用于组织工程应用的尺寸控制和无乳化壳聚糖 -染料木酚微凝胶的制备

摘要

本方案描述了一种基于非乳液的壳聚糖-杰尼平微凝胶的制造方法。这些微凝胶的大小可以精确控制，它们可以显示pH依赖性肿胀， 在体内降解，并加载治疗分子，这些分子会随着时间的推移而持续释放，使其与组织工程应用高度相关。

摘要

壳聚糖微凝胶因其应用广泛，成本低廉和免疫原性而在组织工程中引起了人们的极大兴趣。然而，壳聚糖微凝胶通常使用需要有机溶剂冲洗的乳液方法制造，这些方法有毒且对环境有害。本方案提出了一种快速，无细胞毒性，非乳液的方法，用于制造壳聚糖 - 京尼平微凝胶，而无需有机溶剂冲洗。这里描述的微凝胶可以通过精确的尺寸控制来制造。它们表现出生物分子的持续释放，使其与组织工程，生物材料和再生医学高度相关。壳聚糖与京尼平交联形成水凝胶网络，然后通过注射器过滤器产生微凝胶。微凝胶可以被过滤以产生一系列尺寸，并且它们显示出pH依赖性肿胀并随着时间的推移而酶降解。这些微凝胶已被用于大鼠生长板损伤模型，并被证明可以促进软骨组织修复增加， 并在体内28天显示完全降解。由于其低成本，高便利性和易于用细胞相容性材料制造，这些壳聚糖微胶囊在组织工程中呈现出令人兴奋和独特的技术。

引言

生长板，也称为骨架，是位于长骨末端的软骨结构，介导儿童的生长。如果生长板受伤，可以形成称为"骨棒"的修复组织，这会中断正常生长并可能导致生长缺陷或角畸形。流行病学数据显示，所有儿童骨骼损伤中有15%-30%与生长板有关。骨条形成发生在高达30%的这些损伤中，使得生长板损伤及其相关治疗成为一个重要的临床表现问题^{1，2，3，4}。当发生骨棒形成时，最常见的治疗途径包括切除骨棒并插入介位材料，例如硅或脂肪组织⁵。然而，接受骨筋切除手术的患者通常对完全康复的预后较差，因为目前没有治疗方法可以完全修复受损的生长板^6，7，8。鉴于这些缺点，迫切需要有效的策略来治疗生长板损伤，无论是在防止骨棒的形成还是再生健康的骨骼软骨组织方面。

水凝胶微粒或微凝胶最近作为可注射支架引起了人们的兴趣，可以提供持续释放的治疗药物⁹。由于其高可调谐性和生物相容性，微凝胶也非常适合生物活性因子或细胞包封。微凝胶可以由各种材料制成，从合成聚合物（如聚乙二醇（PEG））到天然聚合物，如海藻酸盐或壳聚糖^10，11，12。壳聚糖已被证明对组织工程具有几种有益作用，例如其破坏革兰氏阴性菌外膜稳定性的能力，从而提供固有的抗菌活性^13，14。此外，壳聚糖具有成本效益，细胞相互作用，并且易于使用其含胺结构进行修饰。基于壳聚糖的微凝胶有望为药物递送和材料信号传导提供一种生物材料策略，可以促进组织再生，同时防止细菌感染。然而，壳聚糖微凝胶通常使用各种技术制造，需要特殊设备，乳液技术或细胞毒性溶剂冲洗。例如，一些研究已经用基于乳液的方法制造了壳聚糖微凝胶，但这些方案需要溶剂冲洗和细胞毒联剂，这可能会否定它们对临床环境的转化^15，16。其他研究已经使用微流体或电喷雾方法来制造壳聚糖微凝胶，这需要特殊的设备，制备和培训^17，18。壳聚糖微凝胶通常也通过交联剂滴加成壳聚糖溶液的过程制成;然而，该方法高度依赖于溶液粘度、聚合物浓度和流速，使得难以控制微凝胶^19，20的大小和分散度。相反，本文中描述的微凝胶制造方法不需要专门的设备或溶剂冲洗，使得这些微凝胶几乎可以在任何实验室或环境中进行制造。因此，这些微凝胶代表了高度相关的生物材料，可为许多应用提供快速，经济高效且易于生产的药物输送载体。

通过调节微凝胶的组成和材料特性，研究人员可以精确控制细胞微环境，从而以材料依赖性的方式指导细胞行为。微凝胶可以单独使用或与本体生物材料系统结合使用，以赋予特定的功能，例如生物活性因子的延长释放或天然或外源性细胞的精确特殊信号传导。生物材料和微凝胶已成为生长板损伤的有吸引力的治疗途径。已经投入了大量精力来开发基于海藻酸盐和壳聚糖的生物材料，以治疗生长板损伤^{21，22，23，24，25}。由于生长板骨化和骨伸长的动态时间性质，骨条形成的机制尚不完全清楚。因此，已经开发了几种动物模型来更好地阐明软骨内骨化和骨条形成的机制，例如在大鼠，兔子和绵羊中^26，27，28。一个这样的模型是大鼠生长板损伤模型，其利用大鼠胫骨中的钻孔缺陷以可预测和可重复的方式产生骨条，并在生长板^29，30的所有三个区域模拟人类损伤。已经使用该模型测试了几种基于生物材料的治疗生长板损伤的策略。此外，已经开发了两种不同的制备壳聚糖微凝胶的方法，其可用作可注射的生物材料系统，其以持续的方式释放治疗药物^10，31。这些微凝胶已被用于大鼠生理损伤模型，并且在释放SDF-1a和TGF-b3时显示软骨再生³¹ 有所改善。该协议中提供的技术描述了为制造这些壳聚糖微凝胶而开发的方法，然后可以将其用于各种组织工程应用。例如，最近的研究已经使用热或洋红色响应的壳聚糖微凝胶用于受控肿瘤药物递送应用^32，33。

研究方案

所有动物程序均由科罗拉多大学丹佛机构动物护理和使用委员会批准。6周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠用于本研究。大鼠生长板损伤模型是在先前发表的报告³⁰之后创建的。

1. 壳聚糖聚合物的制备

1. 从市售来源获得纯化和冻干的低分子量（LMW）壳聚糖（参见 材料表）。
2. 向1升烧杯中加入495 mL双蒸馏水（ddH₂O）和搅拌棒。加入5克壳聚糖（步骤1.1）并充分混合。
   注意:壳聚糖在生理pH下仅微溶于水溶液，因此壳聚糖在此步骤中不易溶解。
3. 向上述制备的壳聚糖溶液中加入5mL冰醋酸。
4. 以300rpm搅拌18小时，将烧杯置于保持在50°C的水浴中。
5. 使用 Büchner 烧瓶和漏斗，通过减小滤纸尺寸（22 μm、8 μm 和 2.7 μm）来过滤壳聚糖溶液（参见 材料表）。
6. 将过滤后的壳聚糖溶液加入纤维素透析管中（见 材料表），并在室温下以ddH₂O透析4天，每天更换ddH₂O。
   注意:最后一次更换时使用超纯 ddH₂O 水。
7. 将透析的壳聚糖溶液转移到烧杯中，并使用1M NaOH将pH调节至8.0。
8. 将壳聚糖等分到离心管中，并在室温下以4000× g 离心5分钟。
9. 将上清液倾析到废物流中，并将壳聚糖重悬于ddH₂O中，重复2倍。
10. 冷冻，然后冻干壳聚糖沉淀。
    1. 每天，取出冻干产物并记录质量。
       注意:当冻干产品的质量不再变化时，产品完全干燥，可以在-20°C下储存直至准备使用。

2. 壳聚糖水凝胶的制备

1. 将2mL 6%乙酸和120mg纯化壳聚糖（步骤1）加入10mL鲁尔锁注射器中，形成6%w / v壳聚糖溶液。
2. 使用母母鲁尔锁定连接器将鲁尔锁定注射器连接到另一个相同的注射器，并来回混合溶液30秒，或直到壳聚糖完全溶解在乙酸中。
3. 在交联之前，将任何治疗或生物活性剂添加到壳聚糖溶液中（如果需要）。对于本研究，在微凝胶中添加了200ng的SDF-1a和TGF-b3（参见 材料表）。
   注意:SDF-1a和TGF-b3是与生长板组织再生相关的生物活性剂。SDF-1a促进间充质干细胞向缺陷部位的迁移，TGF-b3作为软骨成因因子诱导这些干细胞沿着软骨系³¹分化。
   注意:在注射器之间再次混合壳聚糖以完全结合治疗。
4. 在100%乙醇中制备100mM京尼平的储备交联剂溶液（见 材料表）。
5. 将100μL制备的京尼平溶液（步骤2.4.）加入含壳聚糖的注射器中，并在注射器之间来回混合30秒。
6. 将混合物从注射器中挤出到35mm培养皿中，用石蜡膜覆盖，并在37°C下在加湿气氛中孵育过夜。
   注意:溶液将变成深蓝色，表明壳聚糖和吉尼平之间发生了交联反应，导致壳聚糖微凝胶的形成。
7. 按照以下步骤过滤制备的壳聚糖微凝胶。
   1. 用刮刀轻轻地将水凝胶破碎成更小的块。
      注意:这些碎片应足够小，可以转移到直径约1-2厘米的10 mL注射器的背面。
   2. 将所需网孔尺寸的过滤器放入干净的10 mL注射器的背面。
      注意:微凝胶的典型尺寸范围在50-200μm之间。
   3. 将破碎的凝胶片转移到装有过滤器的注射器中，并加入6 mL ddH₂O。
      注意:壳聚糖凝胶在水性介质中会显着膨胀，因此预计凝胶体积会发生很大变化。
   4. 通过鲁尔锁定连接器将注射器连接到另一个干净的 10 mL 注射器。
   5. 用过滤器将凝胶+水混合物通过注射器，以产生具有指定最大直径的微凝胶。
      1. 第一次过滤后，打开装有过滤器的注射器的背面，并将混合物挤出回该注射器中。
      2. 更换注射器的背面，再次迫使混合物通过过滤器。
      3. 重复过滤5-6次或直到通过过滤器的阻力很小。
8. 冲洗并纯化过滤后的微凝胶。
   1. 将过滤后的凝胶混合物转移到50 mL锥形管中，使总体积达到20 mL，ddH₂O，然后涡旋混合物以确保均匀分散。
   2. 在室温下以100× g 离心微凝胶5分钟，并倾析上部水相。
   3. 将微凝胶重悬于10mL 70%乙醇中，涡旋，并在紫外线下放置1小时以灭菌。
   4. 在室温下以1，000× g 离心微凝胶5分钟，弃去乙醇，并用ddH₂O冲洗3倍。

3. 用于 体外 或 体内 应用的微凝胶制备

注意:对于本研究，在大鼠模型中研究了生长板损伤中的软骨再生。有关详细信息，请参阅参考文献³¹。

1. 将微凝胶沉淀以1:1重悬于ddH₂O.微凝胶可以在4°C下在ddH₂O中储存长达1个月。 如果使用生物活性剂，必须立即使用微凝胶。
2. 按照先前发布的报告在动物中创建损伤部位³⁰。
3. 用盐水冲洗损伤部位，使动物未经治疗（用于对照研究）或仅注射壳聚糖微凝胶或装载有生物活性剂的微胶囊（步骤3.2）。
4. 关闭动物的伤口并施用术后镇痛药³⁰。
5. 在手术后第7天或第28天，通过CO₂ 过量对大鼠实施安乐死，切除四肢并进行组织学检查以评估损伤部位³¹的组织修复。

结果

壳聚糖微凝胶的成功制造依赖于吉尼平和壳聚糖之间的交联反应，特别是涉及壳聚糖聚合物链上的胺。与其他微凝胶制造技术相比，该方法不需要乳液或溶剂冲洗，并且可以使用廉价的设备快速轻松地进行。成功制备微凝胶的一个标志性指标是在壳聚糖和吉尼平混合后从灰白色到深蓝色的明显颜色变化。京尼平与含胺化合物，如壳聚糖或其它蛋白质之间的交联反应，在文献³⁴中?...

讨论

近年来，微凝胶因其对各种用途的高度适用性（例如药物递送或细胞包封^）而得到了广泛的研究 9.微尺度生物材料构建体的易于制造在组织工程中具有重要意义，因为它允许研究人员在特定尺寸和时间尺度上开发基于水凝胶的策略。然而，大多数制造壳聚糖微凝胶的方法需要昂贵的设备和试剂，乳液或细胞毒性溶剂冲洗，这阻止了它们转化为临床用途^15，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh