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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das hier beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Analyse genomischer Regionen von Interesse auf Mikroprotein-kodierendes Potenzial mit PhyloCSF im benutzerfreundlichen UCSC Genome Browser. Darüber hinaus werden mehrere Werkzeuge und Ressourcen empfohlen, um die Sequenzeigenschaften identifizierter Mikroproteine weiter zu untersuchen und Einblicke in ihre mutmaßlichen Funktionen zu erhalten.

Zusammenfassung

Next-Generation-Sequencing (NGS) hat das Gebiet der Genomik vorangetrieben und ganze Genomsequenzen für zahlreiche Tierarten und Modellorganismen hervorgebracht. Trotz dieser Fülle an Sequenzinformationen haben sich umfassende Genannotationsbemühungen als schwierig erwiesen, insbesondere für kleine Proteine. Insbesondere wurden konventionelle Proteinannotationsmethoden entwickelt, um mutmaßliche Proteine absichtlich auszuschließen, die durch kurze offene Leserahmen (sORFs) mit einer Länge von weniger als 300 Nukleotiden kodiert werden, um die exponentiell höhere Anzahl falscher nichtkodierender sORFs im gesamten Genom herauszufiltern. Infolgedessen wurden Hunderte von funktionellen kleinen Proteinen, die Mikroproteine genannt werden (<100 Aminosäuren lang), fälschlicherweise als nicht-kodierende RNAs klassifiziert oder ganz übersehen.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um kostenlose, öffentlich verfügbare bioinformatische Werkzeuge zu nutzen, um genomische Regionen nach Mikroprotein-kodierendem Potenzial auf der Grundlage evolutionärer Konservierung abzufragen. Insbesondere bieten wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Untersuchung der Sequenzerhaltung und des Kodierungspotenzials mit phylogenetischen Codon-Substitutionsfrequenzen (PhyloCSF) im benutzerfreundlichen Genome Browser der University of California Santa Cruz (UCSC). Darüber hinaus beschreiben wir Schritte zur effizienten Generierung mehrerer Speziesausrichtungen identifizierter Mikroproteinsequenzen, um die Erhaltung der Aminosäuresequenz zu visualisieren, und empfehlen Ressourcen zur Analyse von Mikroproteineigenschaften, einschließlich vorhergesagter Domänenstrukturen. Diese leistungsstarken Werkzeuge können verwendet werden, um mutmaßliche Mikroprotein-kodierende Sequenzen in nicht-kanonischen genomischen Regionen zu identifizieren oder das Vorhandensein einer konservierten kodierenden Sequenz mit translationalem Potenzial in einem nicht-kodierenden Transkript von Interesse auszuschließen.

Einleitung

Die Identifizierung des gesamten Satzes kodierender Elemente im Genom ist seit Beginn des Humangenomprojekts ein wichtiges Ziel und bleibt ein zentrales Ziel für das Verständnis biologischer Systeme und die Ätiologie genetisch bedingter Krankheiten 1,2,3,4. Fortschritte in der NGS-Technik haben zur Produktion ganzer Genomsequenzen für eine große Anzahl von Organismen geführt, darunter Wirbeltiere, Wirbellose, Hefen und Pflanzen5. Darüber hinaus haben transkriptionelle Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden die Komplexität des zellulären Transkriptoms weiter aufgedeckt und Tausende neuartiger RNA-Moleküle mit proteinkodierenden und nicht-kodierenden Funktionen identifiziert 6,7. Die Entschlüsselung dieser riesigen Menge an Sequenzinformationen ist ein fortlaufender Prozess, und die Herausforderungen bei umfassenden Genannotationsbemühungenbleiben bestehen 8.

Die jüngste Entwicklung translationaler Profilierungsmethoden, einschließlich Ribosomenprofilierung 9,10 und Polyribosomensequenzierung 11, hat Hinweise darauf geliefert, dass Hunderte von nichtkanonischen Translationsereignissen derzeit unannotierten sORFs im gesamten Genom zugeordnet sind, mit dem Potenzial, kleine Proteine zu erzeugen, die Mikroproteine oder Mikropeptide genannt werden 12,13,14,15,16, 17. Mikroproteine haben sich aufgrund ihrer geringen Größe (<100 Aminosäuren) und des Fehlens klassischer proteinkodierender Geneigenschaften 8,12,18,19,20 bisher von Standard-Genannotationsmethoden übersehen. Mikroproteine wurden in praktisch allen Organismen beschrieben, einschließlich Hefe 21,22, Fliegen 17,23,24 und Säugetieren 25,26,27,28, und es wurde gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle in verschiedenen Prozessen spielen, einschließlich Entwicklung, Stoffwechsel und Stresssignalisierung 19,20,29, 30,31,32,33,34. Daher ist es unerlässlich, das Genom weiterhin nach zusätzlichen Mitgliedern dieser lange übersehenen Klasse funktioneller kleiner Proteine zu durchsuchen.

Trotz der weit verbreiteten Anerkennung der biologischen Bedeutung von Mikroproteinen ist diese Klasse von Genen in Genomannotationen nach wie vor stark unterrepräsentiert, und ihre genaue Identifizierung ist nach wie vor eine ständige Herausforderung, die den Fortschritt auf diesem Gebiet behindert hat. Verschiedene Berechnungswerkzeuge und experimentelle Methoden wurden kürzlich entwickelt, um die Schwierigkeiten zu überwinden, die mit der Identifizierung von Mikroprotein-kodierenden Sequenzen verbunden sind (ausführlich diskutiert in mehreren umfassenden Übersichtsarbeiten 8,35,36,37). Viele neuere Mikroprotein-Identifizierungsstudien 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 haben sich stark auf die Verwendung eines solchen Algorithmus namens PhyloCSF verlassen 48,49 , ein leistungsstarker vergleichender Genomikansatz, der genutzt werden kann, um konservierte proteinkodierende Regionen des Genoms von denen zu unterscheiden, die nicht kodierend sind.

PhyloCSF vergleicht Codon-Substitutionshäufigkeiten (CSF) unter Verwendung von Multispezies-Nukleotid-Alignments und phylogenetischen Modellen, um evolutionäre Signaturen von proteinkodierenden Genen nachzuweisen. Dieser empirische modellbasierte Ansatz beruht auf der Prämisse, dass Proteine in erster Linie auf der Aminosäureebene und nicht auf der Nukleotidsequenz konserviert werden. Daher werden synonyme Codon-Substitutionen, die die gleiche Aminosäure kodieren, oder Codon-Substitutionen zu Aminosäuren mit konservierten Eigenschaften (dh Ladung, Hydrophobie, Polarität) positiv bewertet, während nicht-synonyme Substitutionen, einschließlich Missverständnisse und Unsinnssubstitutionen, negativ abschneiden. PhyloCSF wird auf Daten des gesamten Genoms trainiert und hat sich als wirksam erwiesen, um kurze Teile einer kodierenden Sequenz (CDS) isoliert von der vollständigen Sequenz zu bewerten, was bei der Analyse von Mikroproteinen oder einzelnen Exons von Standardprotein-kodierenden Genenerforderlich ist 48,49.

Insbesondere die jüngste Integration der PhyloCSF-Track-Hubs in den Genome Browser 49,50,51 der University of California Santa Cruz (UCSC) ermöglicht es Ermittlern aller Hintergründe, leicht auf eine benutzerfreundliche Oberfläche zuzugreifen, um genomische Regionen von Interesse nach Proteinkodierungspotenzial abzufragen. Das unten beschriebene Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Laden der PhyloCSF-Track-Hubs im UCSC Genome Browser und zur anschließenden Abfrage genomischer Regionen, die für die Suche nach proteinkodierenden Regionen mit hohem Konfidenzniveau (oder deren Fehlen) von Interesse sind. Darüber hinaus werden in dem Fall, in dem ein positiver PhyloCSF-Score beobachtet wird, Schritte beschrieben, um das mikroproteinkodierende Potenzial weiter zu analysieren und effizient mehrere Speziesausrichtungen der identifizierten Aminosäuresequenzen zu generieren, um die Sequenzerhaltung zwischen den Spezies zu veranschaulichen. Schließlich werden in der Diskussion mehrere zusätzliche öffentlich zugängliche Ressourcen und Werkzeuge vorgestellt, um identifizierte Mikroproteineigenschaften zu untersuchen, einschließlich vorhergesagter Domänenstrukturen und Einblicke in die mutmaßliche Mikroproteinfunktion.

Protokoll

Das unten beschriebene Protokoll beschreibt die Schritte zum Laden und Navigieren in den PhyloCSF-Browserspuren im UCSC Genome Browser (generiert von Mudge et al.49). Für allgemeine Fragen zum UCSC Genome Browser finden Sie hier ein umfangreiches Genome Browser User's Guide: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.

1. Laden des PhyloCSF Track Hubs in den UCSC Genome Browser

  1. Öffnen Sie ein Internetbrowserfenster und navigieren Sie zum UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/).
  2. Wählen Sie unter der Überschrift Unsere Tools die Option Hubs verfolgen aus.
    HINWEIS: Die Option Track Hubs finden Sie auch auf der Registerkarte Meine Daten .
  3. Geben Sie auf der Registerkarte Öffentliche Hubs PhyloCSF in das Feld Suchbegriffe ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffentliche Hubs durchsuchen .
  4. Verbinden Sie sich mit PhyloCSF, indem Sie auf die Schaltfläche Verbinden für den Hub-Namen PhyloCSF klicken (Beschreibung: Evolutionäres proteinkodierendes Potenzial, gemessen von PhyloCSF ).
    HINWEIS: Dieser Track Hub wird auf zahlreiche Baugruppen geladen, einschließlich Mensch (hg19 und hg38) und Maus (mm10 und mm39).
  5. Nachdem Sie auf Verbinden geklickt haben, warten Sie, bis Sie zur UCSC Genome Browser Gateway-Seite (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) weitergeleitet werden.

2. Navigieren zu interessanten Genen mithilfe von Gen-Identifikatoren

  1. Wählen Sie die abzufragende Art und Genomassemblierung aus. Um eine andere Art (z. B. Maus) abzufragen, wählen Sie die gewünschte Art unter der Überschrift " Arten durchsuchen/auswählen" aus, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken, oder geben Sie die Art in das Textfeld " Art, allgemeinen Namen oder Assembly-ID eingeben" ein.
    HINWEIS: Die Baugruppe wird direkt unter der Überschrift Position suchen aufgelistet. In der Regel ist der Standardwert die menschliche Versammlung (z. B. Dez. 2009 [GRCh37/hg19]).
  2. Wählen Sie die zu durchsuchende Baugruppe unter der Überschrift Position suchen mithilfe des Dropdown-Menüs aus.
  3. Geben Sie die Position, das Gensymbol oder die Suchbegriffe in das Feld Position/Suchbegriff ein und klicken Sie auf Gehe zu, um zu einem Gen von Interesse im Genome Browser zu navigieren.
  4. Wenn die Suche zu mehreren Übereinstimmungen geführt hat, warten Sie, bis Sie auf eine Seite umgeleitet werden, die die Auswahl einer interessanten Position erfordert. Klicken Sie auf das entsprechende Gen von Interesse.

3. Navigieren zu genomischen Regionen von Interesse mithilfe von Sequenzinformationen

  1. Navigieren Sie zum UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) und wählen Sie das BLAST-Like Alignment Tool (BLAT) unter der Überschrift Unsere Werkzeuge , um eine bestimmte DNA- oder Proteinsequenz abzufragen. Alternativ können Sie den Mauszeiger über die Registerkarte Extras bewegen und die Option Blat auswählen oder diesem Link folgen: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat.
  2. Wählen Sie die Spezies (Genom) und die Zusammenstellung von Interesse über die Dropdown-Menüs aus.
  3. Definieren Sie den Abfragetyp über das Dropdown-Menü.
  4. Fügen Sie die gewünschte Sequenz in das Textfeld BLAT Search Genome ein und klicken Sie auf Senden.
  5. Klicken Sie auf den Browser-Link unter der Überschrift AKTIONEN , um zu der genomischen Region von Interesse zu navigieren.

4. Identifizierung konservierter sORFs mithilfe von PhyloCSF-Track-Daten

  1. Scannen Sie den genomischen Interessenbereich visuell auf eine positive Bewertung der PhyloCSF-Regionen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Eine detaillierte Erklärung, wie PhyloCSF-Scores im UCSC Genome Browser visuell interpretiert werden können, finden Sie im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" weiter unten.
  2. Verwenden Sie die Zoomfunktion, um Bereiche von Interesse zu vergrößern, um Sequenzmerkmale zu untersuchen und nach Start/Stopp-Codons zu suchen. Um manuell zu zoomen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und klicken und halten Sie die Maustaste gedrückt, während Sie den gewünschten Bereich ziehen. Alternativ können Sie die Schaltflächen "Vergrößern" und "Verkleinern" oben auf der Seite verwenden, um zu navigieren (Optionen für den 1,5-fachen, 3-fachen, 10-fachen oder Basiszoom sind verfügbar).
    HINWEIS: Bevor Sie die Schaltflächen zum Vergrößern / Verkleinern verwenden , ist es notwendig, das Gen so neu zu positionieren, dass sich der interessierende Bereich in der Mitte des Bildschirms befindet. Um diese Aktion auszuführen, klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie es nach links oder rechts, um die genomische Region wie gewünscht horizontal zu verschieben, oder verwenden Sie die Verschiebepfeile oben auf der Seite.
  3. Vergrößern Sie, bis die Nukleotidsequenz (Basensequenz) sichtbar ist.
    HINWEIS: Die Nukleotidsequenz erscheint direkt über dem +1 Smoothed PhyloCSF-Score.
  4. Scannen Sie visuell die Nukleotidsequenz am Anfang und Ende der positiv bewerteten PhyloCSF-Regionen, um mutmaßliche Start- (ATG) und Stopp-Codons (TGA/TAA/TAG) zu identifizieren.
    HINWEIS: Wenn sich das interessierende Gen auf dem Minusstrang der DNA befindet, sind die Start- und Stopp-Codons das umgekehrte Komplement (dh CAT für das Start-Codon und TCA / TTA / CTA für das Stop-Codon).

5. Homologe Regionen in anderen Genomen betrachten

  1. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Überschrift Ansicht oben auf der Seite und klicken Sie auf die Option In anderen Genomen (Konvertieren).
  2. Definieren Sie das Genom von Interesse über das Dropdown-Menü unter der Überschrift Neues Genom.
  3. Wählen Sie im Dropdown-Menü unter der Überschrift Neue Assemblierung die gewünschte genomische Assemblierung aus und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden .
  4. Sobald der Browser eine Liste der Bereiche in der neuen Assembly mit Ähnlichkeit zurückgibt, klicken Sie auf den Link zur Chromosomenposition , um zur homologen Region von Interesse zu navigieren.
    HINWEIS: Der Prozentsatz der Gesamtbasen (Nukleotide) und die Spanne, die von der Region abgedeckt werden, werden für jede aufgeführte Region definiert. Je höher der Prozentsatz der übereinstimmenden Basen ist, desto höher ist die Erhaltung für die Region von Interesse.
  5. Befolgen Sie die gleichen Navigationsstrategien, die in Abschnitt 4 beschrieben sind, um die Sequenz zu analysieren.

6. Generierung von Multispezies-Sequenzausrichtungen für Mikroproteine von Interesse

  1. Klicken Sie auf das Gen von Interesse in der GENCODE-Spur im UCSC Genome Browser (in Abbildung 1A mit einem blauen Kästchen dargestellt), um zur Genbeschreibungsseite zu navigieren.
  2. Klicken Sie unter der Überschrift Sequenz und Links zu Tools und Datenbanken auf den Link in der Tabelle, der die FASTA anderer Arten enthält.
  3. Klicken Sie auf die Kästchen, die mit den interessierenden Arten verknüpft sind, um sie auszuwählen. Klicken Sie auf Senden. Kopieren Sie die Sequenzen, die unten auf der Seite im FASTA-Format angezeigt werden, und fügen Sie sie in ein Textverarbeitungsdokument ein.
  4. Öffnen Sie ein zweites Browserfenster und navigieren Sie zum Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Tool52 auf der Website53,54: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ des European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI).
  5. Fügen Sie die Sequenzdateien, die sich noch in der Zwischenablage befinden, in das Feld in SCHRITT 1 ein, das Sequenzen in einem beliebigen unterstützten Format liest. Scrollen Sie zum Ende der Seite und klicken Sie auf Senden. Unter den ausgerichteten Ergebnissen (in schwarzer Schrift) finden Sie Symbole, die den Erhaltungsgrad jeder Aminosäure angeben (Symbole sind in Tabelle 1 definiert).
    HINWEIS: Es kann einige Minuten dauern, bis die Ausrichtung generiert ist.
  6. Um die Aminosäureeigenschaften in Farbe anzuzeigen, klicken Sie auf den Link Farben anzeigen direkt über den Sequenzen, um die Aminosäuren entsprechend ihren Eigenschaften zu färben (definiert in Tabelle 2).
  7. Kopieren Sie die Sequenzausrichtung und fügen Sie sie in ein Textverarbeitungs- oder Diashowprogramm ein, um eine Abbildungs- oder Illustrationsdatei zu generieren (z. B. Abbildung 2).
    HINWEIS: Verwenden Sie für die Ausrichtung eine Schriftart mit monospaced, z. B. Courier.
  8. Um andere Ausgaben von der Clustal Omega-Ergebnisseite anzuzeigen, klicken Sie auf die entsprechenden Registerkarten (z. B. Guide Tree oder Phylogenetic Tree).
  9. Klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisanzeiger , um Optionen zum Anzeigen der Sequenzinformationen mit Jalview anzuzeigen, einem kostenlosen Programm, das sich auf die Bearbeitung, Visualisierung und Analyse mehrerer Sequenzen spezialisiert hat55, oder um auf direkte Links zu MView und Simple Phylogeny56 zuzugreifen.

Ergebnisse

Hier zeigen wir am Beispiel des validierten Mikroproteins Mitoregulin (Mtln), wie ein konservierter sORF einen positiven PhyloCSF-Score generiert, der im UCSC Genome Browser leicht visualisiert und analysiert werden kann. Mitoregulin wurde zuvor als nicht-kodierende RNA annotiert (früher humane Gen-ID LINC00116 und Maus-Gen-ID 1500011K16Rik). Vergleichende Methoden der Genomik und der Sequenzerhaltungsanalyse spielten eine entscheidende Rolle bei der ersten Entdeckung 40,57,58,59,60,61

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zur Abfrage genomischer Regionen von Interesse für Mikroprotein-kodierendes Potenzial mit PhyloCSF auf dem benutzerfreundlichen UCSC Genome Browser 48,49,50,51. Wie oben beschrieben, ist PhyloCSF ein leistungsstarker vergleichender Genomik-Algorithmus, der phylogenetische Modelle und Codon-Substitutionsfrequenzen inte...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (HL-141630 und HL-160569) und der Cincinnati Children's Research Foundation (Trustee Award) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
WebsiteWebsite AddressRequirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Toolhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/Web browserMultiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdbhttps://coxpresdb.jpWeb browserProvides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQshttps://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQWeb browserFrequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI),
Tools and Data Resources		https://www.ebi.ac.uk/services/allWeb browserComprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portalhttps://www.expasy.orgWeb browserSuite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Conserved Domain Search		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiWeb browserSearch tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35http://pfam.xfam.orgWeb browserProtein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		Web browserDetailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0Web browserPredicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM - 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0Web browserPrediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Searchhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatWeb browserTool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gatewayhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayWeb browserDirect link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Homehttps://genome.ucsc.edu/Web browserHome website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubsWeb browserDirect link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guidehttps://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.htmlWeb browserComprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORThttps://wolfpsort.hgc.jpWeb browserProtein subcellular localization prediction tool

Referenzen

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