마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

요약

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

초록

박테리아 감염의 맥락에서 세포 밖 소포 (EVs)의 역할은 미생물 생리학을 이해하기위한 새로운 길로 부상했습니다. 구체적으로, 결핵균 (Mtb) EVs는 숙주-병원체 상호작용 및 환경 스트레스에 대한 반응에서 역할을 한다. Mtb EV는 또한 항원성이 높으며 백신 성분으로서의 잠재력을 보여줍니다. Mtb EV를 정제하는 가장 일반적인 방법은 밀도 구배 초원심분리입니다. 이 프로세스에는 낮은 처리량, 낮은 수율, 고가의 장비에 대한 의존도, 기술적 과제 등 몇 가지 제한 사항이 있으며 결과 준비에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 초원심분리의 많은 한계에 대처하는 온화한 대안 방법입니다. 이 프로토콜은 SEC가 Mtb EV 농축에 효과적이며 신속하고 확장 가능한 방식으로 수율 증가의 고품질 Mtb EV 제제를 생산한다는 것을 보여줍니다. 또한, 정량화 및 검증 절차에 의한 밀도 구배 초원심분리와의 비교는 SEC의 이점을 입증합니다. EV 수량 (나노입자 추적 분석), 표현형 (투과 전자 현미경) 및 함량 (웨스턴 블롯팅)의 평가는 Mtb EV에 맞게 조정되지만 제공된 워크 플로는 다른 마이코 박테리아에 적용될 수 있습니다.

서문

병원균에 의한 세포밖 소포(EV) 방출은 감염성 질환을 통제하기 위한 새로운 기술을 잠금 해제하는 열쇠가 될 수 있다¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb)는 세계 인구의 약 삼분의 일을 감염시키고 매년 수백만 명의 사람들의 생명을 앗아가는 높은 결과의 병원체입니다². Mtb에 의한 EV 생산은 감염 3,4,5의 맥락에서 이들 EVs의 생물발생 및 다양한 역할(즉, 면역자극성, 면역억제^, 철분 및 영양소 획득)에서 애매하면서도 잘 문서화되어 있다. Mtb EVs의 조성을 이해하려는 노력은 면역학적 유의성의 지질 및 단백질을 함유하는 원형질막으로부터 유래된 50-150 nm 지질막-밀폐된 구체를 밝혀냈다 ^3,6. 박테리아 생리학에서 Mtb EVs의 역할에 대한 조사는 생존을 위한 환경 스트레스에 반응하여 박테리아 EV 조절의 중요성을 밝혀^{냈다 5}. 숙주-병원체 상호작용 연구는 해석하기가 더 복잡하지만, 증거는 Mtb EV가 숙주의 면역 반응에 영향을 미칠 수 있고 잠재적으로 효과적인 백신 접종 성분 3,4,7로서 작용할 수 있음을 나타낸다.

지금까지 Mtb EV에 대한 대부분의 연구는 소낭 농축을위한 밀도 구배 초원심분리에 의존했습니다⁸. 이것은 소규모 연구에 효과적이었습니다. 그러나이 기술에는 몇 가지 기술적 및 물류 문제가 있습니다. 대체 워크플로우는 전체 세포와 큰 파편을 제거하기 위해 다단계 원심분리를 결합하고 EV를 펠릿화하는 최종 초원심분리 단계를 거칩니다. 이러한 방법론은 효율성이 다양할 수 있으며, 종종 소낭 완전성에 영향을 미치는 동시에 가용성 비소포 관련 생체분자의 낮은 수율 및 공동 정제를 초래한다⁽⁹). 또한 이 프로세스는 시간이 많이 걸리고 수동으로 집약적이며 장비 제약으로 인해 처리량이 매우 제한적입니다.

본 프로토콜은 밀도 구배 초원심분리에 대한 대안적인 기술: 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 기술한다. 이 방법은 환경 마이코 박테리아에 대해 입증되었으며, 현재 연구에서 Mtb¹⁰으로 외삽되었습니다. 시판되는 컬럼 및 자동 분획 콜렉터는 소포 준비의 일관성을 향상시키고 특정하고 값 비싼 장비에 대한 필요성을 줄일 수 있습니다. 또한, 밀도 구배 초원심분리에 비해 시간의 일부분으로 이 프로토콜을 완료하여, 처리량을 증가시킬 수 있다. 이 기술은 기술적으로 덜 도전적이어서 마스터하기가 더 쉬워지고 실험실 간 / 실험실 내 재현성을 높일 수 있습니다. 마지막으로, SEC는 높은 분리 효율을 가지며 부드럽고 소포의 무결성을 보존합니다.

프로토콜

콜로라도 주립 대학 기관 생물 안전위원회는 본 연구를 승인했다 (19-046B). Mycobacterium tuberculosis 의 배양과 EV가 풍부한 배양 상청액의 수확은 높은 격리 실험실에서 훈련 된 인력에 의해 수행되었습니다. 이 물질은 유효한 불활성화 방법이 수행되고, 확인되고, 제도적 생물 안전 정책에 의해 승인 된 후 높은 봉쇄 구역 밖으로 옮겨졌습니다. 프로토콜을 복제하는 동안 검증된 불활성화 또는 멸균 여과 방법이 실현 가능하지 않은 경우 다음 절차를 높은 격리 실험실에서 수행해야 합니다.

1. 조질 Mtb EV 농축액의 제조

참고: Mtb 배양 및 배양 여액 단백질(CFP)의 제조에 대한 자세한 절차는 참고문헌^11,12를 참조하십시오. 박테리아 배양 배지는 올레산 알부민 덱스트로스 카탈라아제 (OADC)와 같은 EV 함유 또는 단백질 성분 및 트윈과 같은 세제를 함유 한 성장 보충제가없는 것이 좋습니다. 또한 박테리아 배양물의 품질 및 수확된 CFP를 선별하여 제한된 세포 사멸 및 용해^13,14를 보장하는 것이 좋습니다.

1. 인산염 완충 식염수(1x PBS)의 전체 부피 용량을 첨가하여 100 kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심 필터( 물질 표 참조)를 제조하였다. 4°C에서 2,800 x g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   참고: 데드스톱 부피가 없는 필터를 사용하는 경우, 시료 부피가 필터 레벨 미만으로 감소하지 않도록 주의하여 원심분리 중에 필터가 완전히 건조되도록 해야 합니다.
2. 샘플 챔버를 Mtb CFP로 최대 용량으로 채우기 전에 흐름 스루 및 임의의 나머지 PBS를 폐기한다. 부피가 한외여과 장치의 최소 부피로 감소할 때까지 4°C에서 2,800 x g 에서 원심분리한다. 필요에 따라 반복하여 전체 샘플이 충분히 감소될 때까지 단위에 CFP를 더 추가합니다.
   참고: 원하는 경우 다운스트림 인증을 위해 100kDa 플로우스루(100F) 재료의 일부를 보관하십시오. 4°C에서 보관한다.
3. 농축액을 포함하는 필터 유닛에 1x PBS를 최대 최대 장치 용량까지 첨가한다. 1.2에 설명된 대로 볼륨을 줄입니다. 이 단계를 다섯 번 반복하여 완전한 세척 및 버퍼 교환을 보장하십시오.
4. 한외여과 장치 사양에 따라 100 kDa 농축된 CFP 잔류물(100R)을 회수 한다(재료 표 참조). 일단 100R이 회수되면, 적어도 세 번 최소 부피의 1x PBS로 필터를 세척하고, 100R로 세척을 풀링하여 회수를 최대화한다.
5. 제조업체의 지시에 따라 bicinchoninic assay (BCA)로 100R 물질을 정량 화하십시오 (재료 표 참조). 분석을 수행하려면, PBS 중의 샘플 1:2, 1:5 및 1:10의 여러 희석물을 사용한다. 샘플을 세 배로 테스트합니다.
   참고: 원하는 경우 다운스트림 인증을 위해 100R 재료의 일부를 보관하십시오. 4°C에서 보관한다.

2. CFP로부터 Mtb EV의 농축을 위한 크기 배제 크로마토그래피

참고: 다음 절차는 SEC 컬럼 및 자동 분획 수집기(AFC, 자료표 참조)와 함께 3mg의 100R Mtb CFP를 사용하는 경우에 특정합니다. 제조업체의 사양에 따라 다른 시작 농도 및 컬럼 유형에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한 사용자는 자동 분수 수집기 사용자 설명서를 읽고 이해하는 것이 좋습니다.

1. SEC 컬럼이 실온으로 평형화되도록 허용하십시오.
2. 타워 장치 뒷면의 전원 스위치를 사용하여 AFC를 켜고 필요한 경우 주 메뉴 터치스크린에서 SETUP 을 눌러 로드 셀의 설정을 조정합니다. 로드 셀은 처음 사용할 때, 모든 소프트웨어 업데이트 후, 분수 수집 볼륨의 불일치가 감지되는 경우에만 보정해야 합니다.
3. 설정 화면에서 CALIBRATE에서 회전 목마를 선택하여 회전 목마> 정렬합니다. 13개의 작은 구멍이 AFC 타워를 향하도록 캐러셀을 삽입하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 유체 노즐이 플러시 위치 바로 위에 오도록 캐러셀을 조정합니다.
4. 평형화된 SEC 컬럼에서 캡을 제거합니다. SEC 컬럼을 적절한 컬럼 마운트에 밀어 AFC 타워에 조심스럽게 설치합니다. 컬럼의 무선 주파수 식별(RFID) 태그가 AFC를 향하는지 확인하고 컬럼과 밸브 사이의 연결이 안전한지 확인하십시오. 폐기물 배출구 튜브를 수집 용기에 넣으십시오.
5. 설정 화면에서 수집 일정을 선택하고 - 및/또는 + 버튼을 눌러 카운트를 13으로 설정하고 크기를 0.5 mL로 설정합니다. "버퍼 볼륨" 설정을 기본값인 2.7mL로 두고 X를 눌러 "수집 일정" 창을 닫습니다.
6. 홈 화면에서 컬렉션 시작을 선택하고 YES를 선택하여 컬렉션 매개 변수를 확인합니다. 뚜껑이 열려 있고 회전 목마 중심을 향하도록 표시된 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 로드(13)를 부착하십시오.
7. 확인을 선택하여 AFC를 진행한 다음 컬럼 저장소를 장착하고 OK를 눌러 다시 전진시킵니다. YES를 눌러 컬럼을 플러시하는 옵션을 선택하고 0.2μm 필터링된 PBS의 컬럼 부피 하나를 추가하여 스토리지 버퍼를 제거합니다. 플러시가 완료되면 OK를 눌러 AFC를 진행합니다.
8. 회전 목마 덮개를 AFC 위에 놓고 OK를 누릅니다. 여과된 PBS의 컬럼 부피 0.2 μm를 제조하였다. 피펫을 사용하여 열에서 과도한 버퍼를 제거하십시오.
9. 단계 1.5에서 정량된 바와 같이 3 mg의 100R 샘플을 500 μL로 1x PBS로 가져온다. 3 mg 샘플을 컬럼 상단에 첨가하십시오. AFC를 진행하고 샘플이 프릿으로 실행되도록 합니다. 샘플이 컬럼에 완전히 들어가면, 단계 2.6에서 제조된 PBS를 저장소에 첨가한다.
10. AFC가 먼저 보이드 볼륨을 수집한 다음 지정된 분수를 수집하는 동안 AFC의 실행을 모니터링합니다. 실행이 완료되고 회전 목마가 폐기물 위치로 돌아온 후 덮개를 제거하고 회전 목마에서 분수 튜브를 제거하십시오. 분획을 정량화 (단계 3) 및 검증 (단계 4) 전에 4°C에서 저장한다.
11. 열을 다시 사용할 경우 YES를 눌러 열을 정리하는 옵션을 선택합니다. 그렇지 않으면 NO를 누릅니다. AFC의 지침을 따릅니다.
    참고: 컬럼이 세척되고 저장 버퍼가 통과되면 제거, 캡핑 및 4°C에서 저장할 수 있습니다.

3. Mtb EV의 정량화

1. BCA 및 마이크로 BCA¹²를 사용하여 각 분획에 대한 단백질 농도를 측정하였다.
   1. 3 mg의 100R Mtb CFP로부터 수집된 0.5 mL 분획의 경우, 각 샘플의 1-7번 분획을 삼중으로 희석하여 1:3으로 희석한 마이크로 BCA를 사용한다.
   2. 5-13번으로 번호가 매겨진 0.5 mL 분획의 경우, 각 샘플에 대해 희석하지 않고 BCA를 삼중으로 사용한다.
      참고: 분획 5-7에 대한 분석을 겹치면 모든 분획이 판독 가능한 출력을 갖도록 하는 데 도움이 됩니다.
2. 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 각 분획에 대한 입자 농도를 정량화합니다.
   1. 샘플을 1 mL의 1x PBS로 희석하여 다음의 제안된 출발 비율을 사용하여; 분획 1-3의 경우 1:100을 사용한 다음 나머지 분획에 대해서는 1:10 희석을 사용합니다.
   2. 희석된 용액을 소용돌이치고, 이어서 샘플을 1 mL 일회용 주사기에 끌어당긴다. 가능한 경우 자동 주사기 펌프에 주사기를 설치하십시오.
   3. 주사기 펌프를 30μL/min으로 설정하고 화면 게인이 10-12이고 카메라 레벨이 10-12인 비디오 캡처 설정을 사용합니다. 각 샘플의 초점을 조정합니다.
   4. 일정한 흐름을 사용하여 각각 30 초에 최소 3 개의 비디오를 수집하십시오.
   5. 소프트웨어 검색 임계값을 다섯 개로 설정하여 분석을 수행합니다.
      참고: 상당한 샘플 부피를 희생하지 않고는 최신 분획 (>7)에 대한 NTA 데이터를 얻지 못할 수 있습니다.

4. Mtb EV의 자격

1. 은으로 염색된 단백질 겔을 사용하여 각 분획의 일반적인 단백질 프로파일을 시각화한다.
   참고: SDS-PAGE 및 은색 얼룩에 대한 자세한 절차는 참조¹⁵에서 찾을 수 있습니다.
   1. SDS 샘플 버퍼를 각 분획의 10 μL와 5 μg의 CFP, 100R 및 100F에 첨가한다. 100°C에서 5분 동안 끓인 다음, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 위한 분자량 사다리를 갖는 4%-12% 비스-트리스 겔에 로딩한다( 표 참조).
   2. 겔을 1x 2-[N-모르폴리노]에탄술폰산(MES) 실행 완충액( 물질표 참조) 및 200V 전류를 사용하여 35분 동안 실행한다.
   3. 카세트로부터 겔을 제거하고 은 염색(¹⁵)을 진행한다.
2. 웨스턴 블롯에 의해 각 분획에서 EV 마커의 존재 또는 부재를 평가한다.
   참고: 웨스턴 블롯팅에 대한 자세한 절차는 참조¹⁵에서 찾을 수 있습니다.
   1. 단계 4.1.1-4.1.2에 설명된 대로 SDS-PAGE 겔을 실행한다.
   2. 카세트로부터 겔을 제거하고, 분해된 단백질을 최소 1시간 동안 50 V 전류를 인가함으로써 0.2 μm 니트로셀룰로스 막( 물질의 표 참조)으로 옮긴다.
   3. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 관심있는 단백질을 평가하십시오. LpqH, 리포아라비노만난(LAM) 및 GroES( 물질 표 참조)에 대한 일차 항체가 권장됩니다.
   4. 풀 분수는 다운스트림 애플리케이션에 적용 가능한 마커의 존재 또는 부재에 기초한다.
3. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 손상되지 않은 소포의 존재를 확인합니다.
   1. 15 μL의 4% EM 등급 파라포름알데히드를 첨가하여 15 μL의 소낭 샘플을 고정하고 하룻밤 동안 4°C에서 보관한다.
   2. 표면을 청소하고 친수성 기판을 제작하여 200 메쉬 폼바 탄소 코팅 구리 TEM 그리드를 준비하십시오.
      참고: 아르곤 95%, 산소 5%, 플라즈마 전력 30%로 1분 동안 플라즈마 세척을 권장합니다.
   3. 고정된 샘플 10μL를 그리드 상에 떨어뜨리고 샘플이 10분 동안 접착되도록 한 다음, 과량의 액체를 여과지로 닦아냅니다.
   4. 그리드를 초순수 한 방울에 30 초 동안 떠 올린 다음 과도한 액체를 닦아냅니다.
   5. 그리드를 d% EM 등급 우라닐 아세테이트 방울에 2분 동안 떨어뜨린 다음, 과량의 액체를 뽑아냅니다.
   6. 그리드가 완전히 건조되도록 하십시오.
   7. 100kV 또는 이와 유사한 TEM ( 재료 표 참조)을 사용하는 이미지.
      참고: 다른 EV 정량 및 특성화 방법은 다운스트림 애플리케이션을 기반으로 사용해야 합니다. 세포밖 소포¹⁸ 의 연구를위한 최소한의 정보는 모든 EV 연구의 엄격함과 재현성을 보장하기위한 지침을 참조해야합니다.

결과

결핵균(Mtb)으로부터 배양여액 단백질(CFP)을 농축, 정량한 다음, 물질 3 mg을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼에 적용하였다. 단백질 및 입자 농도를 각각 BCA 및 NTA로 열거하였다. 단백질 및 입자 회수에 대한 예상 범위와 이러한 결과에 대해 수득된 정확한 값이 표 1에 보고되어 있다. 이러한 범위보다 훨씬 높은 값은 오염 또는 컬럼 무결성 문제를 나타낼 수 있습니다. 값은 한?...

토론

마이코박테리움 결핵 세포밖 소포는 항원성이 높은 저장소로, 진단 도구 및 미래 백신 ^4,19,20 개발을 위한 매력적인 길로 제시됩니다. 역사적으로, 밀도 구배 초원심분리는 Mtb EV를 다른 용해성, 분비 물질⁽⁸)로부터 분리하는데 사용되어 왔다. 이 공정은 효과적이지만, 또한 시간이 많이 걸리고, 기술적으...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x MES SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientific	NP0002
96 well plate	Corning	15705-066
Automatic Fraction Collector	IZON Science	AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder	Invitrogen	10748010
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System	ThermoFisher Scientific	09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL	AbCam	ab6790	Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)	BEI Resources	NR-49223	Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)	BEI Resources	NR-13792	Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35	BEI Resources	NR-13811	Primary antibody
NanoClean 1070	Fischione Instruments		For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm	BioRad	1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
qEV Original 35 nm 5/pk	IZON Science	SP5-USD	SEC column
SDS sample buffer	Boster	AR1112	In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber	ThermoFisher Scientific	EI0001
Sigmafast BCIP/NBT	Millipore Sigma	B5655
Silver Stain Plus Kit	BioRad	1610449	In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400