Un approccio integrato per l'identificazione delle microproteine e l'analisi delle sequenze

Riepilogo

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni dettagliate su come analizzare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC di facile utilizzo. Inoltre, si raccomandano diversi strumenti e risorse per studiare ulteriormente le caratteristiche di sequenza delle microproteine identificate per ottenere informazioni sulle loro presunte funzioni.

Abstract

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha spinto in avanti il campo della genomica e ha prodotto sequenze di genoma intero per numerose specie animali e organismi modello. Tuttavia, nonostante questa ricchezza di informazioni sulla sequenza, gli sforzi completi di annotazione genica si sono dimostrati impegnativi, specialmente per le piccole proteine. In particolare, i metodi convenzionali di annotazione delle proteine sono stati progettati per escludere intenzionalmente le proteine putative codificate da brevi frame di lettura aperti (SORF) di lunghezza inferiore a 300 nucleotidi per filtrare il numero esponenzialmente più elevato di SORF non codificanti spuri in tutto il genoma. Di conseguenza, centinaia di piccole proteine funzionali chiamate microproteine (<100 amminoacidi di lunghezza) sono state erroneamente classificate come RNA non codificanti o completamente trascurate.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per sfruttare strumenti bioinformatici gratuiti e pubblicamente disponibili per interrogare le regioni genomiche per il potenziale di codifica delle microproteine basato sulla conservazione evolutiva. In particolare, forniamo istruzioni dettagliate su come esaminare la conservazione della sequenza e il potenziale di codifica utilizzando le frequenze di sostituzione filogenetica dei codone (PhyloCSF) sul browser del genoma dell'Università della California Santa Cruz (UCSC). Inoltre, descriviamo in dettaglio i passaggi per generare in modo efficiente allineamenti di più specie di sequenze di microproteine identificate per visualizzare la conservazione della sequenza di aminoacidi e raccomandiamo risorse per analizzare le caratteristiche delle microproteine, comprese le strutture di dominio previste. Questi potenti strumenti possono essere utilizzati per aiutare a identificare presunte sequenze di codifica microproteica in regioni genomiche non canoniche o per escludere la presenza di una sequenza di codifica conservata con potenziale traslazionale in una trascrizione non codificante di interesse.

Introduzione

L'identificazione del set completo di elementi codificanti nel genoma è stato un obiettivo importante sin dall'inizio del Progetto Genoma Umano, e rimane un obiettivo centrale verso la comprensione dei sistemi biologici e l'eziologia delle malattie a base genetica 1,2,3,4. I progressi nelle tecniche NGS hanno portato alla produzione di sequenze di genoma intero per un vasto numero di organismi, tra cui vertebrati, invertebrati, lieviti e piante⁵. Inoltre, i metodi di sequenziamento trascrizionale ad alto rendimento ha....

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito descrive i passaggi per caricare e navigare le tracce del browser PhyloCSF sul browser del genoma UCSC (generato da Mudge et ^al.49). Per domande generali riguardanti il browser del genoma UCSC, una guida per l'utente del browser Genome completa può essere trovata qui: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.

1. Caricamento dell'hub di traccia PhyloCSF sul browser del genoma UCSC

1. Aprire una finestra del browser Internet e passare al browser del genoma UCSC (

Risultati

Qui useremo la microproteina convalidata mitoregulina (Mtln) come esempio per dimostrare come un sORF conservato genererà un punteggio PhyloCSF positivo che può essere facilmente visualizzato e analizzato sul browser del genoma UCSC. La mitoregulina è stata precedentemente annotata come RNA non codificante (precedentemente gene umano ID LINC00116 e gene di topo ID 1500011K16Rik). La genomica comparativa e i metodi di analisi della conservazione delle sequenze hanno svolto un ruolo fondamentale nella .......

Discussione

Il protocollo qui presentato fornisce istruzioni dettagliate su come interrogare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC 48,49,50,51. Come descritto sopra, PhyloCSF è un potente algoritmo di genomica comparativa che integra modelli filogenetici e frequenze di sostituzione dei codone per identificare le.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Website	Website Address	Requirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool	https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/	Web browser	Multiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdb	https://coxpresdb.jp	Web browser	Provides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQs	https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ	Web browser	Frequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Tools and Data Resources	https://www.ebi.ac.uk/services/all	Web browser	Comprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portal	https://www.expasy.org	Web browser	Suite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI) Conserved Domain Search	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi	Web browser	Search tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35	http://pfam.xfam.org	Web browser	Protein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth	Web browser	Detailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
SignalP 6.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0	Web browser	Predicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM - 2.0	https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0	Web browser	Prediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Search	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Web browser	Tool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gateway	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway	Web browser	Direct link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Home	https://genome.ucsc.edu/	Web browser	Home website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubs	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs	Web browser	Direct link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guide	https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html	Web browser	Comprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORT	https://wolfpsort.hgc.jp	Web browser	Protein subcellular localization prediction tool