Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Resumen

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Resumen

El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.

Introducción

La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año². La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infe....

Protocolo

El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el protocolo, si la inactivación validada o el método de filtración estéril no son factibles, los siguientes procedimientos deben realizarse en un laboratorio de alta c....

Resultados

La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rango.......

Discusión

Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas ^4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados⁸. Si bien este proceso es efecti.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x MES SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientific	NP0002
96 well plate	Corning	15705-066
Automatic Fraction Collector	IZON Science	AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder	Invitrogen	10748010
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System	ThermoFisher Scientific	09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL	AbCam	ab6790	Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)	BEI Resources	NR-49223	Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)	BEI Resources	NR-13792	Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35	BEI Resources	NR-13811	Primary antibody
NanoClean 1070	Fischione Instruments		For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm	BioRad	1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
qEV Original 35 nm 5/pk	IZON Science	SP5-USD	SEC column
SDS sample buffer	Boster	AR1112	In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber	ThermoFisher Scientific	EI0001
Sigmafast BCIP/NBT	Millipore Sigma	B5655
Silver Stain Plus Kit	BioRad	1610449	In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400