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Resumen

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo analizar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar. Además, se recomiendan varias herramientas y recursos para investigar más a fondo las características de secuencia de las microproteínas identificadas para obtener información sobre sus supuestas funciones.

Resumen

La secuenciación de próxima generación (NGS) ha impulsado el campo de la genómica hacia adelante y ha producido secuencias del genoma completo para numerosas especies animales y organismos modelo. Sin embargo, a pesar de esta gran cantidad de información de secuencia, los esfuerzos integrales de anotación de genes han demostrado ser un desafío, especialmente para las proteínas pequeñas. En particular, los métodos convencionales de anotación de proteínas se diseñaron para excluir intencionalmente las proteínas putativas codificadas por marcos de lectura abiertos cortos (sORF) de menos de 300 nucleótidos de longitud para filtrar el número exponencialmente mayor de sORFs espurios no codificantes en todo el genoma. Como resultado, cientos de pequeñas proteínas funcionales llamadas microproteínas (<100 aminoácidos de longitud) se han clasificado incorrectamente como ARN no codificantes o se han pasado por alto por completo.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para aprovechar las herramientas bioinformáticas gratuitas y disponibles públicamente para consultar las regiones genómicas en busca de potencial de codificación de microproteínas basado en la conservación evolutiva. Específicamente, proporcionamos instrucciones paso a paso sobre cómo examinar la conservación de la secuencia y el potencial de codificación utilizando frecuencias de sustitución de codones filogenéticos (PhyloCSF) en el navegador del genoma fácil de usar de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC). Además, detallamos los pasos para generar de manera eficiente alineaciones de múltiples especies de secuencias de microproteínas identificadas para visualizar la conservación de la secuencia de aminoácidos y recomendamos recursos para analizar las características de las microproteínas, incluidas las estructuras de dominio predichas. Estas poderosas herramientas se pueden utilizar para ayudar a identificar secuencias supuestas de codificación de microproteínas en regiones genómicas no canónicas o para descartar la presencia de una secuencia de codificación conservada con potencial de traducción en una transcripción no codificante de interés.

Introducción

La identificación del conjunto completo de elementos codificantes en el genoma ha sido un objetivo importante desde el inicio del Proyecto Genoma Humano, y sigue siendo un objetivo central hacia la comprensión de los sistemas biológicos y la etiología de las enfermedades de base genética 1,2,3,4. Los avances en las técnicas ngs han llevado a la producción de secuencias del genoma completo para un gran número de organismos, incluidos vertebrados, invertebrados, levaduras y plantas5. Además, los métodos de secuenciación transcripcional de alto rendimiento han revelado aún más la complejidad del transcriptoma celular e identificado miles de nuevas moléculas de ARN con funciones codificantes y no codificantesde proteínas 6,7. La decodificación de esta gran cantidad de información de secuencia es un proceso continuo, y siguen existiendo desafíos con los esfuerzos integrales de anotaciónde genes 8.

El reciente desarrollo de métodos de perfiles traslacionales, incluidos el perfil de ribosomas 9,10 y la secuenciación de poli ribosomas11, han proporcionado evidencia que indica que cientos de eventos de traducción no canónica se asignan a sORF actualmente no anotados en todo el genoma, con el potencial de generar pequeñas proteínas llamadas microproteínas o micropéptidos 12,13,14,15,16, 17. Las microproteínas han surgido como una nueva clase de proteínas versátiles previamente pasadas por alto por los métodos estándar de anotación de genes debido a su pequeño tamaño (<100 aminoácidos) y la falta de características clásicas de genes codificantes de proteínas 8,12,18,19,20. Las microproteínas se han descrito en prácticamente todos los organismos, incluyendo la levadura21,22, las moscas 17,23,24 y los mamíferos 25,26,27,28, y se ha demostrado que desempeñan un papel crítico en diversos procesos, incluyendo el desarrollo, el metabolismo y la señalización de estrés 19,20,29, 30,31,32,33,34. Por lo tanto, es imperativo continuar extrayendo el genoma para miembros adicionales de esta clase de proteínas pequeñas funcionales que se han pasado por alto durante mucho tiempo.

A pesar del reconocimiento generalizado de la importancia biológica de las microproteínas, esta clase de genes sigue estando muy poco representada en las anotaciones del genoma, y su identificación precisa sigue siendo un desafío continuo que ha obstaculizado el progreso en el campo. Recientemente se han desarrollado varias herramientas computacionales y métodos experimentales para superar las dificultades asociadas con la identificación de secuencias codificantes de microproteínas (discutidas ampliamente en varias revisiones exhaustivas 8,35,36,37). Muchos estudios recientes de identificación de microproteínas 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 se han basado en gran medida en el uso de uno de estos algoritmos llamado PhyloCSF 48,49 , un poderoso enfoque de genómica comparativa que se puede aprovechar para distinguir las regiones codificantes de proteínas conservadas del genoma de las que no codifican.

PhyloCSF compara las frecuencias de sustitución de codones (CSF) utilizando alineaciones de nucleótidos de múltiples especies y modelos filogenéticos para detectar firmas evolutivas de genes codificantes de proteínas. Este enfoque empírico basado en modelos se basa en la premisa de que las proteínas se conservan principalmente a nivel de aminoácidos en lugar de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, las sustituciones de codones sinónimos, que codifican el mismo aminoácido, o las sustituciones de codones a aminoácidos con propiedades conservadas (es decir, carga, hidrofobicidad, polaridad) se puntúan positivamente, mientras que las sustituciones no sinónimas, incluidas las sustituciones sin sentido y sin sentido, puntúan negativamente. PhyloCSF está entrenado en datos de genoma completo y ha demostrado ser eficaz para puntuar porciones cortas de una secuencia codificante (CDS) aisladamente de la secuencia completa, lo cual es necesario cuando se analizan microproteínas o exones individuales de genes codificantes de proteínas estándar48,49.

En particular, la reciente integración de los centros de seguimiento de PhyloCSF en el Genome Browser 49,50,51 de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC) permite a los investigadores de todos los orígenes acceder fácilmente a una interfaz fácil de usar para consultar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de proteínas. El protocolo que se describe a continuación proporciona instrucciones detalladas sobre cómo cargar los centros de seguimiento de PhyloCSF en el UcSC Genome Browser y, posteriormente, interrogar las regiones genómicas de interés para sondear las regiones codificantes de proteínas de alta confianza (o la falta de ellas). Además, en el caso de que se observe una puntuación positiva de PhyloCSF, se delinean pasos para analizar más a fondo el potencial de codificación de microproteínas y generar de manera eficiente alineaciones de múltiples especies de las secuencias de aminoácidos identificadas para ilustrar la conservación de secuencias entre especies. Por último, en la discusión se introducen varios recursos y herramientas adicionales disponibles públicamente para estudiar las características de las microproteínas identificadas, incluidas las estructuras de dominio predichas y la comprensión de la supuesta función de las microproteínas.

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Protocolo

El protocolo que se describe a continuación detalla los pasos para cargar y navegar por las pistas del navegador PhyloCSF en el UCSC Genome Browser (generado por Mudge et al.49). Para preguntas generales sobre el UCSC Genome Browser, se puede encontrar una extensa Guía del usuario de Genome Browser aquí: https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html.

1. Carga del PhyloCSF Track Hub en el ucsc genome browser

  1. Abra una ventana del navegador de Internet y navegue hasta el UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/).
  2. En el encabezado Nuestras herramientas , seleccione la opción Centros de seguimiento .
    NOTA: La opción Centros de seguimiento también se puede encontrar en la pestaña Mis datos .
  3. En la pestaña Centros públicos , escriba PhyloCSF en el cuadro Términos de búsqueda . Haga clic en el botón Buscar centros públicos .
  4. Conéctese a PhyloCSF haciendo clic en el botón Conectar para el nombre del concentrador PhyloCSF (Descripción: Potencial evolutivo de codificación de proteínas medido por PhyloCSF).
    NOTA: Este track hub se cargará en numerosos conjuntos, incluidos humanos (hg19 y hg38) y ratones (mm10 y mm39).
  5. Después de hacer clic en conectar, espere a ser redirigido a la página UCSC Genome Browser Gateway (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway).

2. Navegación a genes de interés utilizando identificadores de genes

  1. Seleccione la especie y el ensamblaje del genoma que desea consultar. Para consultar una especie diferente (por ejemplo, ratón), seleccione la especie de interés en el encabezado Examinar/Seleccionar especies haciendo clic en el icono correspondiente, o escriba la especie en el cuadro de texto que dice: Introduzca especies, nombre común o ID de conjunto.
    NOTA: El conjunto aparece directamente en el encabezado Buscar posición . Normalmente, el valor predeterminado es la Asamblea Humana (por ejemplo, diciembre de 2009 [GRCh37/hg19]).
  2. Elija el conjunto que desea buscar en el encabezado Buscar posición mediante el menú desplegable.
  3. Ingrese la posición, el símbolo del gen o los términos de búsqueda en el cuadro Posición / Término de búsqueda y haga clic en Ir para navegar a un gen de interés en el Navegador del genoma.
  4. Si la búsqueda dio lugar a varias coincidencias, espere a ser redirigido a una página que requiera la selección de una posición de interés. Haga clic en el gen apropiado de interés.

3. Navegar a las regiones genómicas de interés utilizando información de secuencia

  1. Navegue hasta el UCSC Genome Browser (https://genome.ucsc.edu/) y seleccione la herramienta de alineación blast-like (BLAT) en el encabezado Nuestras herramientas para consultar una secuencia específica de ADN o proteína. Alternativamente, coloque el cursor sobre la pestaña Herramientas y seleccione la opción Blat o siga este enlace: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat.
  2. Seleccione la especie (Genoma) y el Ensamblaje de interés utilizando los menús desplegables.
  3. Defina el tipo de consulta mediante el menú desplegable.
  4. Pegue la secuencia de interés en el cuadro de texto Genoma de búsqueda blaT y haga clic en Enviar.
  5. Haga clic en el enlace del navegador debajo del encabezado ACCIONES para navegar a la región genómica de interés.

4. Identificación de sORF conservados utilizando datos de seguimiento de PhyloCSF

  1. Escanee visualmente el área genómica de interés para calificar positivamente las regiones PhyloCSF (Figura 1).
    NOTA: Para obtener una explicación detallada de cómo interpretar visualmente las puntuaciones de PhyloCSF en el UCSC Genome Browser, consulte la sección de resultados representativos a continuación.
  2. Utilice la función de zoom para ampliar las regiones de interés para examinar las características de la secuencia y buscar codones de inicio/parada. Para acercar manualmente, mantenga presionada la tecla Mayús y mantenga presionado el botón del mouse mientras arrastra a lo largo de la región de interés. Alternativamente, use los botones de acercar y alejar en la parte superior de la página para navegar (las opciones de zoom 1.5x, 3x, 10x o base están disponibles).
    NOTA: Antes de usar los botones de zoom in/zoom out , es necesario reposicionar el gen para que la región de interés esté en el centro de la pantalla. Para realizar esta acción, haga clic en la imagen y arrástrela hacia la izquierda o hacia la derecha para mover la región genómica horizontalmente como desee o use las flechas de movimiento en la parte superior de la página.
  3. Amplíe el zoom hasta que la secuencia de nucleótidos (base) sea visible.
    NOTA: La secuencia de nucleótidos aparecerá directamente encima de la puntuación +1 Smoothed PhyloCSF.
  4. Escanee visualmente la secuencia de nucleótidos cerca del principio y el final de las regiones PhyloCSF con puntuación positiva para identificar los codones de inicio y parada putativos (TGA / TAA / TAG).
    NOTA: Si el gen de interés está en la cadena menos de ADN, los codones de inicio y parada serán el complemento inverso (es decir, CAT para el codón de inicio y TCA / TTA / CTA para el codón de parada).

5. Visualización de regiones homólogas en otros genomas

  1. Pase el mouse sobre el encabezado Ver en la parte superior de la página y haga clic en la opción En otros genomas (Convertir ).
  2. Defina el genoma de interés utilizando el menú desplegable debajo del encabezado Nuevo genoma .
  3. Seleccione el conjunto genómico de interés mediante el menú desplegable situado en el encabezado Nuevo conjunto y , a continuación, haga clic en el botón Enviar .
  4. Una vez que el navegador devuelva una lista de regiones en el nuevo ensamblado con similitud, haga clic en el enlace de posición cromosómica para navegar a la región homóloga de interés.
    NOTA: El porcentaje de bases totales (nucleótidos) y el lapso que cubre la región se definirán para cada región enumerada. Cuanto mayor sea el porcentaje de bases coincidentes, mayor será la conservación para la región de interés.
  5. Siga las mismas estrategias de navegación detalladas en la Sección 4 para analizar la secuencia.

6. Generación de alineaciones de secuencias multiespecies para microproteínas de interés

  1. Haga clic en el gen de interés en la pista GENCODE en el UCSC Genome Browser (indicado en la Figura 1A con un cuadro azul) para navegar a la página de descripción del gen.
  2. En el encabezado Secuencia y enlaces a herramientas y bases de datos , haga clic en el enlace de la tabla que dice Otras especies FASTA.
  3. Haga clic en las casillas asociadas a las especies de interés para seleccionarlas. Haga clic en Enviar. Copie y pegue las secuencias que aparecen en la parte inferior de la página en formato FASTA en un documento de procesamiento de textos.
  4. Abra una segunda ventana del navegador y navegue hasta la herramienta Clustal Omega Multiple Sequence Alignment 52 en el sitio web del Instituto Europeo de Bioinformática (EMBL-EBI)53,54: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
  5. Pegue los archivos de secuencia que todavía están en el portapapeles en el cuadro del STEP 1 que lee secuencias en cualquier formato compatible. Desplácese hasta la parte inferior de la página y haga clic en Enviar. Mire debajo de los resultados alineados (en fuente negra) los símbolos que indican el grado de conservación de cada aminoácido (los símbolos se definen en la Tabla 1).
    NOTA: Puede tardar varios minutos en generar la alineación.
  6. Para ver las propiedades de los aminoácidos en color, haga clic en el enlace Mostrar colores directamente encima de las secuencias para colorear los aminoácidos de acuerdo con sus propiedades (definidas en la Tabla 2).
  7. Copie y pegue la alineación de la secuencia en un programa de procesamiento de textos o presentación de diapositivas para generar una figura o un archivo de ilustración (por ejemplo, la Figura 2).
    NOTA: Utilice una fuente monoespaciada para la alineación, como Courier.
  8. Para ver otros resultados de la página de resultados de Clustal Omega , haga clic en las pestañas correspondientes (es decir, Árbol guía o Árbol filogenético).
  9. Haga clic en la pestaña Visores de resultados para ver las opciones para ver la información de la secuencia utilizando Jalview, un programa gratuito que se especializa en la edición, visualización y análisis de alineación de secuencias múltiples55, o para acceder a enlaces directos a MView y Simple Phylogeny56.

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Resultados

Aquí usaremos la microproteína mitoregulina validada (Mtln) como ejemplo para demostrar cómo un sORF conservado generará una puntuación PhyloCSF positiva que se puede visualizar y analizar fácilmente en el UCSC Genome Browser. La mitoregulina se anotó previamente como un ARN no codificante (anteriormente ID del gen humano LINC00116 y ID del gen de ratón 1500011K16Rik). La genómica comparativa y los métodos de análisis de conservación de secuencias desempeñaron un papel crítico en su descub...

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Discusión

El protocolo presentado aquí proporciona instrucciones detalladas sobre cómo interrogar las regiones genómicas de interés para el potencial de codificación de microproteínas utilizando PhyloCSF en el navegador del genoma UCSC fácil de usar 48,49,50,51. Como se detalló anteriormente, PhyloCSF es un poderoso algoritmo de genómica comparativa que integra modelos filogenéticos y frecuenci...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (HL-141630 y HL-160569) y la Fundación de Investigación Infantil de Cincinnati (Premio Del Fideicomisario).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
WebsiteWebsite AddressRequirements
Clustal Omega Multiple Sequence Alignment Toolhttps://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/Web browserMultiple sequence alignment program for the efficient alignment of FASTA sequences (i.e. for cross-species comparison of identified microproteins)
COXPRESSdbhttps://coxpresdb.jpWeb browserProvides co-regulated gene relationships to estimate gene functions
EMBL-EBI Bioinformatics Tools FAQshttps://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQWeb browserFrequently Asked Questions (FAQs) for EMBL-EBI tools. Includes the color coding key for protein sequence alignments
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI),
Tools and Data Resources		https://www.ebi.ac.uk/services/allWeb browserComprehensive list of freely available websites, tools and data resources
Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portalhttps://www.expasy.orgWeb browserSuite of bioinformatic tools and resources for protein sequence analysis that is maintained by the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)
National Center for Biotechnology Information (NCBI)
Conserved Domain Search		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgiWeb browserSearch tool to identify conserved domains within protein or coding nucleotide sequences
Pfam 35http://pfam.xfam.orgWeb browserProtein family (Pfam) database, provides alignments and classification of protein families and domains
PhyloCSF Track Hub Description https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q
edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10
&c=chr2&g=hub_109801_
PhyloCSF_smooth		Web browserDetailed description of the Smoothed PhyloCSF tracks and PhyloCSF Track Hub
   
   
   
   
   
SignalP 6.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0Web browserPredicts the presence of signal peptides and the location of their cleavage sites
TMHMM - 2.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0Web browserPrediction of transmembrane helices in proteins
UCSC Genome Browser BLAT Searchhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatWeb browserTool used to find genomic regions using DNA or protein sequence information
UCSC Genome Browser Gatewayhttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGatewayWeb browserDirect link to the UCSC Genome Browser Gateway
UCSC Genome Browser Homehttps://genome.ucsc.edu/Web browserHome website for the UCSC Genome Browser
UCSC Genome Browser Track Data Hubshttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubsWeb browserDirect link to Track Data Hubs/Public Hubs database to search for and load the PhyloCSF Tracks
UCSC Genome Browser User Guidehttps://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.htmlWeb browserComprehensive user guide detailing how to navigate the UCSC Genome Browser
WoLF PSORThttps://wolfpsort.hgc.jpWeb browserProtein subcellular localization prediction tool

Referencias

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