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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’objectif de ce protocole est de fournir des conseils détaillés sur la préparation appropriée des échantillons pour l’analyse des lipides et des métabolites dans de petits tissus, tels que le cerveau de la drosophile , en utilisant l’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI).

Résumé

Le profilage lipidique, ou lipidomique, est une technique bien établie utilisée pour étudier la totalité du contenu lipidique d’une cellule ou d’un tissu. Les informations acquises à partir de la lipidomique sont précieuses pour étudier les voies impliquées dans le développement, la maladie et le métabolisme cellulaire. De nombreux outils et instruments ont contribué aux projets de lipidomique, notamment diverses combinaisons de techniques de spectrométrie de masse et de chromatographie liquide. L’imagerie par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI MSI) est récemment apparue comme une technique d’imagerie puissante qui complète les approches conventionnelles. Cette nouvelle technique fournit des informations uniques sur la distribution spatiale des lipides dans les compartiments tissulaires, ce qui était auparavant impossible sans l’utilisation de modifications excessives. La préparation de l’échantillon de l’approche MALDI MSI est essentielle et, par conséquent, est au centre de cet article. Cet article présente une analyse lipidique rapide d’un grand nombre de cerveaux de drosophiles intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OCT) afin de fournir un protocole détaillé pour la préparation de petits tissus pour l’analyse lipidique ou l’analyse de métabolites et de petites molécules via MALDI MSI.

Introduction

Les lipides sont impliqués dans un large éventail de processus biologiques et peuvent être classés en cinq catégories en fonction de leur diversité structurelle: acides gras, triacylglycérols (TAG), phospholipides, lipides stéroliques et sphingolipides1. Les fonctions fondamentales des lipides sont de fournir des sources d’énergie pour les processus biologiques (c.-à-d. TAG) et de former des membranes cellulaires (phospholipides et cholestérol). Cependant, des rôles supplémentaires des lipides ont été notés dans le développement et les maladies, et ont été largement étudiés dans le domaine biomédical. Par exemple, des rapports ont montré que les acides gras de différentes longueurs peuvent avoir des rôles thérapeutiques uniques. Les chaînes d’acides gras courtes peuvent être impliquées dans les mécanismes de défense contre les maladies auto-immunes, les chaînes d’acides gras de longueur moyenne produisent des métabolites qui peuvent atténuer les crises et les longues chaînes d’acides gras génèrent des métabolites qui peuvent être utilisés pour traiter les troubles métaboliques2. Dans le système nerveux, le cholestérol et les phospholipides dérivés de la glie se sont révélés vitaux pour la synaptogenèse 3,4. D’autres types de lipides se sont révélés prometteurs dans des applications médicales, notamment les sphingolipides utilisés dans les systèmes d’administration de médicaments et les saccharolipides utilisés pour soutenir le système immunitaire 5,6. Les nombreux rôles et applications thérapeutiques potentielles des lipides dans le domaine biomédical ont fait de la lipidomique – l’étude des voies et des interactions des lipides cellulaires – un domaine critique et de plus en plus important.

La lipidomique utilise la chimie analytique pour étudier le lipidome à grande échelle. Les principales méthodes expérimentales utilisées en lipidomique sont basées sur la spectrométrie de masse (SM) couplée à diverses techniques de chromatographie et de mobilité ionique 7,8. L’utilisation de la SEP dans la région est avantageuse en raison de sa spécificité et de sa sensibilité élevées, de sa vitesse d’acquisition et de ses capacités uniques à (1) détecter les lipides et les métabolites lipidiques se produisant même à des niveaux faibles et transitoires, (2) détecter des centaines de composés lipidiques différents dans une seule expérience, (3) identifier des lipides auparavant inconnus et (4) distinguer les isomères lipidiques. Parmi les développements de la SEP, y compris l’ionisation par électropulvérisation par désorption (DESI), MALDI et la spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS), MALDI MSI est apparue comme une technique d’imagerie puissante qui complète les approches conventionnelles basées sur la SEP en fournissant des informations uniques sur la distribution spatiale des lipides dans les compartiments tissulaires 9,10.

Le flux de travail typique de la lipidomique comprend la préparation des échantillons, l’acquisition de données à l’aide de la technologie de spectrométrie de masse et l’analyse des données11. L’étude des lipides et des métabolites dans les échantillons a conduit à l’émergence de techniques pour comprendre les conditions physiologiques et pathologiques des processus métaboliques dans les organismes. Bien qu’il soit important de comprendre les interactions biologiques, la sensibilité des lipides et des métabolites les rend difficiles à imager et à identifier sans colorants ou autres modifications. Les changements dans les niveaux ou la distribution des métabolites peuvent entraîner des changements phénotypiques. Un outil utilisé pour le profilage métabolomique est MALDI MSI, une technique d’imagerie in situ sans marquage capable de détecter des centaines de molécules simultanément. L’imagerie MALDI permet de visualiser les métabolites et les lipides dans les échantillons tout en préservant leur intégrité et leur distribution spatiale. La technologie précédente pour le profilage lipidique impliquait l’utilisation de produits chimiques radioactifs pour cartographier individuellement les lipides, tandis que l’imagerie MALDI renonce à cela et permet la détection simultanée d’une gamme de lipides.

Le métabolisme des lipides et l’homéostasie jouent des fonctions importantes dans la physiologie cellulaire, telles que le maintien et le développement du système nerveux. Un aspect essentiel du métabolisme des lipides du système nerveux est la navette lipidique entre les neurones et les cellules gliales, qui est médiée par les lipoprotéines porteuses moléculaires, y compris les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL)12. Les lipoprotéines contiennent des apolipoprotéines (Apo), telles que l’ApoB et l’ApoD, qui fonctionnent comme des blocs structurels de la cargaison lipidique et comme des ligands pour les récepteurs des lipoprotéines. La diaphonie neurone-glie des lipides implique plusieurs acteurs tels que l’ApoD, l’ApoE et l’ApoJ dérivés de la glie, et leurs récepteurs neuronaux LDL (LDLR)13,14. Chez la drosophile, l’apolipophorine, membre de la famille ApoB, est un important vecteur lipidique de l’hémolymphe15. L’apolipophorine a deux récepteurs de lipophorine étroitement liés (LpR), LpR1 et LpR2, qui sont des homologues de mammifères LDLR15,16. Dans des études antérieures, la lipocaline sécrétée par les astrocytes Glial Lazarillo (GLaz), un homologue de la drosophile de l’ApoD humain, et son récepteur neuronal LpR1 ont été découverts pour coopérer dans la navette lipidique neurone-glie, régulant ainsi la morphogenèse des dendrites17. Par conséquent, il a été spéculé que la perte de LpR1 entraînerait une diminution de la teneur globale en lipides dans le cerveau de la drosophile. MALDI MSI serait un outil approprié pour profiler les teneurs en lipides dans les petits tissus des cerveaux mutants LpR1−/− et de la drosophile de type sauvage, comme démontré dans cette étude.

Malgré la popularité croissante de MALDI MSI, le coût élevé et la complexité expérimentale de l’instrument entravent souvent sa mise en œuvre dans les laboratoires individuels. Ainsi, la plupart des études MALDI MSI sont menées à l’aide d’installations à cœur partagé. Comme pour les autres applications de MALDI MSI, un processus minutieux de préparation des échantillons pour la lipidomique est essentiel pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que la préparation des lames d’échantillon est généralement effectuée dans des laboratoires de recherche individuels, il existe une possibilité de variation dans l’acquisition de MALDI MSI. Pour lutter contre cela, cet article vise à fournir un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petits échantillons biologiques avant la mesure MALDI MSI en utilisant l’analyse lipidique d’un grand groupe de cerveaux adultes de drosophile en mode ion positif comme exemple11,17. Cependant, certaines classes de phospholipides et la majorité des petits métabolites sont favorablement détectés par imagerie MALDI en mode ion négatif, ce qui a été décrit précédemment11. Par conséquent, avec ces deux exemples d’études, nous espérons fournir des protocoles détaillés de préparation d’échantillons de diverses combinaisons: grand tissu autonome par rapport à un petit tissu intégré, montage par décongélation par rapport à un montage par glissière chaude, et mode ion positif par rapport à mode ion négatif.

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Protocole

1. Intégration de la tête de mouche

REMARQUE: L’ensemble de la procédure prend ~45-60 min.

  1. Préparez l’étape du composé à température de coupe optimale (composé OCT) avec une surface plane.
    1. Ajouter OCT dans un cryomoule en plastique (15 mm x 15 mm x 5 mm) à la moitié de la profondeur du cryomoule et éviter la formation de bulles. Laissez le moule sur une surface plane pendant plusieurs minutes, puis transférez-le sur de la glace sèche.
    2. Gardez le cryomoule à plat sur la glace sèche et laissez l’OCT former une surface plane et uniforme. Attendez que l’OCT soit complètement solidifié dans le moule. Utilisez immédiatement les étages de PTOM congelés ou conservez-les à −80 °C.
  2. Anesthésier les mouches adultes à l’aide de CO 2 (c.-à-d. une serviette de CO2).
    1. Préparez une boîte de Petri contenant un morceau de lingette de laboratoire. Utilisez de l’eau pour humidifier une partie de la lingette afin de réduire l’électricité statique. Gardez la lingette à moitié humide et à moitié sèche.
    2. Sous la lunette de dissection 1, utilisez des pinces pour couper la tête de mouche. Collectez 4-5 têtes à chaque fois et placez-les sur la zone sèche de la lingette de laboratoire.
      REMARQUE: La collecte de 4-5 têtes prend ~ 2 minutes.
  3. Transférer l’étage OCT de la glace sèche à la lunette de dissection.
    1. Prenez l’étage OCT de la glace sèche au microscope 2, transférez immédiatement les têtes au stade OCT et arrangez-les rapidement, ce qui prend ~30 s pour éviter la fonte OCT. Laissez ~1 mm d’espace vide autour de chaque cerveau de mouche pour assurer un soutien adéquat de l’OCT et 4-5 mm d’espace vide du bord du bloc pour fournir suffisamment d’espace pour manipuler la section. Si la trompe est trop longue, retirez la pointe; S’il n’est pas trop long, gardez-le intact. Remettez la scène OCT sur la glace sèche et laissez-la reposer pendant ~3 minutes pour vous assurer que la scène OCT reste gelée et solide.
    2. Lorsque l’étape OCT est de retour sur la glace sèche et attend la solidification, ramassez une autre série de têtes. Répétez les étapes 1.2 et 1.3 pour transférer des échantillons supplémentaires sur l’espace restant sur la scène.
      REMARQUE : Huit têtes sont habituellement préparées pour chaque génotype, et quatre génotypes sont utilisés à un stade de TCO dans ce laboratoire.
    3. Utiliser deux microscopes à dissection, côte à côte, pour éviter de changer de foyer et d’augmenter le temps nécessaire au transfert et à la disposition des têtes sur l’étage OCT et réduire le risque de fusion du stade OCT.
  4. Une fois que toutes les têtes de mouche sont alignées, laissez la scène OCT reposer sur la glace sèche pendant encore 5 à 10 minutes.
  5. Éloignez l’étape OCT de la glace sèche, placez-la sur une surface plane (banc), puis, rapidement, ajoutez une grande quantité de composé OCT pour couvrir tous les échantillons et remplir l’ensemble du cryomoule, ce qui prend ~3 s.
  6. Transférez immédiatement le cryomoule dans de la glace sèche et congelez tout le bloc OCT contenant les tissus incorporés. Laissez la scène OCT reposer sur la glace sèche pendant encore 5 à 10 minutes. Étiqueter les échantillons sur la marge du cryomoule.
  7. Conserver les échantillons congelés à −80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la section.

2. Cryosectionnement du tissu

REMARQUE : Lorsque vous manipulez les lames d’oxyde d’indium-étain (ITO), portez des gants en tout temps pour éviter la contamination des tissus. Le port du masque est également recommandé pour éviter de respirer directement sur la glissière.

  1. Confirmez le côté revêtu d’ITO en testant la conductivité des lames ITO à l’aide d’un voltmètre réglé sur la résistance. Marquez le côté avec une mesure de résistance comme le côté auquel adhérer le tissu. Étiquetez-le et placez toujours une lingette de laboratoire sur le bas de la lame pour éviter toute contamination par la lame.
  2. Laisser les tissus s’équilibrer dans la chambre du cryostat pendant 30 à 45 minutes.
    1. Pour éviter la fonte de l’OCT, placez à l’avance tous les outils nécessaires tels que les pinces et un pinceau d’artiste à pointe fine dans la chambre du cryostat pour les prérefroidir.
  3. Nettoyez le cryostat, de préférence avec de l’éthanol à 70%. Essuyez la plaque de rouleau et la mise en scène et retirez les lames usagées. Utilisez des lingettes propres supplémentaires pour vous assurer que l’éthanol s’est évaporé et que toutes les surfaces sont sèches avant le début de la section.
  4. Ajuster la température de la chambre du cryostat et de la tête de l’échantillon en fonction du type de tissu (p. ex., -14 °C pour le foie, −20 °C pour les muscles et −25 °C pour la peau10; −18 °C pour les têtes de mouches dans ce protocole).
  5. Montez le tissu sur le porte-échantillon à l’aide de la CTO. Veillez à utiliser suffisamment de TCO pour couvrir la base du bloc OCT et montez le bloc aussi plat que possible.
  6. Placez une lame propre dans la scène et verrouillez-la. Placez la tête de l’échantillon vers la scène au besoin pour obtenir l’angle de coupe souhaité.
    1. Placer le bloc d’échantillon dans une orientation où tous les génotypes/groupes de traitement sont positionnés verticalement par rapport à la lame.
      REMARQUE: Cela garantit un plan de coupe cohérent et évite la contamination croisée de différents groupes. Si vous coupez un bloc de tissu différent, passez à une nouvelle lame entre les échantillons pour éviter la contamination croisée.
  7. Commencez à couper en sections épaisses (50 à 100 μm) jusqu’à ce que la région d’intérêt (p. ex. la région désirée du cerveau) soit trouvée.
    1. Brossez constamment les pièces supplémentaires avec un pinceau d’artiste prérefroidi pour garder la scène propre.
  8. Changez l’épaisseur des sections à 10-12 μm une fois la région souhaitée atteinte.
    1. Ajustez légèrement la température de la chambre si nécessaire. Par exemple, réglez une température plus élevée si la section a tendance à s’écailler ou à se désagréger facilement.
      REMARQUE: La température recommandée pour les blocs OCT est de -18 ° C.
  9. Rassemblez soigneusement la section souhaitée et collez-la à la diapositive ITO. Effectuez cette opération dans la chambre cryostatique.
    1. Prenez une lame ITO à température ambiante et positionnez-la sur la section, approchez-vous de la section doucement et rapidement pour que la section adhère à la lame sans laisser de traces sur l’étage du cryostat.
      REMARQUE: L’OPO fondra et s’accrochera à la glissière.
  10. Placez la lame de côté dans un rack ou une lingette de laboratoire à l’extérieur du cryostat entre les collections de plusieurs sections.
  11. Si une comparaison entre différents échantillons de la même cohorte est souhaitée, placez les sections de plusieurs échantillons sur une seule lame pour une analyse simultanée et une variation minimale. Si nécessaire, séparez-les de deux glissières, car le support de cible MALDI peut accueillir deux diapositives en une seule course.
  12. Transportez les lames dans une boîte à vide vers un dessiccateur avec dessiccateur comme couche inférieure. Sécher les lames sous vide pendant 30-60 min.
    REMARQUE : Par ailleurs, si le laboratoire n’est pas équipé d’un dessiccateur à vide, les lames doivent être conservées à -20 °C tout au long du processus jusqu’à ce qu’elles soient stockées à −80 °C dans les 24 heures ou expédiées sur de la glace sèche pour éviter la détérioration des lipides ou des métabolites.
  13. Procéder au dépôt matriciel. Utiliser l’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) dans le méthanol/eau (70/30, v/v) comme matrice.
  14. Si les lames ne sont pas exécutées immédiatement, soit stocker les lames à −80 °C (jusqu’à 1 mois pour les coupes de cerveau de mouches et 6 mois pour les sections de cerveau de rongeurs), soit expédier immédiatement l’échantillon aux installations centrales MALDI avec suffisamment de glace sèche. Pour un stockage et une expédition optimaux, placez les lames dans un transporteur de glissières et scellez solidement l’ouverture avec un film de cire. Scellez avec un sac à glissière, placez-le dans un autre sac à glissière contenant du déshydratant et étiquetez l’extérieur.
    REMARQUE : Reportez-vous aux travaux précédents pour connaître les étapes suivies de la numérisation des lames, du dépôt de matrice et des procédures d’imagerie MALDI11.
  15. Effectuer le dépôt matriciel à l’aide du pulvérisateur à matrice automatique HTX M5 et d’une solution de 40 mg/mL de DHB dans du méthanol/eau (70/30, v/v). Pulvériser la matrice à un débit personnalisé de 0,12 mL/min et à une température de buse de 85 °C pendant 10 passages. Utilisez une pression de gaz N2 de 10 psi.
    REMARQUE: Si la pression du gaz N2 dans le pulvérisateur est abaissée en dessous de 5 psi, un mécanisme de sécurité dans le pulvérisateur arrêtera immédiatement le chauffage pour éviter tout dommage au pulvérisateur avec une vitesse de pulvérisation de 1 300 mm/min, un espacement des voies de 2 mm, un débit de 3 L/min et une hauteur de buse de 40 mm.
  16. Utilisez un instrument MALDI Time of Flight (TOF) MS (voir le tableau des matériaux) en mode ion positif pour acquérir un spectre de masse dans les plages de masse de m/z 50-1 000.
    1. Pour calibrer l’instrument, repérer 0,5 μL d’émulsion de phosphore rouge dans l’acétonitrile sur les lames ITO et utiliser ses spectres pour étalonner l’instrument dans la plage de masse 50-1 000 m/z en appliquant une courbe d’étalonnage quadratique2.
    2. