使用基质辅助激光解吸/电离质谱成像在 果蝇 脑中快速脂质分析的样品制备

摘要

该协议的目的是使用基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像，为小组织（如 果蝇 脑）中的脂质和代谢物分析提供适当的样品制备的详细指导。

摘要

脂质分析或脂质组学是一种成熟的技术，用于研究细胞或组织的整个脂质含量。从脂质组学获得的信息对于研究参与发育，疾病和细胞代谢的途径很有价值。许多工具和仪器都有助于脂质组学项目，最值得注意的是质谱和液相色谱技术的各种组合。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）最近已成为一种强大的成像技术，可以补充传统方法。这种新技术提供了关于组织区室内脂质空间分布的独特信息，这在以前是没有使用过度修饰的情况下无法实现的。MALDI MSI方法的样品制备至关重要，因此是本文的重点。本文对嵌入在最佳切割温度化合物（OCT）中的大量 果蝇 脑进行快速脂质分析，为通过MALDI MSI制备脂质分析或代谢物和小分子分析的小组织提供了详细的方案。

引言

脂质参与广泛的生物过程，根据其结构多样性可大致分为五类:脂肪酸，三酰基甘油（TAGs），磷脂，甾醇脂质和鞘脂¹。脂质的基本功能是为生物过程（即TAG）提供能量来源并形成细胞膜（即磷脂和胆固醇）。然而，脂质在发育和疾病中的其他作用已被注意到，并且在生物医学领域已被广泛研究。例如，报告显示，不同长度的脂肪酸可能具有独特的治疗作用。短脂肪酸链可以参与针对自身免疫性疾病的防御机制，中等长度的脂肪酸链产生可以减轻癫痫发作的代谢物，长脂肪酸链产生可用于治疗代谢紊乱的代谢物²。在神经系统中，神经胶质细胞衍生的胆固醇和磷脂已被证明对突触发生至关重要^3，4。其他类型的脂质在医疗应用中显示出前景，包括用于药物输送系统的鞘脂和用于支持免疫系统的糖脂^5，6。脂质在生物医学领域的众多作用和潜在的治疗应用使得脂质组学-细胞脂质的通路和相互作用的研究-成为一个关键且日益重要的领域。

脂质组学利用分析化学来大规模研究脂质组。脂质组学中使用的主要实验方法基于质谱（MS）结合各种色谱和离子淌度技术^7，8。MS在该领域的使用是有利的，因为它具有高特异性和敏感性，获取速度以及（1）检测即使在低水平和瞬时水平下也发生的脂质和脂质代谢物的独特能力，（2）在单个实验中检测数百种不同的脂质化合物，（3）识别以前未知的脂质，以及（4）区分脂质异构体。在MS的发展中，包括解吸电喷雾电离（DESI），MALDI和二次离子质谱（SIMS），MALDI MSI已成为一种强大的成像技术，通过提供有关组织隔室内脂质空间分布的独特信息来补充传统的基于MS的方法^9，10。

脂质组学的典型工作流程包括样品制备、使用质谱技术进行数据采集和数据分析¹¹.对样品中脂质和代谢物的研究导致了了解生物体代谢过程的生理和病理状况的技术的出现。虽然了解生物相互作用很重要，但脂质和代谢物的敏感性使它们难以在没有染料或其他修饰的情况下成像和鉴定。代谢物水平或分布的变化可能导致表型变化。用于代谢组学分析的一种工具是MALDI MSI，这是一种无标记 的原位 成像技术，能够同时检测数百个分子。MALDI成像允许样品中代谢物和脂质的可视化，同时保持其完整性和空间分布。以前的脂质分析技术涉及使用放射性化学物质单独绘制脂质图，而MALDI成像则放弃了这一点，并允许同时检测一系列脂质。

脂质代谢和体内平衡在细胞生理学中起着重要作用，例如神经系统的维持和发展。神经系统脂质代谢的一个重要方面是神经元和神经胶质细胞之间的脂质穿梭，其由分子载体脂蛋白介导，包括极低密度脂蛋白（VLDL），低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）¹²。脂蛋白含有载脂蛋白（Apo），如ApoB和ApoD，其功能是脂质货物的结构块和脂蛋白受体的配体。脂质的神经元 - 神经胶质细胞串扰涉及多个参与者，例如神经胶质细胞衍生的ApoD，ApoE和ApoJ，以及它们的神经元LDL受体（LDLRs）^13，14。在 果蝇中，ApoB家族的成员阿波利波弗林是主要的血红素脂质载体¹⁵。载脂蛋白具有两个密切相关的脂蛋白受体（LpR），LpR1和LpR2，它们是哺乳动物LDLR^15，16的同源物。在以前的研究中，发现星形胶质细胞分泌的脂质细胞分泌的胶质拉扎里洛（GLaz）是人ApoD的 果蝇 同源物，其神经元受体LpR1可以合作介导神经元 - 胶质细胞脂质穿梭，从而调节树突形态发生¹⁷。因此，据推测，LpR1的丢失会导致 果蝇 大脑中整体脂质含量的降低。MALDI MSI将是分析 LpR1^−/− 突变型果蝇脑和野生型 果蝇 脑小组织中脂质含量的合适工具，如本研究所示。

尽管MALDI MSI越来越受欢迎，但该仪器的高成本和实验复杂性经常阻碍其在单个实验室中的实施。因此，大多数MALDI MSI研究都是使用共享的核心设施进行的。与 MALDI MSI 的其他应用一样，仔细的脂质组学样品制备过程对于获得可靠的结果至关重要。然而，由于样品载玻片制备通常在单个研究实验室进行，因此MALDI MSI采集可能存在差异。为了解决这个问题，本文旨在为MALDI MSI测量之前的小生物样品的样品制备提供详细的方案，例如11^，17，¹⁷，使用对一大群成年果蝇脑进行脂质分析。然而，一些磷脂类和大多数小代谢物在负离子模式下通过MALDI成像被有利地检测到，这在前面¹¹中已经描述过。因此，通过这两个示例研究，我们希望提供各种组合的详细样品制备方案:独立式大组织与包埋的小组织，解冻安装与暖玻片安装，以及正离子模式与负离子模式。

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研究方案

1. 飞头嵌入

注意:整个过程大约需要45-60分钟。

1. 准备具有平坦表面的最佳切削温度化合物（OCT化合物）载物台。
   1. 将OCT加入塑料冷冻模具（15 mm x 15 mm x 5 mm）至冷冻模型深度的一半，避免形成气泡。将模具放在平坦的表面上几分钟，然后将其转移到干冰上。
   2. 将冷冻模具平放在干冰上，让OCT形成平坦均匀的表面。等到OCT在模具中完全凝固。立即使用冷冻的OCT阶段或将其储存在-80°C。
2. 使用CO 2（即CO_2垫）麻醉成虫。
   1. 准备一个包含实验室湿巾的培养皿。用水润湿部分湿巾，以减少静电。保持湿巾一半湿，一半干。
   2. 在解剖范围1下，使用镊子切割飞头。每次收集4-5个头，并将它们放在实验室擦拭的干燥区域。
      注意:收集4-5个头需要〜2分钟。
3. 将OCT阶段从干冰转移到解剖范围。
   1. 将OCT载物台从干冰移至显微镜2，立即将头部转移到OCT载物台，并快速排列，这需要约30秒才能避免OCT融化。在每个飞脑周围留出约1毫米的空白空间，以确保从OCT获得足够的支撑，并从块的边缘留出4-5毫米的空白空间，以提供足够的空间来处理该部分。如果长鼻太长，请取下尖端;如果不是太长，请保持完整。将OCT阶段放回干冰上，让它保持约3分钟，以确保OCT阶段保持冻结和坚固。
   2. 当OCT阶段回到干冰上并等待凝固时，收集另一轮头部。重复步骤1.2和1.3，将其他样品转移到载物台的剩余空间上。
      注意:通常为每个基因型准备八个头，并且在此实验室的一个OCT阶段使用四个基因型。
   3. 并排使用两台解剖显微镜，以避免改变焦点并增加在OCT载物台上转移和排列头部所需的时间，并降低OCT载物台熔化的风险。
4. 在所有飞头对齐后，让OCT舞台在干冰上再放置5-10分钟。
5. 将OCT载物台从干冰中取出，将其放在平坦的表面（工作台）上，然后快速加入大量的OCT化合物以覆盖所有样品并填充整个冷冻模具，这需要〜3秒。
6. 立即将冷冻转回干冰，并冷冻含有包埋组织的整个OCT块。让OCT舞台在干冰上再坐5-10分钟。在冷冻模型的边缘标记样品。
7. 将冷冻样品储存在−80°C，直到准备好切片。

2. 冷冻切片组织

注意:处理氧化铟锡（ITO）玻片时，请始终戴上手套以避免组织污染。还建议佩戴口罩，以避免直接在滑梯上呼吸。

1. 通过使用设置为电阻的电压表测试ITO载玻片的电导率来确认ITO涂层的一面。用电阻测量值标记一侧作为粘附组织的一侧。标记它并始终在载玻片底部设置实验室湿巾，以避免载玻片污染。
2. 让组织在低温恒温器室中平衡30-45分钟。
   1. 为避免OCT熔化，请提前将所有必要的工具（如镊子和薄头的艺术家刷）放入低温恒温器室中以进行预冷。
3. 清洁低温恒温器，优选用70%乙醇。擦拭辊板和舞台，然后取下用过的刀片。在切片开始之前，使用额外的清洁湿巾以确保乙醇已经蒸发并且所有表面都是干燥的。
4. 根据组织的类型调整低温恒温器室和标本头的温度（例如，在该协议中，肝脏为−14°C，肌肉为−20°C，皮肤为−25°C，¹⁰;-18°C为蝇头）。
5. 使用OCT将组织安装到标本架上，小心使用足够的OCT来覆盖OCT块的底部，并将块尽可能平整地安装。
6. 在舞台上放置一个干净的刀片并锁定它。根据需要将试样的头部朝向载物台，以达到所需的切割角度。
   1. 将标本块放置在所有基因型/处理组垂直于刀片的方向。
      注意:这确保了切割平面的一致性，并避免了来自不同组的交叉污染。如果切割不同的组织块，请在样品之间切换到新的刀片，以防止交叉污染。
7. 开始切割厚片（50-100μm），直到找到感兴趣的区域（例如，大脑的所需区域）。
   1. 不断用预冷的艺术家刷子刷掉多余的作品，以保持舞台清洁。
8. 一旦达到所需区域，将切片的厚度更改为10-12μm。
   1. 根据需要稍微调整腔室温度。例如，如果切片容易剥落或脱落，请设置更高的温度。
      注意:OCT块的推荐温度为−18°C。
9. 仔细收集所需的部分并将其粘附在ITO幻灯片上。在低温恒温器室中执行此操作。
   1. 取一张室温ITO载玻片并将其放在切片上，轻轻快速地接近切片，使切片粘附在载玻片上，而不会在低温恒温器载物台上留下痕迹。
      注:OCT 将熔化并附着在载玻片上。
10. 将载玻片放在机架或实验室中，在低温恒温器外的多个部分集合之间擦拭。
11. 如果需要对同一队列的不同样品进行比较，请将来自多个样品的切片放在单个载玻片上，以便同时进行分析和最小化变异。如有必要，可分开放置两张载玻片，因为 MALDI 靶架可在一次运行中容纳两张载玻片。
12. 将真空箱中的载玻片运输到以干燥剂为底层的干燥器。在真空下干燥载玻片30-60分钟。
    注意:或者，如果实验室没有配备真空干燥器，则应在整个过程中将载玻片保持在-20°C，直到在24小时内储存在-80°C或运输在干冰上以避免脂质或代谢物的恶化。
13. 继续进行基质沉积。使用甲醇/水（70/30，v / v）中的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）作为基质。
14. 如果载玻片没有立即运行，请将载玻片储存在-80°C（苍蝇脑切片长达1个月，啮齿动物脑切片长达6个月），或者立即将样品运送到具有足够干冰的MALDI核心设施。为了获得最佳的存储和运输效果，请将载玻片放入载玻片运输车中，并用蜡膜牢固地密封开口。用拉链袋密封，将其放入另一个装有干燥剂的拉链袋中，并在外部贴上标签。
    注:请参阅前面的工作，了解玻片扫描、基质沉积和MALDI成像程序¹¹的后续步骤。
15. 使用自动 HTX M5 基质喷雾器和甲醇/水 （70/30， v/v） 中 40 mg/mL DHB 溶液进行基质沉积。以 0.12 mL/min 的定制流速和 85 °C 的喷嘴温度喷洒基质 10 次。使用 10 psi 的 N₂ 气体压力。
    注意:如果喷雾器中的 N2 气体压力降低到 5 psi 以下，喷雾器中的安全机制将立即关闭加热器，以避免以 1，300 mm/min 的喷雾速度、2 mm 的轨道间距、3 L/min 的流速和 40 mm 的喷嘴高度对喷雾器造成任何损坏。
16. 在正离子模式下使用MALDI飞行时间（TOF）MS仪器（参见 材料表）获取m / z 50-1，000质量范围内的质谱。
    1. 要校准仪器，将0.5μL红磷乳液在乙腈中点到ITO载玻片上，并使用其光谱通过应用二次校准曲线在50-1，000 m / z质量范围内校准仪器²。
    2. 将激光光斑直径设置为 "中"，因为它是 40 μm 光栅宽度的调制光束轮廓，并通过以每个阵列位置 1，000 Hz 的激光重复率对 500 次射击求和来收集成像数据。
    3. 使用软件（参见 材料表）记录和处理光谱数据。使用均方根（RMS）归一化进行成像数据分析，以生成箱宽为±0.10 Da.的离子图像，使用软件对齐同一实验中OCT和脑组织的光谱，以评估OCT的重叠峰和离子抑制干扰（补充图S1）。实验结束后，通过苏木精和曙红（H&E）染色处理含有组织样品的MALDI载玻片，如前所述¹¹。

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结果

假设星形胶质细胞分泌的脂质细胞分泌的脂质体Lazarillo（GLaz）的神经元受体LpR1的丢失是人类ApoD的 果蝇 同源物，能够导致 果蝇 大脑中总脂质含量的降低。为了测试这一点，MALDI MSI用于分析 LpR1^−/− 突变型 果蝇 大脑中的脂质，这将在下面详细阐述。

实验根据 图1所示的工作流程进行。如上所述收获了成年苍蝇的大脑...

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讨论

正如对突变型和野生型果蝇大脑中脂质组成变化的研究所证明的那样，MALDI MSI可以成为一种有价值的无标记成像技术，用于原位分析小昆虫器官内的分子分布模式。事实上，由于脂质分布在果蝇头的脑组织和脂肪体中，因此当使用全头提取时，基于液相色谱和质谱（LC-MS）的传统脂质组学方法只能检测来自两个区域的组合信号。从广义上讲，对于LC-MS方法¹⁸，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)	Millipore Sigma Aldrich	85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5	Fisher Scientific	NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE	Fisher Scientific	50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system	Bruker Daltonics Inc		MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG	Fisher Scientific	NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics		AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner	Amazon	Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer	Fisher Scientific	HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter	Fisher Scientific	01-241-1
FlexImaging v3.0	Bruker Daltonics Inc		Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol	Fisher Scientific	MMX04751
HPLC Grade Water	Fisher Scientific	W5-1
HTX M5 Sprayer	HTX Technologies, LLC		Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag	Fisher Scientific	50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)	SCiLS Lab		Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat	Fisher Thermo Scientific	95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator	Fisher Scientific	08-642-7