組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

要約

本プロトコールは、キトサン−ゲニピンミクロゲルの作製のための非エマルジョンベースの方法を記載する。これらのミクロゲルのサイズは正確に制御することができ、pH依存性の腫脹を示し、 インビボで分解し、持続的に経時的に放出する治療分子を装填することができ、組織工学用途に非常に関連性が高い。

要約

キトサンミクロゲルは、その幅広い用途、低コスト、および免疫原性のために、組織工学において大きな関心事である。しかしながら、キトサンミクロゲルは、一般に、環境に有毒で有害である有機溶媒リンスを必要とするエマルジョン法を用いて製造される。本プロトコールは、有機溶媒リンスを必要とせずにキトサン - ゲニピンミクロゲルを製造するための迅速で非細胞毒性の非エマルジョンベースの方法を提示する。本明細書に記載のミクロゲルは、正確なサイズ制御を用いて作製することができる。生体分子の徐放性を示し、組織工学、生体材料、再生医療との関連性が高い。キトサンはゲニピンで架橋されてヒドロゲルネットワークを形成し、次いでシリンジフィルターを通過してミクロゲルを生成する。ミクロゲルは、様々なサイズを作り出すために濾過することができ、pH依存性の膨潤を示し、酵素的に経時的に分解する。これらのミクロゲルは、ラット成長プレート傷害モデルにおいて採用されており、軟骨組織修復の増加を促進し、 インビボで28日目に完全な分解を示すことが実証された。低コスト、高い利便性、および細胞適合性材料による製造の容易さのために、これらのキトサンミクロゲルは、組織工学においてエキサイティングでユニークな技術を提示する。

概要

成長プレートは、フィジーとしても知られており、子供の成長を媒介する長骨の端に位置する軟骨構造です。成長プレートが損傷すると、「ボーンバー」として知られる修復組織が形成され、正常な成長が中断され、成長欠陥または角度変形を引き起こす可能性がある。疫学的データは、すべての小児骨格損傷の15%〜30%が成長プレートに関連していることを示している。骨棒形成は、これらの傷害の最大30%で起こり、成長プレート損傷およびそれに関連する治療を重大な臨床症状の問題にする1,2,3,4。骨棒の形成が起こるとき、最も一般的な治療手段は、骨棒を切除し、シリコンまたは脂肪組織⁵などの介在材料を挿入することを含む。しかし、骨棒切除手術を受けた患者は、損傷した成長プレート^を完全に修復できる治療法が現在存在しないため、完全な回復のための予後不良を有することが多い^6,7,8。これらの欠点に照らして、骨棒の形成を予防し、健康なフィシール軟骨組織を再生するの両方において、成長プレート傷害を治療するための効果的な戦略が決定的に必要とされている。

ヒドロゲル微粒子、またはミクロゲルは、治療薬の徐放性を提供することができる注射用足場として最近関心を集めている⁹。その高い同調性と生体適合性のために、ミクロゲルは生理活性因子または細胞カプセル化にも適している。ミクロゲルは、ポリエチレングリコール(PEG)などの合成ポリマーから、アルギン酸塩やキトサン^10、11、12などの天然ポリマーまで、さまざまな材料で作ることができます。キトサンは、グラム陰性菌の外膜を不安定化させる能力など、組織工学にいくつかの有益な効果を有することが示されており、それによって固有の抗菌活性を提供する^1〜3、14。さらに、キトサンは費用対効果が高く、細胞がインタラクティブで、アミン含有構造を使用して容易に修飾できます。キトサンベースのミクロゲルは、細菌感染を予防しながら組織再生を促進することができる薬物送達および材料シグナル伝達のための生体材料戦略を約束する。しかしながら、キトサンミクロゲルは、しばしば、特別な装置、エマルジョン技術、または細胞傷害性溶媒リンスを必要とする広範囲の技術を用いて製造される。例えば、いくつかの研究では、エマルジョンベースの方法でキトサンミクロゲルを作製しているが、これらのプロトコルは溶媒リンスおよび細胞傷害性架橋剤を必要とし、臨床現場への翻訳を否定する可能性がある^15,16。他の研究では、マイクロフルイディクスまたはエレクトロスプレーアプローチを使用してキトサンミクロゲルを製造しており、これには特別な装置、調製、およびトレーニングが必要です^17,18。キトサンミクロゲルはまた、一般に、キトサン溶液に架橋剤を滴下するプロセスで製造される。しかしながら、この方法は、溶液粘度、ポリマー濃度、および流速に大きく依存し、ミクロゲル¹⁹、²⁰のサイズおよび分散性を制御することを困難にする。逆に、本明細書に記載されるミクロゲル作製方法は、専門的な装置または溶媒すすぎを必要とせず、これらのミクロゲルを、ほぼすべての実験室または設定における製造に実行可能にする。したがって、これらのミクロゲルは、多くの用途において、迅速で費用対効果が高く、製造が容易な薬物送達ビヒクルのための、関連性の高い生体材料を表す。

ミクロゲルの組成と材料特性を調節することにより、研究者は細胞微小環境を正確に制御し、材料依存的に細胞挙動を導くことができます。ミクロゲルは、単独で使用することも、バルク生体材料系と組み合わせて、生理活性因子の延長放出や、天然または外因性細胞に対する正確な特別なシグナル伝達などの特定の機能性を付与することもできます。生体材料およびミクロゲルは、成長プレート損傷の魅力的な治療手段として浮上してきた。成長プレート損傷^21、22、²³、^24、25を治療するためのアルギン酸およびキトサンベースの生体材料の開発に多大な努力が捧げられてきた。成長板の骨化と骨の伸長の動的時間的性質のために、骨棒形成のメカニズムは完全には理解されていない。したがって、ラット、ウサギ、およびヒツジなどにおける軟骨骨化および骨棒形成のメカニズムをよりよく解明するために、いくつかの動物モデルが開発されている26、^27、28。そのようなモデルの1つは、ラット成長プレート傷害モデルであり、ラット脛骨のドリルホール欠陥を使用して、予測可能かつ再現可能な方法で骨バーを生成し、成長プレート^29、30の3つのゾーンすべてにわたってヒト傷害を模倣する。成長プレートの損傷を治療するためのいくつかの生体材料ベースの戦略が、このモデルを使用してテストされている。さらに、キトサンミクロゲルを作製するための2つの異なる方法が開発されており、これは、治療薬を持続的に放出する注射可能な生体材料系として使用することができる^10、31。これらのミクロゲルはラットフィシール傷害モデルに採用されており、SDF−1aおよびTGF−b3を放出すると軟骨再生³¹の改善を示した。このプロトコールで提供される技術は、これらのキトサンミクロゲルを製造するために開発された方法を記述し、その後、多種多様な組織工学用途に採用することができる。例えば、最近の研究では、制御された腫瘍学的薬物送達用途のために、温度またはマゼント応答性キトサンミクロゲルが使用されている^32,33。

プロトコル

すべての動物処置は、コロラド大学デンバー校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。6週齢の雄性スプレイグ・ドーリーラットを本研究に使用した。ラット成長プレート傷害モデルは、以前に発表された報告³⁰に従って作成された。

キトサンポリマーの調製

1. 市販の供給源から精製および凍結乾燥された低分子量(LMW)キトサンを得る( 材料表を参照のこと)。
2. 495 mL の二重蒸留水 (ddH₂O) と撹拌子を 1 L ビーカーに加えます。キトサン5gを加え(ステップ1.1)、よく混ぜる。
   注:キトサンは生理学的pHでは水溶液に難溶性であるため、この段階ではキトサンは容易に溶解しません。
3. 上記調製したキトサン溶液に5mLの氷酢酸を加える。
4. 50°Cに保持した水浴にセットしたビーカーで覆いを300rpmで18時間攪拌する。
5. ビュッヒナーフラスコと漏斗を使用して、キトサン溶液を、22 μm、8 μm、および2.7 μmの縮小したろ紙を通してろ過します( 材料表を参照)。
6. 濾過したキトサン溶液をセルロース透析チューブ(材料表参照)に加え、ddH2Oを毎日変化させながら、室温でddH2O中で4日間透析する。
   注: 最後の変更には、超高純度の ddH₂O 水を使用してください。
7. 透析したキトサン溶液をビーカーに移し、1 M NaOHを用いてpHを8.0に調整した。
8. キトサンを遠沈管にアリコートし、4000 x g で室温で5分間遠心分離する。
9. 上清を廃液流にデカントし、キトサンを_ddH2Oに再懸濁させ、2回繰り返す。
10. キトサンペレットを凍結し、凍結乾燥する。
    1. 毎日、凍結乾燥物を取り出し、質量を記録する。
       注:凍結乾燥製品の質量がもはや変化しなくなったら、製品は完全に乾燥され、使用準備が整うまで-20°Cで保存することができます。

2. キトサンハイドロゲルの作製

1. 2 mLの6%酢酸および120mgの精製キトサン(ステップ1)を10mLのルアーロックシリンジに加え、6%w/vキトサン溶液を形成する。
2. メス - ルアーロックコネクタを使用してルアーロックシリンジを別の同一のシリンジに接続し、30秒間、またはキトサンが酢酸に完全に溶解するまで溶液を前後に混合する。
3. 架橋する前に、任意の治療剤または生理活性剤をキトサン溶液に(必要に応じて)加える。本研究のために、200ngのSDF−1aおよびTGF−b3( 材料表を参照のこと)をミクロゲルに添加した。
   注:SDF−1aおよびTGF−b3は、成長プレート組織再生に関連する生理活性物質である。SDF-1aは間葉系幹細胞の欠損部位への遊走を促進し、TGF-b3は軟骨形成因子として機能し、これらの幹細胞を軟骨形成系譜³¹に分化誘導する。
   注:治療薬を完全に組み込むために、シリンジの間にキトサンをもう一度混ぜる。
4. 100%エタノール中に100mMのゲニピンのストック架橋剤溶液( 材料表を参照)を調製する。
5. 調製したゲニピン溶液100μL(工程2.4.)をキトサン含有シリンジに加え、再びシリンジ間を30秒間前後に混合する。
6. 混合物をシリンジから35mmシャーレに押し出し、パラフィンフィルムで覆い、加湿雰囲気下で37°Cで一晩インキュベートする。
   注:溶液は濃い青色に変わり、キトサンとゲニピンとの間の架橋反応が起こり、キトサンミクロゲルの形成につながることを示す。
7. 調製したキトサンミクロゲルを以下の手順に従って濾過する。
   1. ヘラを使用してヒドロゲルを静かに小片に割る。
      注:ピースは、直径約1〜2cmの10mLシリンジの背面に移すのに十分な大きさにする必要があります。
   2. 希望のメッシュサイズのフィルターを清潔な10mLシリンジの背面に置きます。
      注:ミクロゲルの典型的なサイズ範囲は50〜200μmです。
   3. 壊れたゲル片をフィルターを取り付けたシリンジに移し、6mLの_ddH2Oを加える。
      注:キトサンゲルは水性媒体中で著しく膨潤するため、ゲル体積に大きな変化が予想される。
   4. ルアーロックコネクタ を介して シリンジを別の清潔な10 mLシリンジに接続します。
   5. ゲル+水混合物をフィルター付きのシリンジに強制的に通し、指定された最大直径のミクロゲルを作成します。
      1. 最初のろ過の後、フィルターを入れたシリンジの背面を開き、混合物をこのシリンジに押し戻します。
      2. シリンジの背面を交換し、混合物を再びフィルターに強制的に通します。
      3. ろ過を5〜6x、またはフィルターを通る抵抗がほとんどなくなるまで繰り返します。
8. ろ過したミクロゲルをすすぎ、精製する。
   1. 濾過したゲル混合物を50mL円錐管に移し、ddH2Oで全体積を_20mLまで持ってきて、次いで混合物を渦巻き、均一な分散を確実にする。
   2. ミクロゲルを室温で100 x g で5分間遠心分離し、上部水相をデカントする。
   3. ミクロゲルを10mLの70%エタノールに再懸濁し、渦を巻き込み、UV光下に1時間置いて滅菌する。
   4. ミクロゲルを室温で1,000 x gで5分間遠心分離し、エタノールを捨て、ddH2Oで3xすすいでください。

3. イン ビトロ または インビボ 用途のためのミクロゲルの調製

注:本研究のために、成長プレート損傷における軟骨再生をラットモデルで研究した。詳しくは、参考文献³¹ を参照してください。

1. ミクロゲルペレットをddH2O中に1:1で再懸濁し、ミクロゲルを4°Cで_ddH2O中に懸濁して最大1ヶ月間保存することができる。 生理活性剤を使用する場合、ミクロゲルは直ちに使用しなければならない。
2. 以前に公開された報告³⁰に続いて動物における傷害部位を作成する。
3. 傷害部位を生理食塩水で洗い流し、動物を未処置のままにするか(対照研究のため)、キトサンミクロゲルのみまたは生理活性物質を装填したミクロゲルを注射する(ステップ3.2)。
4. 動物の創傷を閉じ、術後鎮痛薬³⁰を投与する。
5. 術後7日目または28日目に、_CO2 過剰摂取によりラットを安楽死させ、四肢を切除し、組織学を行い、傷害部位³¹における組織修復を評価する。

結果

キトサンミクロゲルの製造の成功は、ゲニピンとキトサンとの間の架橋反応、特にキトサンポリマー鎖上のアミンを含むことに依存する。他のミクロゲル作製技術とは対照的に、この方法はエマルジョンまたは溶媒すすぎを必要とせず、安価な装置で迅速かつ容易に行うことができる。ミクロゲル製造を成功させるための特徴的な指標は、キトサンとゲニピンが混合された後のオフホワイト?...

ディスカッション

ミクロゲルは、薬物送達または細胞封入などの様々な目的への適用性が高いため、近年広く研究されている⁹。マイクロスケールの生体材料構築物の製造の容易さは、研究者が特定のサイズおよび時間スケールでヒドロゲルベースの戦略を開発することを可能にするため、組織工学において有意に関連している。しかしながら、キトサンミクロゲルを製造するためのほとんど...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh