JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает размерную эксклюзионную хроматографию, легкий и воспроизводимый метод обогащения внеклеточных везикул Mycobacterium tuberculosis из супернатантов культуры.

Аннотация

Роль внеклеточных везикул (EV) в контексте бактериальной инфекции стала новым способом понимания микробной физиологии. В частности, mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV играют роль во взаимодействии хозяина и патогена и реакции на стресс окружающей среды. Mtb EV также очень антигенны и демонстрируют потенциал в качестве компонентов вакцины. Наиболее распространенным методом очистки Mtb EV является ультрацентрифугирование с градиентом плотности. Этот процесс имеет несколько ограничений, включая низкую пропускную способность, низкую производительность, зависимость от дорогостоящего оборудования, технические проблемы, и это может негативно повлиять на полученную подготовку. Хроматография с исключением размеров (SEC) является более мягким альтернативным методом, который борется со многими ограничениями ультрацентрифугирования. Этот протокол демонстрирует, что SEC эффективен для обогащения Mtb EV и производит высококачественные препараты Mtb EV повышенной производительности быстрым и масштабируемым способом. Кроме того, сравнение с ультрацентрифугированием градиента плотности с помощью количественных и квалификационных процедур демонстрирует преимущества SEC. В то время как оценка количества EV (анализ отслеживания наночастиц), фенотипа (просвечивающая электронная микроскопия) и содержания (вестерн-блоттинг) адаптирована к Mtb EV, предоставленный рабочий процесс может быть применен к другим микобактериям.

Введение

Высвобождение внеклеточных везикул (EV) патогенами может быть ключом к раскрытию новых технологий для борьбы с инфекционными заболеваниями1. Микобактерии туберкулеза (Mtb) являются возбудителем с высокими последствиями, заражая примерно одну треть населения мира и ежегодно унося жизни миллионов людей2. Производство EV Mtb хорошо документировано, но неуловимо в биогенезе и различных ролях (т.е. иммуностимулирующих, иммуносупрессивных, железо и питательных веществ) этих EV в контексте инфекции 3,4,5. Попытки понять состав Mtb EV выявили 50-150 нм липидных мембранно-замкнутых сфер, полученных из плазматической мембраны, содержащей липиды и белки иммунологического значения 3,6. Исследование роли Mtb EV в бактериальной физиологии выявило важность бактериальной модуляции EV в ответ на стресс окружающей среды для выживания5. Исследования взаимодействия хозяина и патогена были более сложными для интерпретации, но данные указывают на то, что Mtb EV могут влиять на иммунный ответ хозяина и потенциально могут служить эффективным компонентом вакцинации 3,4,7.

Большинство исследований Mtb EV до сих пор основывались на ультрацентрифугировании градиента плотности для обогащенияпузырьков 8. Это было эффективно для мелкомасштабных исследований; однако этот метод сопряжен с рядом технических и логистических проблем. Альтернативные рабочие процессы сочетают многоступенчатое центрифугирование для удаления целых клеток и крупного мусора с заключительным этапом ультрацентрифугирования для пеллетных электромобилей. Эта методология может варьироваться по эффективности и часто приводит к низкому выходу и совместной очистке растворимых биомолекул, не связанных с везикулами, а также влияет на целостностьпузырьков 9. Кроме того, этот процесс занимает много времени, интенсивно используется вручную и очень ограничен по пропускной способности из-за ограничений оборудования.

Настоящий протокол описывает альтернативный метод ультрацентрифугирования градиента плотности: хроматография с исключением размеров (SEC). Этот метод был продемонстрирован для экологических микобактерий, и в текущей работе он был экстраполирован на Mtb10. Коммерчески доступная колонна и автоматический коллектор фракций могут улучшить консистенцию в пузырной подготовке и уменьшить потребность в специальном, дорогостоящем оборудовании. Также можно завершить этот протокол за долю времени по сравнению с ультрацентрифугированием градиента плотности, увеличивая пропускную способность. Этот метод является менее технически сложным, что облегчает его освоение и может повысить межлабораторную воспроизводимость. Наконец, SEC обладает высокой эффективностью разделения и является щадящим, сохраняя целостность везикул.

протокол

Институциональный комитет по биобезопасности Университета штата Колорадо одобрил настоящее исследование (19-046B). Культивирование микобактерий туберкулеза и сбор богатых EV супернатантов культуры выполнялись обученным персоналом в лаборатории с высокой степенью локализации. Материалы были вывезены из зоны с высоким уровнем локализации после того, как был выполнен, подтвержден и одобрен институциональной политикой в области биобезопасности действительный метод инактивации. При воспроизведении протокола, если валидированный метод инактивации или стерильной фильтрации невозможен, в лаборатории с высокой степенью локализации необходимо выполнить следующие процедуры.

1. Приготовление сырого концентрата Mtb EV

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры по выращиванию Mtb и получению культурального фильтратного белка (CFP) см. в ссылках11,12. Рекомендуется, чтобы бактериальные питательные среды не содержали добавок для роста с EV-содержащими или белковыми компонентами, такими как каталаза олеинового альбумина декстрозы (OADC), и моющих средств, таких как Tween. Также рекомендуется, чтобы качество бактериальной культуры и собранный CFP были проверены, чтобы обеспечить ограниченную гибель клеток и лизис13,14.

  1. Подготовьте центробежный фильтр с молекулярной массой 100 кДа (MWCO) (см. Таблицу материалов), добавив полную объемную емкость фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS). Центрифуга в течение 5 мин при 2,800 х г при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании фильтра без мертвого уровня необходимо позаботиться о том, чтобы объем образца не уменьшался ниже уровня фильтра, что приводит к полной высыханию фильтра во время центрифугирования.
  2. Отбросьте проточную и любую оставшуюся PBS перед заполнением пробной камеры Mtb CFP до максимальной емкости. Центрифуга при 2 800 х г при 4 °C до тех пор, пока объем не уменьшится до минимального объема ультрафильтрационного устройства. Повторяйте по мере необходимости, добавляя больше CFP в устройство до тех пор, пока весь образец не будет достаточно уменьшен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании сохранить часть проточного материала мощностью 100 кДа (100F) для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Добавьте 1x PBS к фильтрующему блоку, содержащему концентрат, до общей емкости устройства. Уменьшите громкость, как описано в 1.2. Повторите этот шаг пять раз, чтобы обеспечить полную промывку и буферную замену.
  4. Восстановите концентрированный ретентат CFP (100R) емкостью 100 кДа в соответствии со спецификациями ультрафильтрационного устройства (см. Таблицу материалов). После восстановления 100R промывайте фильтр с минимальным объемом 1x PBS не менее трех раз и объединяйте промывку с 100R, чтобы максимизировать восстановление.
  5. Количественно оцените материал 100R с помощью бицинхонинового анализа (BCA) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Для выполнения анализа используйте несколько разведений образцов 1:2, 1:5 и 1:10 в PBS. Протестируйте образец в трех экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании сохранить часть материала 100R для последующей квалификации. Хранить при температуре 4 °C.

2. Хроматография исключения размеров для обогащения Mtb EV из CFP

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура специфична для использования 3 мг 100R Mtb CFP с колонкой SEC и автоматическим сборщиком фракций (AFC, см. Таблицу материалов). Он может быть адаптирован для других начальных концентраций и типов колонок, следуя спецификациям производителя. Кроме того, пользователям рекомендуется прочитать и понять руководство пользователя автоматического сборщика дробей.

  1. Позвольте столбцу SEC уравновеситься до комнатной температуры.
  2. Включите AFC с помощью выключателя питания на задней панели башенного блока и при необходимости отрегулируйте настройки тензодатчика, нажав SETUP на сенсорном экране главного меню. Тензодатчик должен быть откалиброван только при первом использовании, после каждого обновления программного обеспечения и при обнаружении несоответствия в объемах сбора фракций.
  3. На экране SETUP выровняйте карусель, выбрав CAROUSEL > CALIBRATE. Вставьте карусель с 13 небольшими отверстиями, обращенными вверх, в башню AFC и отрегулируйте карусель так, чтобы сопло жидкости находилось непосредственно над заподлицо, нажав кнопки - и/или + .
  4. Снимите колпачки из уравновешенного столбца SEC. Сдвиньте колонну SEC в соответствующее крепление колонны и аккуратно установите ее на башню AFC. Убедитесь, что метка радиочастотной идентификации (RFID) на колонне обращена к AFC и убедитесь, что соединение между колонной и клапаном надежно. Поместите выпускную трубку для отходов в контейнер для сбора.
  5. На экране SETUP выберите Расписание сбора и установите значение 13, а размер — 0,5 мл, нажав кнопки - и/или + . Оставьте значение "Объем буфера" по умолчанию равным 2,7 мл, а затем закройте окно "Расписание сбора", нажав клавишу X.
  6. Выберите НАЧАТЬ КОЛЛЕКЦИЮ на начальном экране и подтвердите параметры коллекции, выбрав ДА. Нагрузка 13 маркированных микроцентрифужных трубок объемом 1,7 мл с открытыми крышками, направленными в сторону центра карусели.
  7. Переместите AFC, выбрав OK, затем смонтируйте резервуар колонны и снова нажмите OK. Выберите параметр для очистки столбца, нажав клавишу ДА, и добавьте один том столбца PBS с фильтрацией 0,2 мкм, чтобы удалить любой буфер хранения. Как только промывка будет завершена, переместите AFC, нажав OK.
  8. Поместите крышку карусели на AFC и нажмите OK. Подготовьте один столбец объемом 0,2 мкм с фильтрованной PBS. Используйте пипетку, чтобы удалить лишний буфер из столбца.
  9. Принесите 3 мг образца 100R, как количественно определено на этапе от 1,5 до 500 мкл с 1x PBS. Добавьте образец 3 мг в верхнюю часть колонки. Переместите AFC и позвольте образцу столкнуться с фритом. После того как образец полностью войдет в столбец, добавьте pBS, подготовленный на этапе 2.6, в резервуар.
  10. Следите за выполнением AFC, пока он собирает сначала объем пустоты, а затем указанные фракции. После того, как пробег завершится и карусель вернется в исходное положение, снимите крышку и снимите трубки фракции с карусели. Храните фракции при температуре 4 °C до количественной оценки (этап 3) и квалификации (этап 4).
  11. Если столбец необходимо использовать повторно, выберите параметр очистки столбца, нажав клавишу ДА; в противном случае нажмите клавишу NO. Следуйте инструкциям на AFC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как колонна вымыта и буфер хранения пропущен, его можно снять, закрыть и сохранить при 4 °C.

3. Количественная оценка электромобилей Mtb

  1. Измерьте концентрацию белка для каждой фракции, используя BCA и micro BCA12.
    1. Для фракций 0,5 мл, собранных из 3 мг 100R Mtb CFP, используйте микро BCA с разбавлением 1:3 для фракций, пронумерованных 1-7 каждого образца в трех экземплярах.
    2. Для фракций 0,5 мл, пронумерованных 5-13, используйте БЦА без разбавления для каждого образца в трех экземплярах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрытие анализов для фракций 5-7 поможет обеспечить, чтобы все фракции имели читаемый выход.
  2. Количественно оцените концентрацию частиц для каждой фракции с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA).
    1. Разбавить образцы в 1 мл 1x PBS, используя следующие рекомендуемые начальные соотношения; для фракций 1-3 используйте 1:100, а затем для остальных фракций используйте разведение 1:10.
    2. Вращайте разбавленные растворы, а затем втягивайте образец в одноразовый шприц объемом 1 мл. Установите шприц в автоматический шприцевой насос, если таковой имеется.
    3. Установите шприцевую накачку на 30 мкл/мин и используйте настройки видеозахвата с коэффициентом усиления экрана 10-12 и уровнем камеры 10-12. Настройте фокус для каждого образца.
    4. Соберите не менее трех видео по 30 с каждое, используя постоянный поток.
    5. Выполните анализ с пороговым значением обнаружения программного обеспечения, равным пяти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, не удастся получить данные NTA для последних фракций (>7) без ущерба для значительного объема выборки.

4. Квалификация электромобилей Mtb

  1. Визуализируйте общий профиль белка каждой фракции с помощью окрашенного серебром белкового геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры для SDS-PAGE и серебряного окрашивания можно найти в Ссылке15.
    1. Добавьте буфер образцов SDS к 10 мкл каждой фракции и 5 мкг CFP, 100R и 100F. Кипятить в течение 5 мин при 100 °C, затем нагружать 4%-12% гелем Bis-Tris с лестницей молекулярной массы для электрофореза полиакриламидного геля (PAGE) (см. Таблицу материалов).
    2. Запустите гель, используя 1x 2-[N-морфолино]этанесульфоновую кислоту (MES) рабочий буфер (см. Таблицу материалов) и ток 200 В в течение 35 минут.
    3. Извлеките гель из кассеты и приступайте к окрашиванию серебром15.
  2. Оцените наличие или отсутствие маркеров EV в каждой фракции с помощью вестерн-блоттинга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные процедуры для вестерн-блоттинга можно найти в Ссылке15.
    1. Запустите гель SDS-PAGE, как описано в шагах 4.1.1-4.1.2.
    2. Извлеките гель из кассеты и перенесите разрешенные белки на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм (см. Таблицу материалов), применяя ток 50 В в течение как минимум 1 ч.
    3. Выполните анализ вестерн-блоттинга для оценки интересующих белков. Рекомендуются первичные антитела против LpqH, липоарабиноманнана (LAM) и GroES (см. Таблицу материалов).
    4. Фракции пула основаны на наличии или отсутствии маркеров, применимых к нижестоящему приложению.
  3. Подтвердить наличие интактных везикул можно с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ).
    1. Зафиксируйте 15 мкл образца везикулы, добавив 15 мкл 4% параформальдегида ЭМ-класса, и храните при 4 °C в течение ночи.
    2. Подготовьте медную сетку с 200-сетчатым формвар-углеродным покрытием, очистив поверхность и сделав гидрофильную подложку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется плазменная очистка 95% аргона, 5% кислорода и 30% плазменной энергии в течение 1 мин.
    3. Опустите 10 мкл неподвижного образца на сетку и дайте образцу прилипнуть в течение 10 минут, затем смойте лишнюю жидкость фильтровальной бумагой.
    4. Сплавьте сетку на капле сверхчистой воды в течение 30 с, затем смойте лишнюю жидкость.
    5. Поместите сетку на каплю уранилацетата d% ЭМ в течение 2 мин, затем смойте лишнюю жидкость.
    6. Дайте сетке полностью высохнуть на воздухе.
    7. Изображение с использованием ТЭМ (см. Таблицу материалов) при 100 кВ или аналогичном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы количественного определения и определения характеристик ЭЛЕКТРОМОБИЛей должны использоваться на основе последующих приложений. Минимальная информация для исследований внеклеточных везикул18 должна быть рассмотрена для получения руководящих принципов для обеспечения строгости и воспроизводимости всех исследований EV.

Результаты

Культуральный фильтрат белка (CFP) из Mycobacterium tuberculosis (Mtb) концентрировали, количественно оценивали, а затем 3 мг материала наносили на колонку эксклюзионной хроматографии (SEC). Концентрации белка и частиц были перечислены BCA и NTA соответственно. Ожидаемые диапазоны восстановления белк?...

Обсуждение

Внеклеточные везикулы Микобактерии туберкулеза являются высокоантигенными резервуарами, что представляет их в качестве привлекательного направления для разработки диагностических инструментов и будущих вакцин 4,19,20. Историчес...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность NKG за поддержку со стороны Колледжа ветеринарной медицины и биомедицинских наук и Совместной исследовательской программы Исследовательского совета колледжа для NKG и финансирование ATCC (награда No 2016-0550-0002) KMD. Мы также хотели бы поблагодарить Энн Симпсон за техническую поддержку и BEI Resources, NIAID, NIH за следующие реагенты: Моноклональные антимикобактерии туберкулеза LpqH (ген Rv3763), IT-54 (производится in vitro), NR-13792, моноклональные антимикобактерии туберкулеза GroES (ген Rv3418c), клон IT-3 (SA-12) (производится in vitro), NR-49223 и моноклональные антимикобактерии туберкулеза LAM, клон CS-35 (производится в пробирке), NR-13811.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
20x MES SDS Running BufferThermoFisher ScientificNP0002
96 well plateCorning15705-066
Automatic Fraction CollectorIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark Pre-stained Protein LadderInvitrogen10748010
Benchtop centrifugeBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoffMillipore SigmaUFC710008Ultrafiltration device used in step 1.1
Electroblotting SystemThermoFisher Scientific09-528-135
EM Grade ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu GridsElectron Microscopy SciencesFCF200H-Cu-TA
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mLAbCamab6790Secondary antibody
JEM-1400 Transmission Electron MicroscopeJOEL
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
Microplate readerBIOTEKEpoch
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223Primary antibody
Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)BEI ResourcesNR-13792Primary antibody
Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35BEI ResourcesNR-13811Primary antibody
NanoClean 1070Fischione InstrumentsFor plasma cleaning of the TEM grid
Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA softwareMalvern PanalyticalNS300
Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μmBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GelsThermoFisher ScientificNP0323BOX
Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesiumCorning21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
qEV Original 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDSEC column
SDS sample bufferBosterAR1112In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent
SDS-PAGE gel chamberThermoFisher ScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silver Stain Plus KitBioRad1610449In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400

Ссылки

  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
  2. World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
  3. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).
  4. Prados-Rosales, R., et al. Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis. mBio. 5 (5), 01921 (2014).
  5. Prados-Rosales, R., et al. Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition. Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).
  6. Lee, J., et al. Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).
  7. Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).
  8. Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
  9. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111 (2014).
  10. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
  11. Wallace, E., et al. Culturing mycobacteria. Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).
  12. Lucas, M., et al. Extraction and separation of mycobacterial proteins. Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).
  13. Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly. Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).
  14. Edwards, D. A., et al. Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes. Biophysical Journal. 71 (3), 1208 (1996).
  15. . Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols Available from: https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/ (2022)
  16. Engers, H. D., et al. Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies. Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).
  17. Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains. Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Palacios, A., et al. Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection. BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).
  20. Ziegenbalg, A., et al. Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker. Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).
  21. Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome. Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены