用于起始密码子，TCA/TTA/CTA 用于停止密码子）。

5. 观察其他基因组中的同源区域

  1. 将鼠标悬停在页面顶部的 "视图 "标题上，然后单击" 在其他基因组中（转换）" 选项。
  2. 使用 "新建 基因组"标题下的下拉菜单定义感兴趣的基因组。
  3. 使用 "新建 程序集"标题下的下拉菜单选择感兴趣的基因组程序集，然后单击" 提交 "按钮。
  4. 一旦浏览器返回新组件中具有相似性的区域列表，请单击 染色体位置 链接以导航到感兴趣的同源区域。
    注:将为每个区域定义该区域所覆盖的总碱基（核苷酸）的百分比和跨度。匹配基数的百分比越高，感兴趣区域的保护程度就越高。
  5. 按照第 4 节中详述的相同导航策略来分析序列。

6. 为感兴趣的微蛋白生成多物种序列比对

  1. 单击UCSC基因组浏览器上GENCODE跟踪中的目的基因（如图1A所示，带有蓝色框）以导航到基因描述页面。
  2. 在" 工具和数据库的序列和链接 "标题下，单击表中显示" 其他物种FASTA"的链接。
  3. 单击与感兴趣物种关联的框以选择它们。单击" 提交"。将页面底部以FASTA格式显示的序列复制并粘贴到文字处理文档中。
  4. 打开第二个浏览器窗口，导航到欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）网站53，54:https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ 上的Clustal Omega多序列比对工具52。
  5. 将仍在剪贴板上的序列文件粘贴到 STEP 1 中以 任何受支持的格式读取序列的框中。滚动到页面底部，然后单击" 提交"。在对齐的结果（黑色字体）下方查看指示每个氨基酸的保守程度的符号（符号在 表1中定义）。
    注意:生成对齐可能需要几分钟时间。
  6. 要查看颜色的氨基酸属性，请单击序列正上方的" 显示颜色 "链接，以根据其属性（定义于 表2中）对氨基酸进行着色。
  7. 将序列对齐复制并粘贴到文字处理或幻灯片程序中，以生成图形或插图文件（例如， 图2）。
    注意:使用等宽字体进行对齐，如"快递"。
  8. 要查看 Clustal Omega 结果页面的其他输出，请单击相应的选项卡（即 指南树 或 系统发育树）。
  9. 单击" 结果查看器 "选项卡可使用 Jalview（一个专门从事多个序列比对编辑、可视化和分析55 的免费程序）查看序列信息的选项，或访问 指向 MView 和 简单系统发育56 的直接链接。

结果

在这里，我们将使用经过验证的微蛋白米托雷古林（Mtln）作为示例，以演示保守的sORF将如何产生阳性的PhyloCSF评分，该评分可以在UCSC基因组浏览器上轻松可视化和分析。米托瑞古林以前被注释为非编码RNA（以前是人类基因ID LINC00116和小鼠基因ID 1500011K16Rik）。比较基因组学和序列保存分析方法在其初步发现40、57、58、...

讨论

这里介绍的协议提供了有关如何在用户友好的UCSC基因组浏览器48，49，50，51上使用PhyloCSF询问感兴趣的基因组区域以识别微蛋白编码潜力的详细说明。如上所述，PhyloCSF是一种强大的比较基因组学算法，它集成了系统发育模型和密码子替换频率，以识别蛋白质编码基因48，

披露声明

作者声明他们没有竞争的经济利益。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（HL-141630和HL-160569）和辛辛那提儿童研究基金会（受托人奖）的资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
WebsiteWebsite AddressRequirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Toolhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/Web browserMultiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdbhttps://coxpresdb.jpWeb browserProvides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQshttps://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQWeb browserFrequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI),
Tools and Data Resources		https://www.ebi.ac.uk/services/allWeb browserComprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portalhttps://www.expasy.orgWeb browserSuite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Conserved Domain Search		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiWeb browserSearch tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35http://pfam.xfam.orgWeb browserProtein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		Web browserDetailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0Web browserPredicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM - 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0Web browserPrediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Searchhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatWeb browserTool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gatewayhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayWeb browserDirect link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Homehttps://genome.ucsc.edu/Web browserHome website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubsWeb browserDirect link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guidehttps://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.htmlWeb browserComprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORThttps://wolfpsort.hgc.jpWeb browserProtein subcellular localization prediction tool

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