Fabbricazione di microgel di chitosano-genipina a grandezza controllata e priva di emulsioni per applicazioni di ingegneria tissutale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un metodo non basato sull'emulsione per la fabbricazione di microgel di chitosano-genipina. La dimensione di questi microgel può essere controllata con precisione e possono mostrare gonfiore dipendente dal pH, degradarsi in vivo ed essere caricati con molecole terapeutiche che rilasciano nel tempo in modo sostenuto, rendendoli altamente rilevanti per le applicazioni di ingegneria tissutale.

Abstract

I microgel di chitosano sono di notevole interesse nell'ingegneria tissutale grazie alla loro vasta gamma di applicazioni, al basso costo e all'immunogenicità. Tuttavia, i microgel di chitosano sono comunemente fabbricati utilizzando metodi di emulsione che richiedono risciacqui con solvente organico, che sono tossici e dannosi per l'ambiente. Il presente protocollo presenta un metodo rapido, non citotossico e non basato su emulsioni per la fabbricazione di microgel di chitosano-genipina senza la necessità di risciacqui con solvente organico. I microgel qui descritti possono essere fabbricati con un controllo preciso delle dimensioni. Mostrano un rilascio prolungato di biomolecole, rendendole altamente rilevanti per l'ingegneria tissutale, i biomateriali e la medicina rigenerativa. Il chitosano è reticolato con genipina per formare una rete di idrogel, quindi passato attraverso un filtro a siringa per produrre i microgel. I microgel possono essere filtrati per creare una gamma di dimensioni e mostrano gonfiore dipendente dal pH e si degradano nel tempo enzimaticamente. Questi microgel sono stati impiegati in un modello di lesione della piastra di crescita del ratto e hanno dimostrato di promuovere una maggiore riparazione del tessuto cartilagineo e di mostrare una completa degradazione a 28 giorni in vivo. Grazie al loro basso costo, all'elevata praticità e alla facilità di fabbricazione con materiali citocompatibili, questi microgel di chitosano presentano una tecnologia entusiasmante e unica nell'ingegneria tissutale.

Introduzione

La piastra di crescita, nota anche come physis, è la struttura cartilaginea situata alla fine delle ossa lunghe che media la crescita nei bambini. Se la piastra di crescita si ferisce, può formarsi un tessuto di riparazione noto come "barra ossea", che interrompe la crescita normale e può causare difetti di crescita o deformità angolari. I dati epidemiologici hanno dimostrato che il 15%-30% di tutte le lesioni scheletriche infantili sono correlate alla piastra di crescita. La formazione di barre ossee si verifica fino al 30% di queste lesioni, rendendo le lesioni della piastra di crescita e il loro trattamento associato un problema di manifestazione clinica significativo ^1,2,3,4. Quando si verifica la formazione di barre ossee, la via di trattamento più comune prevede la resezione della barra ossea e l'inserimento di un materiale interposizionale, come il silicio o il tessuto adiposo⁵. Tuttavia, i pazienti sottoposti a chirurgia di resezione della barra ossea spesso hanno una prognosi sfavorevole per il pieno recupero, in quanto attualmente non esiste un trattamento in grado di riparare completamente una piastra di crescita ferita ^6,7,8. Alla luce di queste carenze, vi è un bisogno critico di strategie efficaci per il trattamento delle lesioni della piastra di crescita, sia nel prevenire la formazione di una barra ossea che nel rigenerare il tessuto cartilagineo fisico sano.

Le microparticelle di idrogel, o microgel, hanno recentemente guadagnato interesse come scaffold iniettabili in grado di fornire un rilascio prolungato di terapie⁹. Grazie alla loro elevata sintoniabilità e biocompatibilità, i microgel sono adatti anche per il fattore bioattivo o l'incapsulamento cellulare. I microgel possono essere realizzati con vari materiali, che vanno dai polimeri sintetici, come il polietilenglicole (PEG), ai polimeri naturali come l'alginato o il chitosano 10,11,12. Il chitosano ha dimostrato di avere diversi effetti benefici per l'ingegneria tissutale, come la sua capacità di destabilizzare la membrana esterna dei batteri gram-negativi, offrendo così un'attività^{antimicrobica intrinseca 1 3,14}. Inoltre, il chitosano è conveniente, interattivo con le cellule e facilmente modificabile utilizzando la sua struttura contenente ammine. I microgel a base di chitosano promettono una strategia di biomateriali per la somministrazione di farmaci e la segnalazione di materiali che possono promuovere la rigenerazione dei tessuti prevenendo l'infezione batterica. Tuttavia, i microgel di chitosano sono spesso fabbricati con una vasta gamma di tecniche che richiedono attrezzature speciali, tecniche di emulsione o risciacqui con solventi citotossici. Ad esempio, alcuni studi hanno fabbricato microgel di chitosano con metodi basati su emulsioni, ma questi protocolli richiedono risciacqui con solvente e reticolanti citotossici, negando potenzialmente la loro traduzione in contesti clinici^15,16. Altri studi hanno utilizzato approcci di microfluidica o elettrospray per fabbricare microgel di chitosano, che richiedono attrezzature speciali, preparazione e formazione^17,18. I microgel di chitosano sono anche comunemente fatti con un processo dropwise di reticolante in soluzione di chitosano; tuttavia, questo metodo dipende fortemente dalla viscosità della soluzione, dalla concentrazione del polimero e dalla portata, rendendo difficile controllare le dimensioni e la dispersione dei microgel^19,20. Al contrario, il metodo per la fabbricazione di microgel qui descritto non richiede attrezzature specialistiche o risciacqui con solvente, rendendo questi microgel praticabili per la fabbricazione in quasi tutti i laboratori o ambienti. Pertanto, questi microgel rappresentano biomateriali altamente rilevanti per un veicolo di somministrazione di farmaci rapido, economico e facile da produrre per molte applicazioni.

Modulando la composizione e le caratteristiche del materiale di un microgel, i ricercatori possono ottenere un controllo preciso sul microambiente cellulare, dirigendo così il comportamento cellulare in modo dipendente dal materiale. I microgel possono essere impiegati da soli o combinati con sistemi di biomateriali sfusi per impartire funzionalità specifiche, come il rilascio prolungato di fattori bioattivi o una precisa segnalazione speciale per cellule native o esogene. Biomateriali e microgel sono emersi come vie di trattamento interessanti per le lesioni delle placche di crescita. Uno sforzo significativo è stato dedicato allo sviluppo di biomateriali a base di alginato e chitosano per il trattamento delle lesioni delle placche di crescita ^{21,22,23,24,25}. A causa della natura temporale dinamica dell'ossificazione della piastra di crescita e dell'allungamento osseo, il meccanismo di formazione della barra ossea non è completamente compreso. Pertanto, sono stati sviluppati diversi modelli animali per chiarire meglio i meccanismi di ossificazione endocondrale e formazione di barre ossee, come nei ratti, nei conigli e nelle pecore 26,27,28. Uno di questi modelli è un modello di lesione della piastra di crescita del ratto, che utilizza un difetto del foro di perforazione nella tibia del ratto per produrre una barra ossea in modo prevedibile e riproducibile e imita le lesioni umane in tutte e tre le zone della piastra di crescita^29,30. Diverse strategie basate su biomateriali per il trattamento delle lesioni della piastra di crescita sono state testate utilizzando questo modello. Inoltre, sono stati sviluppati due diversi metodi per fabbricare microgel di chitosano, che possono essere utilizzati come un sistema di biomateriale iniettabile che rilascia terapie in modo sostenuto^10,31. Questi microgel sono stati impiegati in un modello di lesione fisica del ratto e hanno mostrato una migliore rigenerazione della cartilagine³¹ quando si rilasciano SDF-1a e TGF-b3. Le tecniche fornite in questo protocollo descrivono i metodi sviluppati per fabbricare questi microgel di chitosano, che possono quindi essere impiegati in un'ampia varietà di applicazioni di ingegneria tissutale. Ad esempio, studi recenti hanno utilizzato microgel di chitosano termo- o magento-responsivi per applicazioni di somministrazione di farmaci oncologici controllati^32,33.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado di Denver. Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Maschi Sprague-Dawley di 6 settimane. Il modello di lesione della piastra di crescita del ratto è stato creato a seguito di un rapporto^{precedentemente pubblicato 30}.

1. Preparazione del polimero chitosano

1. Ottenere chitosano purificato e liofilizzato a basso peso molecolare (LMW) da fonti disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali).
2. Aggiungere 495 ml di acqua a doppia distillazione (ddH₂O) e una barra di agitazione a un becher da 1 L. Aggiungere 5 g di chitosano (Passo 1.1.) e mescolare bene.
   NOTA: Il chitosano è solo scarsamente solubile in una soluzione acquosa a pH fisiologico, quindi il chitosano non si dissolverà facilmente in questa fase.
3. Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale alla soluzione di chitosano sopra preparata.
4. Mescolare coperto a 300 giri/min per 18 ore con il becher incastonato a bagnomaria a 50 °C.
5. Utilizzando un pallone Büchner e un imbuto, filtrare la soluzione di chitosano attraverso dimensioni decrescenti di carta da filtro: 22 μm, 8 μm e 2,7 μm (vedere Tabella dei materiali).
6. Aggiungere la soluzione filtrata di chitosano al tubo di dialisi della cellulosa (vedi Tabella dei materiali) e lasciare dializzare in ddH₂O a temperatura ambiente per 4 giorni, cambiando il ddH₂O ogni giorno.
   NOTA: Utilizzare acqua ultrapura ddH₂O per l'ultima modifica.
7. Trasferire la soluzione di chitosano dializzato in un becher e regolare il pH a 8,0 utilizzando 1 M NaOH.
8. Aliquotare il chitosano in tubi per centrifughe e centrifugare a 4000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
9. Decantare il surnatante in un flusso di rifiuti e risospesciare il chitosano in ddH₂O, ripetendo 2x.
10. Congelare e poi liofilizzare il pellet di chitosano.
    1. Ogni giorno, rimuovere il prodotto liofilizzato e registrare la massa.
       NOTA: Quando la massa del prodotto liofilizzato non cambia più, il prodotto viene completamente asciugato e può essere conservato a -20 °C fino al momento dell'uso.

2. Fabbricazione di idrogel di chitosano

1. Aggiungere 2 mL di acido acetico al 6% e 120 mg di chitosano purificato (Fase 1) a una siringa Luer-lock da 10 mL per formare una soluzione di chitosano al 6% p/v.
2. Collegare la siringa Luer-lock a un'altra siringa identica utilizzando un connettore Luer-lock femmina-femmina e mescolare la soluzione avanti e indietro per 30 s, o fino a quando il chitosano non si è completamente disciolto nell'acido acetico.
3. Prima di reticolare, aggiungere qualsiasi agente terapeutico o bioattivo alla soluzione di chitosano (se necessario). Per il presente studio, 200 ng di SDF-1a e TGF-b3 (vedi Tabella dei materiali) sono stati aggiunti ai microgel.
   NOTA: SDF-1a e TGF-b3 sono agenti bioattivi rilevanti per la rigenerazione del tessuto della piastra di crescita. SDF-1a promuove la migrazione delle cellule staminali mesenchimali verso il sito del difetto e TGF-b3 funge da fattore condrogenico per indurre la differenziazione di queste cellule staminali lungo il lignaggio condrogenico³¹.
   NOTA: Mescolare nuovamente il chitosano tra le siringhe per incorporare completamente la terapia.
4. Preparare 100 mM di soluzione reticolante di genipina (vedere Tabella dei materiali) in etanolo al 100%.
5. Aggiungere 100 μL della soluzione di genipina preparata (fase 2.4.) alla siringa contenente chitosano e mescolare nuovamente avanti e indietro tra le siringhe per 30 s.
6. Estrudere la miscela dalla siringa su una capsula di Petri da 35 mm, coprirla con pellicola di paraffina e incubarla a 37 °C durante la notte in atmosfera umidificata.
   NOTA: La soluzione diventerà blu scuro, indicando che si è verificata la reazione di reticolazione tra chitosano e genipina, portando alla formazione di microgel di chitosano.
7. Filtrare il microgel di chitosano preparato seguendo i passaggi seguenti.
   1. Rompere delicatamente l'idrogel in pezzi più piccoli usando una spatola.
      NOTA: i pezzi devono essere abbastanza piccoli da essere trasferiti sul retro di una siringa da 10 ml, ~ 1-2 cm di diametro.
   2. Posizionare un filtro della dimensione di maglia desiderata nella parte posteriore di una siringa pulita da 10 ml.
      NOTA: l'intervallo di dimensioni tipico per i microgel è compreso tra 50-200 μm.
   3. Trasferire i pezzi di gel rotti nella siringa montata con il filtro e aggiungere 6 mL di ddH₂O.
      NOTA: Il gel di chitosano si gonfierà in modo significativo nel mezzo acquoso, quindi è previsto un grande cambiamento nel volume del gel.
   4. Collegare la siringa tramite un connettore Luer-lock a un'altra siringa pulita da 10 ml.
   5. Forzare la miscela gel + acqua attraverso la siringa con il filtro per creare microgel con un diametro massimo specificato.
      1. Dopo la prima filtrazione, aprire il retro della siringa contenente il filtro ed estrudere nuovamente la miscela in questa siringa.
      2. Sostituire il retro della siringa e forzare nuovamente la miscela attraverso il filtro.
      3. Ripetere la filtrazione 5-6x o fino a quando non c'è poca resistenza attraverso il filtro.
8. Risciacquare e purificare i microgel filtrati.
   1. Trasferire la miscela di gel filtrato in un tubo conico da 50 ml, portare il volume totale fino a 20 ml con ddH₂O, quindi ruotare la miscela per garantire una dispersione omogenea.
   2. Centrifugare i microgel a 100 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e decantare la fase acquosa superiore.
   3. Sospendere i microgel in 10 ml di etanolo al 70%, vortice e metterli sotto luce UV per 1 ora per sterilizzare.
   4. Centrifugare i microgel a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare l'etanolo e risciacquare 3 volte con ddH₂O.

3. Preparazione di microgel per applicazioni in vitro o in vivo

NOTA: Per il presente studio, la rigenerazione della cartilagine nelle lesioni della piastra di crescita è stata studiata in un modello di ratto. Per informazioni dettagliate, vedere il riferimento³¹.

1. Sospendere i pellet di microgel 1:1 in ddH₂O. I microgel possono essere conservati per un massimo di 1 mese sospesi in ddH₂O a 4 °C. Se viene utilizzato un agente bioattivo, i microgel devono essere utilizzati immediatamente.
2. Creare il sito della lesione nell'animale seguendo un rapporto precedentemente pubblicato³⁰.
3. Lavare il sito della lesione con soluzione salina e mantenere l'animale non trattato (per lo studio di controllo) o iniettare solo i microgel di chitosano o i microgel caricati con gli agenti bioattivi (Fase 3.2.).
4. Chiudere la ferita nell'animale e somministrare analgesici post-chirurgici³⁰.
5. Nei giorni 7 o 28 post-operatorio, eutanasizzare il ratto con sovradosaggio di CO₂ , asportare gli arti ed eseguire l'istologia per valutare la riparazione dei tessuti nel sito della lesione³¹.

Risultati

Il successo della fabbricazione di microgel di chitosano si basa sulla reazione di reticolazione tra genipina e chitosano, in particolare coinvolgendo le ammine sulle catene polimeriche di chitosano. A differenza di altre tecniche di fabbricazione di microgel, questo metodo non richiede emulsioni o risciacqui con solvente e può essere condotto rapidamente e facilmente con attrezzature economiche. Un indicatore distintivo per la fabbricazione di microgel di successo è il distinto cambiamento di colore dal bianco sporco ...

Discussione

I microgel sono stati ampiamente studiati negli ultimi anni a causa del loro alto livello di applicabilità per vari scopi, come la somministrazione di farmaci o l'incapsulamento cellulare⁹. La facilità di produzione di costrutti di biomateriali su microscala è di notevole rilevanza nell'ingegneria tissutale, in quanto consente ai ricercatori di sviluppare strategie basate sull'idrogel a una dimensione e una scala temporale specifiche. Tuttavia, la maggior parte dei metodi per fabbricare microge...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh