조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

요약

본 프로토콜은 키토산-제니핀 마이크로겔의 제조를 위한 비에멀젼 기반 방법을 기술한다. 이러한 마이크로겔의 크기는 정밀하게 조절할 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 표시하고, 생체내에서 분해되며, 시간이 지남에 따라 지속적으로 방출되는 치료 분자로 로딩될 수 있어 조직 공학 응용에 매우 적합합니다.

초록

키토산 마이크로젤은 광범위한 응용, 저비용 및 면역원성으로 인해 조직 공학에 상당한 관심을 받고 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤은 일반적으로 독성이 강하고 환경에 해로운 유기 용매 헹굼이 필요한 에멀젼 방법을 사용하여 제조됩니다. 본 프로토콜은 유기 용매 린스없이 키토산-제니핀 마이크로겔을 제조하기 위한 신속하고, 세포독성이 없는, 비에멀젼-기반 방법을 제시한다. 본원에 기재된 마이크로겔은 정밀한 크기 조절을 통해 제조될 수 있다. 그들은 생체 분자의 지속적인 방출을 나타내므로 조직 공학, 생체 재료 및 재생 의학과 매우 관련이 있습니다. 키토산은 제니핀과 가교되어 하이드로겔 네트워크를 형성하고, 이어서 주사기 필터를 통과시켜 마이크로겔을 생성한다. 마이크로겔은 여과되어 다양한 크기를 만들 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 나타내며 시간이 지남에 따라 효소적으로 분해됩니다. 이들 마이크로겔은 래트 성장 플레이트 손상 모델에 사용되었으며, 증가된 연골 조직 수복을 촉진하고 생체내에서 28일째에 완전한 분해를 나타내는 것으로 입증되었다. 저렴한 비용, 높은 편의성 및 세포 적합성 재료로 쉽게 제조 할 수 있기 때문에이 키토산 마이크로 젤은 조직 공학에서 흥미롭고 독특한 기술을 제시합니다.

서문

physis라고도 알려진 성장 판은 어린이의 성장을 매개하는 긴 뼈의 끝에 위치한 연골 구조입니다. 성장 플레이트가 손상되면 "뼈 막대"로 알려진 복구 조직이 형성 될 수 있으며, 이는 정상적인 성장을 방해하고 성장 결함이나 각형 기형을 유발할 수 있습니다. 역학 자료에 따르면 모든 어린 시절의 골격 손상의 15 % -30 %가 성장판과 관련이 있습니다. 보니 바 형성은 이러한 부상의 최대 30 %에서 발생하며, 성장 판 손상 및 관련 치료를 중요한 임상 징후 문제 ^1,2,3,4로 만듭니다. 뼈 막대 형성이 발생할 때, 가장 일반적인 치료 방법은 뼈 막대를 절제하고 실리콘 또는 지방 조직과 같은 삽입 물질을 삽입하는 것을 포함한다⁵. 그러나, 뼈 바 절제술 수술을 받는 환자들은 현재 부상당한 성장판^6,7,8을 완전히 복구할 수 있는 치료법이 없기 때문에 완전한 회복을 위한 예후가 좋지 않은 경우가 ^많다. 이러한 단점에 비추어 볼 때, 뼈 막대의 형성을 방지하고 건강한 피씰 연골 조직을 재생시키는 데 모두 성장 판 부상을 치료하기위한 효과적인 전략이 절실히 필요합니다.

하이드로겔 마이크로입자, 또는 마이크로겔은 최근 치료제⁹의 지속적인 방출을 제공할 수 있는 주사용 스캐폴드로서 주목을 받고 있다. 높은 튜닝 가능성과 생체 적합성으로 인해 마이크로 젤은 생리 활성 인자 또는 세포 캡슐화에도 적합합니다. 마이크로겔은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 합성 중합체에서부터 알지네이트 또는 키토산^10,11,12와 같은 천연 중합체에 이르기까지 다양한 물질로 제조될 수 있다. 키토산은 그람 음성 박테리아의 외막을 불안정하게 하는 능력과 같은 조직 공학에 몇 가지 유익한 효과가 있는 것으로 밝혀져 있으며, 이로써 내재된 항균 활성^{1 3,14}를 제공한다. 추가적으로, 키토산은 비용 효율적이고, 세포-상호작용적이며, 아민 함유 구조를 사용하여 쉽게 변형된다. 키토산 기반 마이크로젤은 박테리아 감염을 예방하면서 조직 재생을 촉진할 수 있는 약물 전달 및 물질 신호전달을 위한 생체재료 전략을 약속합니다. 그러나, 키토산 마이크로겔은 종종 특별한 장비, 에멀젼 기술, 또는 세포독성 용매 헹굼을 필요로 하는 광범위한 기술로 제조된다. 예를 들어, 일부 연구는 에멀젼 기반 방법으로 키토산 마이크로 젤을 제조했지만, 이러한 프로토콜은 용매 헹굼과 세포독성 가교제를 필요로하므로 잠재적으로 임상 설정^15,16으로의 번역을 부정 할 수 있습니다. 다른 연구에서는 특수 장비, 준비 및 훈련이 필요한 키토산 마이크로 젤을 제조하기 위해 마이크로 유체 공학 또는 전기 분무 접근법을 사용했습니다^17,18. 키토산 마이크로겔은 또한 일반적으로 키토산 용액으로 가교결합제를 적하 처리하여 제조된다; 그러나, 이 방법은 용액 점도, 중합체 농도 및 유량에 크게 의존하여, 마이크로겔(^19,20)의 크기 및 분산도를 제어하기 어렵게 만든다. 반대로, 본원에 기재된 마이크로겔 제조 방법은 전문 장비 또는 용매 헹굼을 필요로 하지 않으며, 이들 마이크로겔을 거의 모든 실험실 또는 환경에서 제조를 위해 실행 가능하게 만든다. 따라서, 이들 마이크로겔은 많은 응용을 위한 신속하고, 비용 효율적이며, 생산하기 쉬운 약물 전달 비히클을 위한 고도로 관련된 생체 물질을 나타낸다.

마이크로겔의 조성과 물질 특성을 조절함으로써 연구자들은 세포 미세 환경을 정밀하게 제어하여 물질 의존적 방식으로 세포 거동을 지시 할 수 있습니다. 마이크로겔은 자체적으로 사용되거나 벌크 생체재료 시스템과 결합하여 생체활성 인자의 연장된 방출 또는 천연 또는 외인성 세포에 대한 정확한 특수 신호전달과 같은 특정 기능을 부여할 수 있다. 생체 재료 및 마이크로 젤은 성장 플레이트 부상에 대한 매력적인 치료 방법으로 부상했습니다. 성장 플레이트 부상^{21,22,23,24,25}를 치료하기 위해 알긴산염 및 키토산 기반 생체 재료 개발에 상당한 노력을 기울여 왔습니다. 성장 판 골화 및 뼈 신장의 역동적 인 시간적 특성으로 인해, 뼈 막대 형성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 따라서, 쥐, 토끼 및 양 ^26,27,28에서와 같은 내연골 골화 및 뼈 바 형성의 메카니즘을 더 잘 해명하기 위해 몇몇 동물 모델이 개발되었다. 하나의 그러한 모델은 래트 성장 플레이트 손상 모델이며, 이는 래트 경골의 드릴 홀 결함을 사용하여 예측 가능하고 재현 가능한 방식으로 뼈 바를 생성하고 성장 플레이트^29,30의 세 구역 모두에 걸쳐 인간 부상을 모방한다. 성장 플레이트 부상을 치료하기위한 몇 가지 생체 재료 기반 전략이이 모델을 사용하여 테스트되었습니다. 추가적으로, 키토산 마이크로겔을 제조하기 위한 두 가지 상이한 방법이 개발되었으며, 이는 지속적인 방식으로 치료제를 방출하는 주사 가능한 생체 재료 시스템으로서 사용될 수 있다^10,31. 이들 마이크로겔은 래트 피씰 손상 모델에 사용되었으며, SDF-1a 및 TGF-b3을 방출할 때 개선된 연골 재생(³¹)을 보였다. 이 프로토콜에 제공된 기술은 이러한 키토산 마이크로겔을 제조하기 위해 개발된 방법을 기술하며, 이는 매우 다양한 조직 공학 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구들은 조절된 종양학적 약물 전달 응용을 위해 열- 또는 마젠토-반응성 키토산 마이크로겔을 사용하였다^(32,33).

프로토콜

모든 동물 절차는 콜로라도 덴버 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 6주령의 수컷 Sprague-Dawley 래트를 본 연구에 사용하였다. 래트 성장 플레이트 손상 모델은 이전에 공개된 보고서(³⁰)에 따라 작성되었다.

1. 키토산 고분자의 제조

1. 정제되고 동결건조된 저분자량(LMW) 키토산을 시판되는 공급원으로부터 수득한다( 표 참조).
2. 이중 증류수 495 mL(_ddH2O)를 첨가하고 1 L 비이커에 교반 막대를 가한다. 키토산 5g을 첨가하고 (단계 1.1.) 잘 섞는다.
   참고: 키토산은 생리적 pH에서 수용액에만 난용성이므로 키토산은 이 단계에서 쉽게 용해되지 않습니다.
3. 상기 제조된 키토산 용액에 빙초산 5 mL를 첨가한다.
4. 50°C에서 유지되는 수조에서 설정된 비이커로 18시간 동안 300 rpm으로 덮고 저어준다.
5. Büchner 플라스크 및 깔때기를 사용하여, 여과지의 크기 감소를 통해 키토산 용액을 여과한다: 22 μm, 8 μm, 및 2.7 μm ( 표 참조).
6. 여과된 키토산 용액을 셀룰로스 투석 튜빙(표 자료 참조)에 첨가하고, 실온에서 4일 동안 ddH2O로 투석되도록 하고, 매일 ddH2O를 변화시킨다.
   참고: 마지막 변경에는 초순수 ddH₂O 물을 사용하십시오.
7. 투석된 키토산 용액을 비이커로 옮기고 1 M NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정한다.
8. 키토산을 분취하여 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 5분 동안 4000 x g 에서 원심분리한다.
9. 상청액을 폐기물 스트림으로 데칸트하고, 키토산을 ddH2O에 재현탁시키고,_2x를반복한다.
10. 동결시킨 다음 키토산 펠렛을 동결건조한다.
    1. 매일 동결 건조 된 제품을 제거하고 질량을 기록하십시오.
       참고: 동결건조된 생성물의 질량이 더 이상 변하지 않을 때, 생성물은 완전히 건조되고 사용 준비가 될 때까지 -20°C에서 보관될 수 있다.

2. 키토산 하이드로젤의 제조

1. 2 mL의 6% 아세트산 및 120 mg의 정제된 키토산 (단계 1)을 10 mL 루어-락 주사기에 첨가하여 6% w/v 키토산 용액을 형성하였다.
2. 여성 - 암 Luer-lock 커넥터를 사용하여 Luer-lock 주사기를 다른 동일한 주사기에 연결하고 용액을 30 초 동안 또는 키토산이 아세트산에 완전히 용해 될 때까지 앞뒤로 혼합하십시오.
3. 가교결합하기 전에, 임의의 치료학적 또는 생체활성제를 키토산 용액에 첨가한다(필요하다면). 본 연구를 위해, 200 ng의 SDF-1a 및 TGF-b3 ( 물질의 표 참조)을 마이크로겔에 첨가하였다.
   참고: SDF-1a 및 TGF-b3은 성장 플레이트 조직 재생과 관련된 생리활성 물질입니다. SDF-1a는 중간엽 줄기세포의 결손부위로의 이동을 촉진하고, TGF-b3은 연골형성 계통³¹ 아래로 이들 줄기세포의 분화를 유도하는 연골형성 인자 역할을 한다.
   참고: 키토산을 주사기 사이에 다시 섞어 치료제를 완전히 통합시킨다.
4. 100% 에탄올에서 100 mM의 제니핀의 스톡 가교결합제 용액( 물질표 참조)을 준비한다.
5. 제조된 제니핀 용액 100 μL를 키토산 함유 주사기에 첨가하고(단계 2.4.), 다시 30초 동안 주사기 사이를 앞뒤로 혼합한다.
6. 주사기로부터 혼합물을 35 mm 페트리 디쉬 상에 압출하고, 파라핀 필름으로 덮고, 가습된 분위기에서 하룻밤 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
   참고 : 용액은 진한 파란색으로 변하여 키토산과 제니핀 사이의 가교 반응이 발생하여 키토산 마이크로 젤이 형성되었음을 나타냅니다.
7. 제조된 키토산 마이크로겔을 아래의 단계에 따라 여과한다.
   1. 주걱을 사용하여 하이드로 젤을 작은 조각으로 부드럽게 나눕니다.
      참고 : 조각은 직경이 1-2cm 인 10mL 주사기 뒤쪽으로 옮길 수있을만큼 작아야합니다.
   2. 원하는 메쉬 크기의 필터를 깨끗한 10mL 주사기 뒷면에 넣습니다.
      참고: 마이크로겔의 일반적인 크기 범위는 50-200 μm 사이입니다.
   3. 깨진 겔 조각을 필터가 장착된 주사기로 옮기고 6mL의_ddH2O를첨가한다.
      참고 : 키토산 젤은 수성 배지에서 크게 팽창하므로 젤 부피의 큰 변화가 예상됩니다.
   4. Luer-lock 커넥터를 통해 주사기를 다른 깨끗한 10mL 주사기에 연결합니다.
   5. 젤 + 물 혼합물을 필터로 주사기를 통해 강제 실행하여 지정된 최대 직경의 마이크로 젤을 만듭니다.
      1. 첫 번째 여과 후, 필터가 들어있는 주사기의 뒷면을 열고 혼합물을 다시이 주사기로 밀어 넣습니다.
      2. 주사기의 뒷면을 교체하고 혼합물을 필터를 통해 다시 밀어 넣으십시오.
      3. 여과를 5-6x 반복하거나 필터를 통한 저항이 거의 없을 때까지 반복하십시오.
8. 여과된 마이크로겔을 헹구고 정제한다.
   1. 여과된 겔 혼합물을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, ddH2O로 총 부피를₂₀mL까지 가져오고, 이어서 혼합물을 와류시켜 균질한 분산을 보장한다.
   2. 마이크로겔을 실온에서 5분 동안 100 x g 에서 원심분리하고, 상부 수성상을 데칸트한다.
   3. 마이크로겔을 70% 에탄올 10 mL에 재현탁시키고, 와류하고, UV 광 하에 1 h 동안 두어 멸균시킨다.
   4. 마이크로겔을 실온에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리하고, 에탄올을 버리고, ddH2O로 3x 헹구었다.

