Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.

Zusammenfassung

Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.

Einleitung

Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten^{sein 1}. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert². Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion ^3,4,5. Bemühungen, die Zusammensetzung von Mtb-EVs zu verstehen, zeigten 50-150 nm Lipidmembran-umschlossene Kugeln, die aus der Plasmamembran stammen, die Lipide und Proteine von immunologischer Bedeutung enthält ^3,6. Die Untersuchung der Rolle von Mtb-EVs in der bakteriellen Physiologie hat die Bedeutung der bakteriellen EV-Modulation als Reaktion auf Umweltstress für das Überleben^{gezeigt 5}. Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien waren komplizierter zu interpretieren, aber es gibt Hinweise darauf, dass Mtb-EVs die Immunantwort des Wirts beeinflussen können und möglicherweise als wirksame Impfkomponente^{dienen können} 3,4,7.

Die meisten Studien an Mtb-EVs haben sich bisher auf die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation für die Vesikelanreicherung^{verlassen 8}. Dies hat sich für kleine Studien als wirksam erwiesen; Diese Technik hat jedoch mehrere technische und logistische Herausforderungen. Alternative Workflows koppeln die mehrstufige Zentrifugation zur Entfernung ganzer Zellen und großer Ablagerungen mit einem abschließenden Ultrazentrifugationsschritt zur Pelletierung von Elektrofahrzeugen. Diese Methodik kann in ihrer Effizienz variieren und führt oft zu einer geringen Ausbeute und Mitreinigung löslicher nicht-vesikelassoziierter Biomoleküle und beeinflusst gleichzeitig die Vesikelintegrität⁹. Darüber hinaus ist dieser Prozess zeitaufwändig, manuell intensiv und aufgrund von Gerätebeschränkungen sehr begrenzt im Durchsatz.

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine alternative Technik zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation: die Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Methode wurde für Umweltmykobakterien demonstriert und in der aktuellen Arbeit auf Mtb¹⁰ extrapoliert. Eine handelsübliche Säule und ein automatischer Fraktionssammler können die Konsistenz bei der vesikalen Vorbereitung verbessern und die Notwendigkeit für spezifische, teure Geräte reduzieren. Es ist auch möglich, dieses Protokoll in einem Bruchteil der Zeit im Vergleich zur Dichtegradienten-Ultrazentrifugation abzuschließen, wodurch der Durchsatz erhöht wird. Diese Technik ist technisch weniger anspruchsvoll, was die Beherrschung erleichtert und die Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Labors erhöhen kann. Schließlich hat SEC eine hohe Abscheideeffizienz und ist schonend, wobei die Integrität der Vesikel erhalten bleibt.

Protokoll

Das Institutional Biosafety Committee der Colorado State University genehmigte die vorliegende Studie (19-046B). Die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis und die Ernte von EV-reichen Kulturüberständen wurden von geschultem Personal in einem High-Containment-Labor durchgeführt. Die Materialien wurden aus dem High-Containment-Bereich entfernt, nachdem eine gültige Inaktivierungsmethode durchgeführt, bestätigt und durch institutionelle Biosicherheitsrichtlinien genehmigt wurde. Während der Replikation des Protokolls, wenn eine validierte Inaktivierungs- oder Sterilfiltrationsmethode nicht möglich ist, müssen die folgenden Verfahren in einem High-Containment-Labor durchgeführt werden.

1. Herstellung von rohem Mtb EV-Konzentrat

HINWEIS: Für detaillierte Verfahren zum Anbau von Mtb und zur Herstellung von Kulturfiltratprotein (CFP) siehe Referenzen^11,12. Es wird empfohlen, dass bakterielle Kulturmedien frei von Wachstumspräparaten mit EV-haltigen oder proteinhaltigen Komponenten wie Öl-Albumin-Dextrose-Katase (OADC) und Reinigungsmitteln wie Tween sind. Es wird auch empfohlen, die Qualität der Bakterienkultur und die geerntete CFP zu untersuchen, um einen begrenzten Zelltod und eine begrenzte Lyse zu gewährleisten^13,14.

1. Bereiten Sie einen 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Zentrifugalfilter (MWCO) vor (siehe Materialtabelle), indem Sie die volle Volumenkapazität von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) hinzufügen. Zentrifuge für 5 min bei 2.800 x g bei 4 °C.
   HINWEIS: Wenn Sie einen Filter ohne Totstoppvolumen verwenden, muss darauf geachtet werden, dass das Probenvolumen nicht unter den Filterpegel sinkt, was zu einer vollständigen Filtertrocknung während der Zentrifugation führt.
2. Verwerfen Sie den Durchfluss und alle verbleibenden PBS, bevor Sie die Probenkammer mit Mtb CFP bis zu ihrer maximalen Kapazität füllen. Zentrifen Sie bei 2.800 x g bei 4 °C, bis sich das Volumen auf das Mindestvolumen der Ultrafiltrationsvorrichtung reduziert hat. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, und fügen Sie der Einheit mehr CFP hinzu, bis die gesamte Probe ausreichend reduziert wurde.
   HINWEIS: Behalten Sie bei Bedarf einen Teil des 100-kDa-Durchflussmaterials (100 F) für die nachgelagerte Qualifizierung bei. Bei 4 °C lagern.
3. Geben Sie 1x PBS zu der Filtereinheit, die das Konzentrat enthält, bis zur Gesamtkapazität des Geräts. Verringern Sie die Lautstärke wie in 1.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal, um eine vollständige Wäsche und einen vollständigen Pufferaustausch sicherzustellen.
4. Rückgewinnung des 100 kDa konzentrierten CFP-Retentats (100R) gemäß den Spezifikationen der Ultrafiltrationsgeräte (siehe Materialtabelle). Sobald der 100R wiederhergestellt ist, waschen Sie den Filter mit einem minimalen Volumen von 1x PBS mindestens dreimal und legen Sie die Wäsche mit dem 100R zusammen, um die Ausbeute zu maximieren.
5. Quantifizieren Sie das 100R-Material mit einem bicinchoninischen Assay (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle). Um den Assay durchzuführen, verwenden Sie mehrere Verdünnungen der Proben 1:2, 1:5 und 1:10 in PBS. Testen Sie die Probe in dreifacher Ausfertigung.
   HINWEIS: Bewahren Sie bei Bedarf einen Teil des 100R-Materials für die nachgelagerte Qualifizierung auf. Bei 4 °C lagern.

2. Größenausschlusschromatographie zur Anreicherung von Mtb EVs aus CFP

HINWEIS: Das folgende Verfahren ist spezifisch für die Verwendung von 3 mg 100R Mtb CFP mit SEC-Säule und automatischem Fraktionssammler (AFC, siehe Materialtabelle). Es kann für andere Startkonzentrationen und Säulentypen angepasst werden, indem es den Herstellerangaben folgt. Darüber hinaus wird den Benutzern empfohlen, das Benutzerhandbuch für den automatischen Fraktionssammler zu lesen und zu verstehen.

1. Lassen Sie die SEC-Spalte auf Raumtemperatur ausgleichen.
2. Schalten Sie den AFC über den Netzschalter auf der Rückseite der Tower-Einheit ein und passen Sie die Einstellungen für die Wägezelle bei Bedarf an, indem Sie SETUP auf dem Touchscreen des Hauptmenüs drücken. Die Wägezelle muss nur bei der ersten Verwendung, nach jedem Software-Update und wenn Inkonsistenzen in den Bruchstückzahlen festgestellt werden, kalibriert werden.
3. Richten Sie das Karussell im Bildschirm SETUP aus, indem Sie KARUSSELL > CALIBRATE auswählen. Setzen Sie das Karussell mit den 13 kleinen Löchern nach oben in den AFC-Turm ein und stellen Sie das Karussell so ein, dass sich die Flüssigkeitsdüse direkt über der bündigen Position befindet, indem Sie die Tasten - und/oder + drücken.
4. Entfernen Sie die Kappen aus der gleichgewichteten SEC-Spalte. Schieben Sie die SEC-Säule in die entsprechende Säulenhalterung und installieren Sie sie vorsichtig auf dem AFC-Tower. Stellen Sie sicher, dass das RFID-Tag (Radio Frequency Identification) auf der Säule dem AFC zugewandt ist, und überprüfen Sie, ob die Verbindung zwischen der Säule und dem Ventil sicher ist. Legen Sie den Abfallauslassschlauch in einen Sammelbehälter.
5. Wählen Sie auf dem Bildschirm SETUP die Option Abholzeitplan aus, und legen Sie die Anzahl auf 13 und die Größe auf 0,5 ml fest, indem Sie die Tasten - und/oder + drücken. Lassen Sie die Einstellung "Puffervolumen" als Standard von 2,7 ml und schließen Sie dann das Fenster "Sammlungszeitplan" durch Drücken von X.
6. Wählen Sie auf dem Startbildschirm SAMMLUNG starten und bestätigen Sie die Sammlungsparameter durch Auswahl von JA. Laden Sie 13 beschriftete 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit geöffneten Deckeln und zeigen Sie auf die Karussellmitte.
7. Bewegen Sie den AFC vor, indem Sie OK auswählen, montieren Sie dann das Säulenreservoir und fahren Sie erneut vor, indem Sie OK drücken. Wählen Sie die Option zum Leeren der Spalte durch Drücken von JA und fügen Sie ein Spaltenvolumen von 0,2 μm gefiltertem PBS hinzu, um Speicherpuffer zu entfernen. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, bewegen Sie den AFC voran, indem Sie OK drücken.
8. Legen Sie die Karussellabdeckung über den AFC und drücken Sie OK. Bereiten Sie ein Spaltenvolumen von 0,2 μm gefiltertem PBS vor. Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssigen Puffer aus der Spalte zu entfernen.
9. Bringen Sie 3 mg 100R-Probe, wie in Schritt 1,5 bis 500 μL mit 1x PBS quantifiziert. Fügen Sie die 3-mg-Probe oben in der Spalte hinzu. Bewegen Sie den AFC vor, und lassen Sie die Probe in die Fritte laufen. Sobald die Probe vollständig in die Spalte eingedrungen ist, fügen Sie den in Schritt 2.6 vorbereiteten PBS dem Reservoir hinzu.
10. Überwachen Sie den Lauf des AFC, während er zuerst das Void-Volume und dann die angegebenen Brüche sammelt. Nachdem der Lauf beendet ist und das Karussell in die Abfallposition zurückkehrt, entfernen Sie die Abdeckung und entfernen Sie die Fraktionsrohre vom Karussell. Lagern Sie die Fraktionen vor der Quantifizierung (Schritt 3) und Qualifizierung (Schritt 4) bei 4 °C.
11. Wenn die Spalte wiederverwendet werden soll, wählen Sie die Option zum Bereinigen der Spalte aus, indem Sie JA drücken. Andernfalls drücken Sie NO. Folgen Sie den Anweisungen auf der AFC.
    HINWEIS: Sobald die Säule gewaschen ist und der Speicherpuffer durchgelaufen ist, kann sie entfernt, gekappt und bei 4 °C gelagert werden.

3. Quantifizierung der MTB EVs

1. Messen Sie die Proteinkonzentration für jede Fraktion mit BCA und Mikro-BCA¹².
   1. Für 0,5 ml Fraktionen, die aus 3 mg 100R Mtb CFP gewonnen wurden, verwenden Sie den Mikro-BCA mit einer 1:3-Verdünnung für Fraktionen, die 1-7 jeder Probe dreifach nummeriert sind.
   2. Verwenden Sie für 0,5 ml-Fraktionen mit den Nummern 5-13 den BCA ohne Verdünnung für jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
      HINWEIS: Die Überlappung der Assays für die Fraktionen 5-7 trägt dazu bei, dass alle Fraktionen eine lesbare Ausgabe haben.
2. Quantifizieren Sie die Partikelkonzentration für jede Fraktion mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA).
   1. Verdünnen Sie die Proben in 1 ml von 1x PBS unter Verwendung der folgenden vorgeschlagenen Startverhältnisse; Verwenden Sie für die Brüche 1-3 1:100 und dann für die restlichen Brüche eine 1:10-Verdünnung.
   2. Wirbeln Sie die verdünnten Lösungen vor und ziehen Sie dann die Probe in eine 1-ml-Einwegspritze. Stellen Sie die Spritze in einer automatischen Spritzenpumpe ein, falls verfügbar.
   3. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf 30 μL/min ein und verwenden Sie die Videoaufnahmeeinstellungen mit einer Bildschirmverstärkung von 10-12 und einem Kamerapegel von 10-12. Passen Sie den Fokus für jede Probe an.
   4. Sammeln Sie mindestens drei Videos zu je 30 s mit einem konstanten Fluss.
   5. Führen Sie die Analyse durch, wenn der Softwareerkennungsschwellenwert auf fünf festgelegt ist.
      HINWEIS: Es ist möglicherweise nicht möglich, NTA-Daten für die neuesten Fraktionen (>7) zu erhalten, ohne ein signifikantes Probenvolumen zu opfern.

4. Qualifizierung von Mtb EVs

1. Visualisieren Sie das allgemeine Proteinprofil jeder Fraktion mit einem silbergefärbten Proteingel.
   HINWEIS: Detaillierte Verfahren für SDS-PAGE und Silberflecken finden Sie in Referenz¹⁵.
   1. Fügen Sie SDS-Probenpuffer zu 10 μL jeder Fraktion und 5 μg CFP, 100R und 100F hinzu. 5 min bei 100 °C kochen, dann auf ein 4%-12% Bis-Tris Gel mit einer Molekulargewichtsleiter für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) (siehe Materialtabelle) laden.
   2. Lassen Sie das Gel mit 1x 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) laufendem Puffer (siehe Materialtabelle) und einem 200 V Strom für 35 min laufen.
   3. Entfernen Sie das Gel von der Kassette und fahren Sie mit der Silberfärbung¹⁵ fort.
2. Bewerten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von EV-Markern in jedem Bruchteil durch Western Blot.
   HINWEIS: Detaillierte Verfahren für Western Blotting finden Sie in Referenz¹⁵.
   1. Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel wie in den Schritten 4.1.1-4.1.2 beschrieben aus.
   2. Entfernen Sie das Gel von der Kassette und übertragen Sie die aufgelösten Proteine auf eine 0,2 μm Nitrocellulosemembran (siehe Materialtabelle), indem Sie einen 50-V-Strom für mindestens 1 h anlegen.
   3. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse durch, um Proteine von Interesse zu bewerten. Primäre Antikörper gegen LpqH, Lipoarabinomannan (LAM) und GroES (siehe Materialtabelle) werden empfohlen.
   4. Pool-Fraktionen basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von Markern, die für die nachgeschaltete Anwendung anwendbar sind.
3. Bestätigen Sie das Vorhandensein intakter Vesikel durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).
   1. Fixieren Sie 15 μL der Vesikelprobe durch Zugabe von 15 μL Paraformaldehyd in EM-Qualität und lagern Sie sie über Nacht bei 4 °C.
   2. Bereiten Sie ein 200-Mesh-Formvar-Carbon-beschichtetes Kupfer-TEM-Gitter vor, indem Sie die Oberfläche reinigen und ein hydrophiles Substrat herstellen.
      HINWEIS: Eine Plasmareinigung mit 95% Argon, 5% Sauerstoff und 30% Plasmaleistung für 1 min wird empfohlen.
   3. Lassen Sie 10 μL der festen Probe auf das Gitter fallen und lassen Sie die Probe 10 Minuten anhaften, dann tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier ab.
   4. Schwimmen Sie das Gitter 30 s lang auf einem Tropfen Reinstwasser und tupfen Sie dann überschüssige Flüssigkeit ab.
   5. Lassen Sie das Gitter auf einem d% EM-Uranylacetat-Tropfen für 2 Minuten schweben und tupfen Sie dann die überschüssige Flüssigkeit ab.
   6. Lassen Sie das Gitter vollständig an der Luft trocknen.
   7. Bild mit einem TEM (siehe Materialverzeichnis) bei 100 kV oder ähnlichem.
      HINWEIS: Andere EV-Quantifizierungs- und Charakterisierungsmethoden sollten basierend auf nachgelagerten Anwendungen verwendet werden. Die Minimalinformationen für Studien an extrazellulären Vesikeln¹⁸ sollten als Leitlinien konsultiert werden, um die Strenge und Reproduzierbarkeit aller EV-Studien zu gewährleisten.

Ergebnisse

Kulturfiltratprotein (CFP) aus Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde konzentriert, quantifiziert und dann 3 mg Material auf eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) aufgetragen. Die Protein- und Partikelkonzentrationen wurden von BCA bzw. NTA aufgezählt. Die erwarteten Bereiche für die Protein- und Partikelrückgewinnung sowie die genauen Werte, die für diese Ergebnisse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Werte, die viel höher als diese Bereiche sind, können auf Verunrei...

Diskussion

Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffen^{darstellen 4,19,20}. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Material^{zu trennen 8}. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er au...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
20x MES SDS Running Buffer	ThermoFisher Scientific	NP0002
96 well plate	Corning	15705-066
Automatic Fraction Collector	IZON Science	AFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein Ladder	Invitrogen	10748010
Benchtop centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff	Millipore Sigma	UFC710008	Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting System	ThermoFisher Scientific	09-528-135
EM Grade Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids	Electron Microscopy Sciences	FCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL	AbCam	ab6790	Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron Microscope	JOEL
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Microplate reader	BIOTEK	Epoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)	BEI Resources	NR-49223	Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)	BEI Resources	NR-13792	Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35	BEI Resources	NR-13811	Primary antibody
NanoClean 1070	Fischione Instruments		For plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software	Malvern Panalytical	NS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm	BioRad	1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels	ThermoFisher Scientific	NP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
qEV Original 35 nm 5/pk	IZON Science	SP5-USD	SEC column
SDS sample buffer	Boster	AR1112	In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamber	ThermoFisher Scientific	EI0001
Sigmafast BCIP/NBT	Millipore Sigma	B5655
Silver Stain Plus Kit	BioRad	1610449	In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400