Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Resumen

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Resumen

El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.

Introducción

La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas¹. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año². La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infección ^3,4,5. Los esfuerzos para comprender la composición de los EV Mtb revelaron esferas encerradas en la membrana lipídica de 50-150 nm derivadas de la membrana plasmática que contienen lípidos y proteínas de importancia inmunológica ^3,6. La investigación del papel de los EV Mtb en la fisiología bacteriana ha revelado la importancia de la modulación bacteriana ev en respuesta al estrés ambiental para la supervivencia⁵. Los estudios de interacción huésped-patógeno han sido más complicados de interpretar, pero la evidencia indica que los EV Mtb pueden influir en la respuesta inmune del huésped y pueden servir potencialmente como un componente de vacunación efectivo ^3,4,7.

La mayoría de los estudios de EV Mtb hasta ahora se han basado en la ultracentrifugación por gradiente de densidad para el enriquecimiento de vesículas⁸. Esto ha sido eficaz para los estudios a pequeña escala; sin embargo, esta técnica tiene varios desafíos técnicos y logísticos. Los flujos de trabajo alternativos combinan la centrifugación de varios pasos, para la eliminación de células enteras y escombros grandes, con un paso final de ultracentrifugación para granular evs. Esta metodología puede variar en eficiencia y, a menudo, da como resultado un bajo rendimiento y copurificación de biomoléculas solubles asociadas a vesículas no vesículas, al tiempo que afecta la integridad de las vesículas⁹. Además, este proceso requiere mucho tiempo, es intensivo manualmente y tiene un rendimiento muy limitado debido a las limitaciones del equipo.

El presente protocolo describe una técnica alternativa a la ultracentrifugación por gradiente de densidad: la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Este método ha sido demostrado para micobacterias ambientales, y en el trabajo actual, se ha extrapolado a Mtb¹⁰. Una columna disponible comercialmente y un colector automático de fracción pueden mejorar la consistencia en la preparación vesical y reducir la necesidad de equipos específicos y costosos. También es posible completar este protocolo en una fracción del tiempo en comparación con la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que aumenta el rendimiento. Esta técnica es menos desafiante técnicamente, por lo que es más fácil de dominar, y puede aumentar la reproducibilidad inter / intra-laboratorio. Finalmente, SEC tiene una alta eficiencia de separación y es suave, preservando la integridad de las vesículas.

Protocolo

El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el protocolo, si la inactivación validada o el método de filtración estéril no son factibles, los siguientes procedimientos deben realizarse en un laboratorio de alta contención.

1. Preparación de concentrado crudo Mtb EV

NOTA: Para procedimientos detallados sobre el cultivo de Mtb y la preparación de proteínas de filtrado de cultivo (CFP), ver Referencias^11,12. Se recomienda que los medios de cultivo bacteriano estén libres de suplementos de crecimiento con componentes proteínicos o que contengan EV, como la albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC), y detergentes como Tween. También se recomienda que la calidad del cultivo bacteriano y la CFP cosechada se examinen para garantizar una muerte celular limitada y la lisis ^13,14.

1. Prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte la Tabla de materiales) agregando la capacidad de volumen completo de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Centrifugadora durante 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
   NOTA: Si utiliza un filtro sin volumen de parada muerta, se debe tener cuidado para garantizar que el volumen de la muestra no se reduzca por debajo del nivel del filtro, lo que resulta en un secado completo del filtro durante la centrifugación.
2. Deseche el flujo de flujo y cualquier PBS restante antes de llenar la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repetir según sea necesario, añadiendo más CFP a la unidad hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente.
   NOTA: Conserve una parte del material de flujo continuo de 100 kDa (100F) para la calificación aguas abajo si lo desea. Conservar a 4 °C.
3. Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describe en 1.2. Repita este paso cinco veces para garantizar un lavado completo y un intercambio de tampón.
4. Recupere el retentate CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración (consulte la Tabla de Materiales). Una vez que se recupera el 100R, lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces, y agrupe el lavado con el 100R para maximizar la recuperación.
5. Cuantificar el material 100R con un ensayo bicinconónico (BCA) siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Para realizar el ensayo, use varias diluciones de muestras 1:2, 1:5 y 1:10 en PBS. Pruebe la muestra por triplicado.
   NOTA: Conserve una parte del material 100R para la calificación posterior si lo desea. Conservar a 4 °C.

2. Cromatografía de exclusión de tamaño para el enriquecimiento de EV Mtb a partir de CFP

NOTA: El siguiente procedimiento es específico para el uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb con columna SEC y colector automático de fracción (AFC, ver Tabla de Materiales). Se puede adaptar para otras concentraciones iniciales y tipos de columna siguiendo las especificaciones del fabricante. Además, se recomienda a los usuarios que lean y comprendan el manual de usuario del colector automático de fracciones.

1. Permita que la columna SEC se equilibre a temperatura ambiente.
2. Encienda el AFC con el interruptor de encendido en la parte posterior de la unidad de torre y ajuste la configuración de la célula de carga, si es necesario, presionando SETUP en la pantalla táctil del menú principal. La célula de carga solo debe calibrarse en el primer uso, después de cada actualización de software y si se observa inconsistencia en los volúmenes de recolección de fracciones.
3. En la pantalla SETUP , alinee el carrusel seleccionando CARRUSEL > CALIBRAR. Inserte el carrusel con los 13 pequeños orificios orientados hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga presionando los botones - y / o + .
4. Retire las tapas de la columna SEC equilibrada. Deslice la columna SEC en el soporte de columna apropiado e instálela cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia (RFID) en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recogida.
5. En la pantalla SETUP , seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 ml pulsando los botones - y/o + . Deje la configuración "Volumen de búfer" como predeterminada de 2.7 ml y luego cierre la ventana "Programación de recopilación" presionando X.
6. Seleccione INICIAR COLECCIÓN en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de la colección seleccionando SÍ. Cargue 13 tubos de microcentrífuga etiquetados de 1,7 ml con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel.
7. Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando SÍ y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK.
8. Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.
9. Traiga 3 mg de muestra de 100R según lo cuantificado en el paso 1.5 a 500 μL con 1x PBS. Agregue la muestra de 3 mg a la parte superior de la columna. Avance el AFC y permita que la muestra se tope con la frita. Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado en el paso 2.6 al depósito.
10. Supervise el funcionamiento del AFC mientras recoge primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Una vez que se complete la carrera y el carrusel vuelva a la posición de desperdicio, retire la cubierta y retire los tubos de fracción del carrusel. Almacene las fracciones a 4 °C antes de la cuantificación (paso 3) y la calificación (paso 4).
11. Si la columna se va a reutilizar, seleccione la opción para limpiar la columna pulsando SÍ; de lo contrario, presione NO. Siga las instrucciones de la AFC.
    NOTA: Una vez que la columna se lava y el búfer de almacenamiento se ha ejecutado, se puede quitar, tapar y almacenar a 4 °C.

3. Cuantificación de los vehículos eléctricos Mtb

1. Mida la concentración de proteínas para cada fracción usando BCA y micro BCA¹².
   1. Para fracciones de 0,5 ml recogidas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilice el micro BCA con una dilución de 1:3 para las fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado.
   2. Para fracciones de 0,5 ml numeradas 5-13, utilice el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado.
      NOTA: La superposición de los ensayos para las fracciones 5-7 ayudará a garantizar que todas las fracciones tengan una salida legible.
2. Cuantificar la concentración de partículas para cada fracción mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
   1. Diluya las muestras en 1 ml de 1x PBS utilizando las siguientes proporciones iniciales sugeridas; para las fracciones 1-3, use 1:100, y luego para las fracciones restantes, use una dilución 1:10.
   2. Vórtice las soluciones diluidas y luego extraiga la muestra en una jeringa desechable de 1 ml. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa automática si está disponible.
   3. Ajuste la bomba de jeringa a 30 μL/min y utilice la configuración de captura de vídeo con una ganancia de pantalla de 10-12 y un nivel de cámara de 10-12. Ajuste el enfoque para cada muestra.
   4. Recopile un mínimo de tres videos a 30 s cada uno utilizando un flujo constante.
   5. Realice el análisis con el umbral de detección de software establecido en cinco.
      NOTA: Es posible que no sea posible obtener datos de NTA para las últimas fracciones (>7) sin sacrificar un volumen de muestra significativo.

4. Calificación de los vehículos eléctricos Mtb

1. Visualice el perfil general de proteínas de cada fracción utilizando un gel de proteína teñido de plata.
   NOTA: Los procedimientos detallados para SDS-PAGE y tinción de plata se pueden encontrar en la Referencia¹⁵.
   1. Agregue el tampón de muestra SDS a 10 μL de cada fracción y 5 μg de CFP, 100R y 100F. Hervir durante 5 min a 100 °C, luego cargar en un gel Bis-Tris al 4%-12% con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabla de materiales).
   2. Ejecute el gel utilizando 1 tampón de 2-[N-morfolino]ácido etanosulfónico (MES) (consulte la Tabla de materiales) y una corriente de 200 V durante 35 min.
   3. Retire el gel del cassette y proceda con la tinción de plata¹⁵.
2. Evaluar la presencia o ausencia de marcadores EV en cada fracción por Western blot.
   NOTA: Los procedimientos detallados para Western blotting se pueden encontrar en la Referencia¹⁵.
   1. Ejecute un gel SDS-PAGE como se describe en los pasos 4.1.1-4.1.2.
   2. Retire el gel del cassette y transfiera las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm (ver Tabla de Materiales) aplicando una corriente de 50 V durante un mínimo de 1 h.
   3. Realizar análisis de Western blot para evaluar proteínas de interés. Se recomiendan anticuerpos primarios contra LpqH, lipoarabinomanano (LAM) y GroES (ver Tabla de Materiales).
   4. Fracciones de agrupación basadas en la presencia o ausencia de marcadores, según corresponda para la aplicación posterior.
3. Confirmar la presencia de vesículas intactas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
   1. Fije 15 μL de la muestra de vesícula agregando 15 μL de paraformaldehído de grado EM al 4% y guárdelo a 4 ° C durante la noche.
   2. Prepare una rejilla TEM de cobre recubierta de carbono formvar de 200 mallas limpiando la superficie y haciendo un sustrato hidrófilo.
      NOTA: Se recomienda la limpieza con plasma con 95% de argón, 5% de oxígeno y 30% de potencia plasmática durante 1 minuto.
   3. Deje caer 10 μL de la muestra fija en la rejilla y deje que la muestra se adhiera durante 10 minutos, luego borre el exceso de líquido con papel de filtro.
   4. Flote la rejilla en una gota de agua ultrapura durante 30 s, luego elimine el exceso de líquido.
   5. Flote la rejilla en una gota de acetato de uranilo de grado EM al% durante 2 minutos, luego borre el exceso de líquido.
   6. Deje que la rejilla se seque completamente al aire.
   7. Imagen utilizando un TEM (ver Tabla de Materiales) a 100 kV o similar.
      NOTA: Se deben utilizar otros métodos de cuantificación y caracterización de vehículos eléctricos en función de las aplicaciones posteriores. La Información Mínima para Estudios de Vesículas Extracelulares¹⁸ debe ser consultada para obtener pautas que aseguren el rigor y la reproducibilidad de todos los estudios de EV.

Resultados

La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rango...

Discusión

Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas ^4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados⁸. Si bien este proceso es efecti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x MES SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientific	NP0002
96 well plate	Corning	15705-066
Automatic Fraction Collector	IZON Science	AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder	Invitrogen	10748010
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System	ThermoFisher Scientific	09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL	AbCam	ab6790	Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)	BEI Resources	NR-49223	Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)	BEI Resources	NR-13792	Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35	BEI Resources	NR-13811	Primary antibody
NanoClean 1070	Fischione Instruments		For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm	BioRad	1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
qEV Original 35 nm 5/pk	IZON Science	SP5-USD	SEC column
SDS sample buffer	Boster	AR1112	In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber	ThermoFisher Scientific	EI0001
Sigmafast BCIP/NBT	Millipore Sigma	B5655
Silver Stain Plus Kit	BioRad	1610449	In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400