3. 시험관 내 또는 생체내 응용을 위한 마이크로겔의 제조

참고: 본 연구를 위해, 성장 플레이트 손상에서의 연골 재생은 래트 모델에서 연구되었다. 자세한 내용은³¹ 참조.

1. 마이크로겔 펠릿을 ddH2O에 1:1로 재현탁시켜 마이크로겔은 4°C에서_ddH2O에 현탁하여 최대 1개월동안 저장할 수 있다. 생체 활성제가 사용되는 경우, 마이크로겔은 즉시 사용되어야 한다.
2. 이전에 공개된 보고서⁽³⁰)에 따라 동물에 부상 부위를 생성한다.
3. 손상 부위를 식염수로 플러시하고 동물을 처리하지 않은 상태로 유지하거나(대조 연구를 위해) 키토산 마이크로겔만 주입하거나 생체활성제가 로딩된 마이크로겔을 주입한다(단계 3.2.).
4. 동물의 상처를 닫고 수술 후 진통제(³⁰)를 투여한다.
5. 수술 후 7일 또는 28일에,_CO2 과다 복용에 의해 래트를 안락사시키고, 사지를 절제하고, 손상 부위⁽³¹)에서 조직 수복을 평가하기 위해 조직학을 수행한다.

결과

키토산 마이크로젤의 성공적인 제조는 제니핀과 키토산 사이의 가교 반응에 의존하며, 특히 키토산 중합체 사슬 상의 아민을 수반한다. 다른 마이크로겔 제조 기술과는 달리, 이 방법은 에멀젼 또는 용매 헹굼을 필요로 하지 않으며, 값싼 장비로 빠르고 쉽게 실시할 수 있다. 성공적인 마이크로겔 제조를 위한 특징적인 지표는 키토산과 제니핀이 혼합된 후 회백색에서 진한 파란색으로 뚜렷한 색?...

토론

마이크로겔은 약물 전달 또는 세포 캡슐화⁹와 같은 다양한 목적을 위한 높은 수준의 적용성으로 인해 최근 몇 년 동안 널리 연구되고 있다. 마이크로 스케일 생체 재료 구축물의 제조 용이성은 연구자가 특정 크기와 시간 규모로 하이드로 겔 기반 전략을 개발할 수 있기 때문에 조직 공학에서 중요한 관련이 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤을 제조하는 대부분의 방법은 값 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh