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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni dettagliate su come analizzare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC di facile utilizzo. Inoltre, si raccomandano diversi strumenti e risorse per studiare ulteriormente le caratteristiche di sequenza delle microproteine identificate per ottenere informazioni sulle loro presunte funzioni.

Abstract

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha spinto in avanti il campo della genomica e ha prodotto sequenze di genoma intero per numerose specie animali e organismi modello. Tuttavia, nonostante questa ricchezza di informazioni sulla sequenza, gli sforzi completi di annotazione genica si sono dimostrati impegnativi, specialmente per le piccole proteine. In particolare, i metodi convenzionali di annotazione delle proteine sono stati progettati per escludere intenzionalmente le proteine putative codificate da brevi frame di lettura aperti (SORF) di lunghezza inferiore a 300 nucleotidi per filtrare il numero esponenzialmente più elevato di SORF non codificanti spuri in tutto il genoma. Di conseguenza, centinaia di piccole proteine funzionali chiamate microproteine (<100 amminoacidi di lunghezza) sono state erroneamente classificate come RNA non codificanti o completamente trascurate.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per sfruttare strumenti bioinformatici gratuiti e pubblicamente disponibili per interrogare le regioni genomiche per il potenziale di codifica delle microproteine basato sulla conservazione evolutiva. In particolare, forniamo istruzioni dettagliate su come esaminare la conservazione della sequenza e il potenziale di codifica utilizzando le frequenze di sostituzione filogenetica dei codone (PhyloCSF) sul browser del genoma dell'Università della California Santa Cruz (UCSC). Inoltre, descriviamo in dettaglio i passaggi per generare in modo efficiente allineamenti di più specie di sequenze di microproteine identificate per visualizzare la conservazione della sequenza di aminoacidi e raccomandiamo risorse per analizzare le caratteristiche delle microproteine, comprese le strutture di dominio previste. Questi potenti strumenti possono essere utilizzati per aiutare a identificare presunte sequenze di codifica microproteica in regioni genomiche non canoniche o per escludere la presenza di una sequenza di codifica conservata con potenziale traslazionale in una trascrizione non codificante di interesse.

Introduzione

L'identificazione del set completo di elementi codificanti nel genoma è stato un obiettivo importante sin dall'inizio del Progetto Genoma Umano, e rimane un obiettivo centrale verso la comprensione dei sistemi biologici e l'eziologia delle malattie a base genetica 1,2,3,4. I progressi nelle tecniche NGS hanno portato alla produzione di sequenze di genoma intero per un vasto numero di organismi, tra cui vertebrati, invertebrati, lieviti e piante5. Inoltre, i metodi di sequenziamento trascrizionale ad alto rendimento hanno ulteriormente rivelato la complessità del trascrittoma cellulare e identificato migliaia di nuove molecole di RNA con funzioni sia codificanti che non codificanti proteine 6,7. La decodifica di questa grande quantità di informazioni sulla sequenza è un processo continuo e le sfide rimangono con gli sforzi completi di annotazione genica8.

Il recente sviluppo di metodi di profilazione traslazionale, tra cui il profilo dei ribosomi 9,10 e il sequenziamento dei poli-ribosomi11, hanno fornito prove che indicano che centinaia di eventi di traduzione non canonica mappano a SORF attualmente non annotate in tutto il genoma, con il potenziale di generare piccole proteine chiamate microproteine o micropeptidi 12,13,14,15,16, 17. Le microproteine sono emerse come una nuova classe di proteine versatili precedentemente trascurate dai metodi standard di annotazione genica a causa delle loro piccole dimensioni (<100 amminoacidi) e della mancanza di caratteristiche genetiche classiche che codificano proteine 8,12,18,19,20. Le microproteine sono state descritte praticamente in tutti gli organismi, compresi i lieviti21,22, le mosche 17,23,24 e i mammiferi 25,26,27,28, e hanno dimostrato di svolgere ruoli critici in diversi processi, tra cui sviluppo, metabolismo e segnalazione dello stress 19,20,29, 30,31,32,33,34. Pertanto, è imperativo continuare a estrarre il genoma per ulteriori membri di questa classe a lungo trascurata di piccole proteine funzionali.

Nonostante il diffuso riconoscimento dell'importanza biologica delle microproteine, questa classe di geni rimane ampiamente sottorappresentata nelle annotazioni del genoma e la loro accurata identificazione continua ad essere una sfida continua che ha ostacolato i progressi nel campo. Recentemente sono stati sviluppati vari strumenti computazionali e metodi sperimentali per superare le difficoltà associate all'identificazione delle sequenze di codifica delle microproteine (ampiamente discusse in diverse revisioni complete 8,35,36,37). Molti recenti studi di identificazione delle microproteine 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 hanno fatto molto affidamento sull'uso di uno di questi algoritmi chiamato PhyloCSF 48,49 , un potente approccio di genomica comparativa che può essere sfruttato per distinguere le regioni del genoma che codificano proteine conservate da quelle che non sono codificanti.

PhyloCSF confronta le frequenze di sostituzione dei codon (CSF) utilizzando allineamenti nucleotidici multi-specie e modelli filogenetici per rilevare le firme evolutive dei geni che codificano per le proteine. Questo approccio empirico basato su modelli si basa sulla premessa che le proteine sono principalmente conservate a livello di amminoacidi piuttosto che alla sequenza nucleotidica. Pertanto, le sostituzioni di codone sinonimi, che codificano lo stesso amminoacido, o le sostituzioni di codone ad amminoacidi con proprietà conservate (cioè carica, idrofobicità, polarità) sono valutate positivamente, mentre le sostituzioni non sinonimi, comprese le sostituzioni missense e senza senso, ottengono un punteggio negativo. PhyloCSF è addestrato su dati dell'intero genoma e ha dimostrato di essere efficace nel segnare brevi porzioni di una sequenza codificante (CDS) in isolamento dalla sequenza completa, che è necessaria quando si analizzano microproteine o singoli esoni di geni codificanti proteine standard48,49.

In particolare, la recente integrazione degli hub di traccia PhyloCSF nel Genome Browser 49,50,51 dell'Università della California Santa Cruz (UCSC) consente ai ricercatori di ogni provenienza di accedere facilmente a un'interfaccia user-friendly per interrogare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle proteine. Il protocollo descritto di seguito fornisce istruzioni dettagliate su come caricare gli hub di traccia PhyloCSF sul browser del genoma UCSC e successivamente interrogare le regioni genomiche di interesse per sondare le regioni codificanti proteine ad alta confidenza (o la loro mancanza). Inoltre, nel caso in cui si osservi un punteggio PhyloCSF positivo, vengono delineati passaggi per analizzare ulteriormente il potenziale di codifica delle microproteine e generare in modo efficiente allineamenti di più specie delle sequenze di amminoacidi identificate per illustrare la conservazione delle sequenze tra specie. Infine, diverse risorse e strumenti aggiuntivi disponibili pubblicamente sono introdotti nella discussione per esaminare le caratteristiche delle microproteine identificate, comprese le strutture di dominio previste e le informazioni sulla presunta funzione delle microproteine.

Protocollo

Il protocollo descritto di seguito descrive i passaggi per caricare e navigare le tracce del browser PhyloCSF sul browser del genoma UCSC (generato da Mudge et al.49). Per domande generali riguardanti il browser del genoma UCSC, una guida per l'utente del browser Genome completa può essere trovata qui: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.

1. Caricamento dell'hub di traccia PhyloCSF sul browser del genoma UCSC

  1. Aprire una finestra del browser Internet e passare al browser del genoma UCSC (https://genome.ucsc.edu/).
  2. Sotto l'intestazione I nostri strumenti , seleziona l'opzione Traccia hub .
    NOTA: l'opzione Track Hubs si trova anche nella scheda I miei dati .
  3. Nella scheda Hub pubblici digitare PhyloCSF nella casella Termini di ricerca . Fare clic sul pulsante Cerca hub pubblici .
  4. Connettiti a PhyloCSF facendo clic sul pulsante Connetti per il PhyloCSF del nome hub (Descrizione: Potenziale evolutivo di codifica delle proteine misurato da PhyloCSF).
    NOTA: questo Track Hub verrà caricato su numerosi assiemi, tra cui umano (hg19 e hg38) e mouse (mm10 e mm39).
  5. Dopo aver fatto clic su Connetti, attendere di essere reindirizzati alla pagina UCSC Genome Browser Gateway (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway).

2. Navigazione verso i geni di interesse utilizzando gli identificatori genici

  1. Selezionare l'assembly di specie e genoma da interrogare. Per interrogare una specie diversa (ad esempio, il mouse), selezionare la specie di interesse sotto l'intestazione Sfoglia/Seleziona specie facendo clic sull'icona appropriata o digitare la specie nella casella di testo che dice Inserisci specie, nome comune o ID assemblea.
    NOTA: l'assieme è elencato direttamente sotto l'intestazione Trova posizione (Find Position ). In genere, l'impostazione predefinita è l'Assembly umano (ad esempio, dicembre 2009 [GRCh37/hg19]).
  2. Scegliete l'assieme da cercare sotto l'intestazione Trova posizione (Find Position ) utilizzando il menu a discesa.
  3. Inserisci la posizione, il simbolo del gene o i termini di ricerca nella casella Posizione/Termine di ricerca e fai clic su Vai per accedere a un gene di interesse sul Browser del genoma.
  4. Se la ricerca ha portato a più corrispondenze, attendi di essere reindirizzato a una pagina che richiede la selezione di una posizione di interesse. Fare clic sul gene di interesse appropriato.

3. Navigazione verso le regioni genomiche di interesse utilizzando le informazioni di sequenza

  1. Passare al browser del genoma UCSC (https://genome.ucsc.edu/) e selezionare lo strumento di allineamento simile a BLAST (BLAT) sotto l'intestazione I nostri strumenti per interrogare una specifica sequenza di DNA o proteine. In alternativa, passa il cursore sulla scheda Strumenti e seleziona l'opzione Blat o segui questo link: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat.
  2. Seleziona la specie (Genoma) e l'Assemblaggio di interesse utilizzando i menu a discesa.
  3. Definire il tipo di query utilizzando il menu a discesa.
  4. Incollare la sequenza di interesse nella casella di testo BLAT Search Genome e fare clic su Invia.
  5. Fare clic sul collegamento del browser sotto l'intestazione AZIONI per navigare verso la regione genomica di interesse.

4. Identificazione delle sORF conservate utilizzando i dati di traccia PhyloCSF

  1. Scansiona visivamente l'area genomica di interesse per ottenere un punteggio positivo nelle regioni PhyloCSF (Figura 1).
    NOTA: per una spiegazione dettagliata di come interpretare visivamente i punteggi PhyloCSF sul browser del genoma UCSC, vedere la sezione dei risultati rappresentativi di seguito.
  2. Utilizzate la funzione di zoom per ingrandire le regioni di interesse per esaminare le caratteristiche della sequenza e cercare codoni start/stop. Per ingrandire manualmente, tieni premuto il tasto Maiusc e fai clic e tieni premuto il pulsante del mouse mentre trascini lungo l'area di interesse. In alternativa, utilizzare i pulsanti di zoom avanti e indietro nella parte superiore della pagina per navigare (sono disponibili opzioni di zoom 1,5x, 3x, 10x o di base).
    NOTA: Prima di utilizzare i pulsanti di zoom in/zoom out , è necessario riposizionare il gene in modo che la regione di interesse si trovi al centro dello schermo. Per eseguire questa azione, fare clic sull'immagine e trascinarla a sinistra o a destra per spostare la regione genomica orizzontalmente come desiderato o utilizzare le frecce di spostamento nella parte superiore della pagina.
  3. Ingrandire fino a quando la sequenza nucleotidica (base) è visibile.
    NOTA: La sequenza nucleotidica apparirà direttamente sopra il punteggio +1 Smoothed PhyloCSF.
  4. Scansiona visivamente la sequenza nucleotidica vicino all'inizio e alla fine delle regioni PhyloCSF con punteggio positivo per identificare i codoni putativi start (ATG) e stop (TGA / TAA / TAG).
    NOTA: Se il gene di interesse si trova sul filamento meno del DNA, i codoni di inizio e di arresto saranno il complemento inverso (cioè CAT per il codone di partenza e TCA / TTA / CTA per il codone di arresto).

5. Visualizzazione di regioni omologhe in altri genomi

  1. Passa il mouse sopra l'intestazione Visualizza nella parte superiore della pagina e fai clic sull'opzione In altri genomi (Converti ).
  2. Definisci il genoma di interesse utilizzando il menu a discesa sotto l'intestazione Nuovo genoma .
  3. Selezionare l'assemblaggio genomico di interesse utilizzando il menu a discesa sotto l'intestazione Nuovo assemblaggio , quindi fare clic sul pulsante Invia .
  4. Una volta che il browser restituisce un elenco di regioni nel nuovo assieme con somiglianza, fare clic sul collegamento posizione cromosomica per passare alla regione omologica di interesse.
    NOTA: la percentuale di basi totali (nucleotidi) e l'intervallo coperto dalla regione saranno definiti per ogni regione elencata. Maggiore è la percentuale di basi corrispondenti, maggiore è la conservazione per la regione di interesse.
  5. Seguire le stesse strategie di navigazione descritte nella Sezione 4 per analizzare la sequenza.

6. Generazione di allineamenti di sequenze multi-specie per microproteine di interesse

  1. Fare clic sul gene di interesse nella traccia GENCODE sul browser del genoma UCSC (indicato nella Figura 1A con una casella blu) per accedere alla pagina di descrizione del gene.
  2. Sotto l'intestazione Sequenza e collegamenti a strumenti e database , fare clic sul collegamento nella tabella che legge Altre specie FASTA.
  3. Clicca sulle caselle associate alle specie di interesse per selezionarle. Clicca su Invia. Copia e incolla le sequenze visualizzate nella parte inferiore della pagina in formato FASTA in un documento di elaborazione testi.
  4. Aprire una seconda finestra del browser e passare allo strumento Clustal Omega Multiple Sequence Alignment 52 sul sito web dell'Istituto europeo di bioinformatica (EMBL-EBI)53,54: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
  5. Incollare i file di sequenza che si trovano ancora negli Appunti nella casella in STEP 1 che legge le sequenze in qualsiasi formato supportato. Scorri fino in fondo alla pagina e fai clic su Invia. Guarda sotto i risultati allineati (in carattere nero) per i simboli che indicano il grado di conservazione di ciascun amminoacido (i simboli sono definiti nella Tabella 1).
    NOTA: la generazione dell'allineamento potrebbe richiedere alcuni minuti.
  6. Per visualizzare le proprietà degli amminoacidi a colori, fare clic sul collegamento Mostra colori direttamente sopra le sequenze per colorare gli amminoacidi in base alle loro proprietà (definite nella Tabella 2).
  7. Copiare e incollare l'allineamento della sequenza in un programma di elaborazione testi o presentazione per generare un file di figura o illustrazione (ad esempio, Figura 2).
    NOTA: utilizzare un carattere monospaziato per l'allineamento, ad esempio Courier.
  8. Per visualizzare altri output dalla pagina dei risultati di Clustal Omega , fare clic sulle schede appropriate (ad esempio, Albero guida o Albero filogenetico).
  9. Fare clic sulla scheda Visualizzatori risultati per visualizzare le informazioni sulla sequenza utilizzando Jalview, un programma gratuito specializzato in modifica, visualizzazione e analisi dell'allineamento di sequenze multiple55, o per accedere a collegamenti diretti a MView e Simple Phylogeny56.

Risultati

Qui useremo la microproteina convalidata mitoregulina (Mtln) come esempio per dimostrare come un sORF conservato genererà un punteggio PhyloCSF positivo che può essere facilmente visualizzato e analizzato sul browser del genoma UCSC. La mitoregulina è stata precedentemente annotata come RNA non codificante (precedentemente gene umano ID LINC00116 e gene di topo ID 1500011K16Rik). La genomica comparativa e i metodi di analisi della conservazione delle sequenze hanno svolto un ruolo fondamentale nella ...

Discussione

Il protocollo qui presentato fornisce istruzioni dettagliate su come interrogare le regioni genomiche di interesse per il potenziale di codifica delle microproteine utilizzando PhyloCSF sul browser del genoma UCSC 48,49,50,51. Come descritto sopra, PhyloCSF è un potente algoritmo di genomica comparativa che integra modelli filogenetici e frequenze di sostituzione dei codone per identificare le...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (HL-141630 e HL-160569) e della Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
WebsiteWebsite AddressRequirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Toolhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/Web browserMultiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdbhttps://coxpresdb.jpWeb browserProvides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQshttps://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQWeb browserFrequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI),
Tools and Data Resources		https://www.ebi.ac.uk/services/allWeb browserComprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portalhttps://www.expasy.orgWeb browserSuite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Conserved Domain Search		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiWeb browserSearch tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35http://pfam.xfam.orgWeb browserProtein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		Web browserDetailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0Web browserPredicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM - 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0Web browserPrediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Searchhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatWeb browserTool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gatewayhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayWeb browserDirect link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Homehttps://genome.ucsc.edu/Web browserHome website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubsWeb browserDirect link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guidehttps://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.htmlWeb browserComprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORThttps://wolfpsort.hgc.jpWeb browserProtein subcellular localization prediction tool

Riferimenti

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