结核分枝杆菌 通过尺寸排阻色谱实现细胞外囊泡富集

摘要

该方案描述了尺寸排阻色谱，这是一种从培养物上清液中富集 结核分枝杆菌 细胞外囊泡的简单且可重复的技术。

摘要

细胞外囊泡（EV）在细菌感染中的作用已成为理解微生物生理学的新途径。具体而言， 结核分枝杆菌 （Mtb）EV在宿主 - 病原体相互作用和对环境压力的反应中发挥作用。Mtb EV也具有高度抗原性，并显示出作为疫苗成分的潜力。纯化Mtb EV的最常用方法是密度梯度超速离心。该过程有几个局限性，包括低通量，低产量，依赖昂贵的设备，技术挑战，并且可能对最终的制备产生负面影响。尺寸排阻色谱（SEC）是一种更温和的替代方法，可克服超速离心的许多局限性。该协议表明，SEC对MTB EV富集有效，并以快速和可扩展的方式生产高质量的MTB EV制剂，从而提高产量。此外，通过定量和鉴定程序与密度梯度超速离心的比较证明了SEC的优势。虽然EV数量（纳米颗粒跟踪分析），表型（透射电子显微镜）和含量（蛋白质印迹）的评估是为Mtb EV量身定制的，但提供的工作流程可以应用于其他分枝杆菌。

引言

病原体释放的细胞外囊泡（EV）可能是解锁控制传染病的新技术的关键¹. 结核分枝杆菌（Mtb）是一种具有高度后果的病原体，每年感染约三分之一的世界人口，夺走数百万人的生命²。Mtb的EV生产有据可查，但在感染背景下，这些EV的生物发生和各种作用（即免疫刺激，免疫抑制，铁和营养获取）难以捉摸^3，4，5。了解Mtb EVs组成的努力揭示了50-150nm脂质膜封闭的球体，这些脂质膜来自含有具有^{免疫学意义}的脂质和蛋白质的质膜3^，6。对Mtb EV在细菌生理学中的作用的研究揭示了细菌EV调节在响应环境压力对生存的重要性⁵。宿主- 病原体相互作用研究的解释更加复杂，但有证据表明，Mtb EV可以影响宿主的免疫反应，并可能作为有效的疫苗接种成分^3，4，7。

到目前为止，大多数Mtb EV的研究都依赖于密度梯度超速离心进行囊泡富集⁸。这对小规模研究是有效的。然而，这种技术有几个技术和后勤方面的挑战。替代工作流程将多步离心与最终超速离心步骤相结合，以去除整个细胞和大碎片，以沉淀EV。这种方法的效率可能不同，并且通常导致可溶性非囊泡相关生物分子的低产量和共纯化，同时也影响囊泡完整性⁹。此外，此过程非常耗时，需要大量手动操作，并且由于设备限制，吞吐量非常有限。

本方案描述了密度梯度超速离心的替代技术:尺寸排阻色谱（SEC）。该方法已被证明适用于环境分枝杆菌，并且在当前的工作中，它已被外推到Mtb¹⁰。市售的色谱柱和自动馏分收集器可以提高制备的一致性，并减少对特定昂贵设备的需求。与密度梯度超速离心相比，也可以在很短的时间内完成该协议，从而提高通量。该技术在技术上的挑战性较小，使其更容易掌握，并且可以增加实验室间/实验室内的可重复性。最后，SEC具有高分离效率，并且温和，保持囊泡的完整性。

研究方案

科罗拉多州立大学机构生物安全委员会批准了本研究（19-046B）。 结核分枝杆菌 的培养和富含EV的培养物上清液的收获由训练有素的人员在高密闭实验室进行。在实施、确认并得到机构生物安全政策批准的有效灭活方法后，这些材料被移出高密闭区。在复制方案时，如果验证灭活或无菌过滤方法不可行，则需要在高密闭实验室中执行以下程序。

1. 粗山地车EV精矿的制备

注:有关Mtb培养和培养滤液蛋白（CFP）制备的详细程序，请参见参考文献^11，12。建议细菌培养基不含含有EV或蛋白质成分的生长补充剂，如油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶（OADC）和洗涤剂，如吐温。还建议对细菌培养物的质量和收获的CFP进行筛选，以确保有限的细胞死亡和裂解^13，14。

1. 通过添加磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）的全体积容量来制备100 kDa分子量截止（MWCO）离心过滤器（参见 材料表）。在4°C下以2，800× g 离心5分钟。
   注意:如果使用没有死区体积的过滤器，则必须注意确保样品体积不会降低到过滤器水平以下，从而导致离心过程中过滤器完全干燥。
2. 丢弃流出的PBS和任何剩余的PBS，然后用Mtb CFP填充样品室至其最大容量。在4°C下以2，800× g 离心，直到体积减小到超滤装置的最小体积。根据需要重复，向装置中添加更多的CFP，直到整个样品充分减少。
   注意:如果需要，请保留一部分 100 kDa 流通 （100F） 材料，以供下游鉴定。储存在4°C。
3. 将 1x PBS 添加到包含浓缩物的过滤单元中，直至达到设备总容量。按照 1.2 中所述减小音量。重复此步骤五次，以确保完全洗涤和缓冲液交换。
4. 根据超滤装置规格回收100 kDa浓缩CFP截留物（100R）（见 材料表）。一旦100R被回收，用最小体积的1x PBS洗涤过滤器至少三次，并用100R池化洗涤以最大限度地提高回收率。
5. 按照制造商的说明，用双新角蛋白测定（BCA）定量100R材料（参见 材料表）。要进行测定，请在PBS中使用1:2，1:5和1:10的样品的几种稀释液。一式三份测试样品。
   注意:如果需要，请保留一部分 100R 材料以供下游鉴定。储存在4°C。

2. 尺寸排阻色谱法从CFP富集Mtb EV

注意:以下程序专门用于将3mg 100R Mtb CFP与SEC色谱柱和自动馏分收集器（AFC，参见 材料表）一起使用。它可根据制造商的规格适用于其他起始浓度和色谱柱类型。此外，建议用户阅读并理解自动馏分收集器用户手册。

1. 让 SEC 色谱柱平衡至室温。
2. 使用塔式装置背面的电源开关打开AFC，并在必要时按主菜单触摸屏上的 SETUP 键调整称重传感器的设置。称重传感器必须在首次使用时，每次软件更新后，如果发现馏分收集量不一致，则必须进行校准。
3. 在 "设置" 屏幕中，通过选择"轮播 >校准"来对齐轮播。将带有 13 个小孔朝上的转盘插入 AFC 塔中，然后通过按 - 和/或 + 按钮调整转盘，使流体喷嘴位于冲洗位置的正上方。
4. 从平衡的 SEC 列中取出盖子。将 SEC 色谱柱滑入相应的立柱安装座中，然后小心地将其安装在 AFC 塔架上。确保色谱柱上的射频识别（RFID）标签面向AFC，并检查色谱柱与阀门之间的连接是否牢固。将废物出口管放入收集容器中。
5. 在 "设置" 屏幕中，选择 "收集计划 "，然后按 - 和/或 + 按钮将计数设置为 13，将大小设置为 0.5 mL。将"缓冲液容量"设置保留为默认值 2.7 mL，然后按 X 关闭"收集计划"窗口。
6. 从主屏幕中选择 "开始收集" ，然后选择" 是"确认集合参数。装载 13 个标有 1.7 mL 微量离心管，盖子打开并指向转盘中心。
7. 通过选择 "确定"推进 AFC，然后安装柱式储液器，然后按 "确定"再次前进。通过按 YES选择冲洗色谱柱的选项，然后添加一个0.2μm过滤PBS的色谱柱体积以除去任何储存缓冲液。冲洗完成后，按 "确定"推进 AFC。
8. 将轮播盖放在 AFC 上，然后按 确定。准备一列体积为0.2μm过滤的PBS。使用移液器从色谱柱中除去任何多余的缓冲液。
9. 将步骤1.5至500μL中定量的3mg 100R样品与1x PBS一起。将3mg样品加入柱顶部。推进AFC，让样品进入玻璃料。一旦样品完全进入色谱柱，将步骤2.6中制备的PBS加入储液槽中。
10. 监控AFC的运行，同时它首先收集空隙体积，然后收集指定的分数。运行完成后，转盘返回到废物位置，取下盖子，然后从转盘中取出分数管。在定量（步骤3）和鉴定（步骤4）之前将馏分储存在4°C。
11. 如果要重复使用该列，请选择按 YES 清理列的选项;否则，请按 NO。按照 AFC 上的说明进行操作。
    注意:一旦柱子被洗涤并且储存缓冲液已经通过，它可以被移除，盖上盖子，并在4°C下储存。

3. 山地车EV的量化

1. 使用支链氨基酸和微量支链氨基酸¹²测量每个级分的蛋白质浓度。
   1. 对于从3mg 100R Mtb CFP收集的0.5 mL级分，使用微量BCA以1:3稀释度，每个样品的1-7级分一式三份。
   2. 对于编号为 5-13 的 0.5 mL 级分，使用 BCA，每个样品一式三份，不稀释。
      注意:重叠馏分5-7的测定将有助于确保所有馏分具有可读的输出。
2. 使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）定量每个级分的颗粒浓度。
   1. 使用以下建议的起始比例将样品稀释在1 mL的1x PBS中;对于馏分1-3，使用1:100，然后对于剩余的馏分，使用1:10稀释。
   2. 涡旋稀释的溶液，然后将样品吸入1 mL一次性注射器中。将注射器设置在自动注射泵中（如果可用）。
   3. 将注射泵设置为30μL / min，并使用屏幕增益为10-12，相机级别为10-12的视频捕获设置。调整每个样品的焦点。
   4. 使用恒定流以30秒的速度收集至少三个视频。
   5. 在软件检测阈值设置为 5 的情况下执行分析。
      注意:在不牺牲大量样品体积的情况下，可能无法获得最新馏分（>7）的NTA数据。

4. 山地车EV的资质

1. 使用银染蛋白质凝胶可视化每个级分的一般蛋白质谱。
   注意:SDS-PAGE和银染的详细程序可以在参考文献¹⁵中找到。
   1. 将SDS样品缓冲液加入10 μL每个级分和5 μg CFP，100R和100F中。在100°C下煮沸5分钟，然后用分子量梯度加载4%-12%双-Tris凝胶用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（参见 材料表）。
   2. 使用1x 2-[N-吗啉基]乙烷磺酸（MES）电泳缓冲液（参见 材料表）和200 V电流运行凝胶35分钟。
   3. 从凝胶盒中取出凝胶，然后进行银染¹⁵。
2. 通过蛋白质印迹评估每个馏分中EV标记物的存在与否。
   注:蛋白质印迹的详细程序可在参考文献¹⁵中找到。
   1. 按照步骤 4.1.1-4.1.2 中所述运行 SDS-PAGE 凝胶。
   2. 从凝胶盒中取出凝胶，并通过施加50 V电流至少1小时将分离的蛋白质转移到0.2μm硝酸纤维素膜（参见 材料表）中。
   3. 进行蛋白质印迹分析以评估感兴趣的蛋白质。推荐使用针对 LpqH、脂阿拉伯明聚糖 （LAM） 和 GroES 的一抗（参见 材料表）。
   4. 根据适用于下游应用的标记物的存在与否，汇集分数。
3. 通过透射电子显微镜（TEM）确认完整囊泡的存在。
   1. 通过加入15μL4%EM级多聚甲醛固定15μL囊泡样品，并在4°C下储存过夜。
   2. 通过清洁表面并制作亲水基板，制备200目碳型碳涂层铜TEM网格。
      注意:建议使用95%氩气，5%氧气和30%等离子功率进行等离子清洗1分钟。
   3. 将10μL固定样品滴到网格上，让样品粘附10分钟，然后用滤纸吸走多余的液体。
   4. 将网格漂浮在一滴超纯水上30秒，然后吸走多余的液体。
   5. 将网格漂浮在d%EM级乙酸铀酰滴剂上2分钟，然后吸走多余的液体。
   6. 让网格完全风干。
   7. 使用TEM（参见 材料表）在100 kV或类似电压下的图像。
      注意:应根据下游应用使用其他EV定量和表征方法。应参考细胞外囊泡¹⁸ 研究的最小信息作为指南，以确保所有EV研究的严谨性和可重复性。

结果

浓缩 来自结核分枝杆菌 （Mtb）的培养物滤液蛋白（CFP），定量，然后将3mg材料施用于尺寸排阻色谱（SEC）柱。蛋白质和颗粒浓度分别由支链氨基酸和NTA列举。蛋白质和颗粒回收的预期范围以及为这些结果获得的确切值报告在 表1中。远高于这些范围的值可能表示污染或色谱柱完整性问题。值明显较低，指向超滤步骤中的问题，因此需要将流过量与起始CFP和100R进行比较，以确定...

讨论

结核分枝杆菌 细胞外囊泡是高度抗原的储库，这使它们成为开发诊断工具和未来疫苗的有吸引力的途径^4，19，20。从历史上看，密度梯度超速离心已被用于将Mtb EV与其他可溶性分泌材料^分离8。虽然该过程是有效的，但它也非常耗时，技术上具有挑战性，并且可能会影响所得EV准备的完整性^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x MES SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientific	NP0002
96 well plate	Corning	15705-066
Automatic Fraction Collector	IZON Science	AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder	Invitrogen	10748010
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System	ThermoFisher Scientific	09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL	AbCam	ab6790	Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)	BEI Resources	NR-49223	Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)	BEI Resources	NR-13792	Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35	BEI Resources	NR-13811	Primary antibody
NanoClean 1070	Fischione Instruments		For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm	BioRad	1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
qEV Original 35 nm 5/pk	IZON Science	SP5-USD	SEC column
SDS sample buffer	Boster	AR1112	In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber	ThermoFisher Scientific	EI0001
Sigmafast BCIP/NBT	Millipore Sigma	B5655
Silver Stain Plus Kit	BioRad	1610449	In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400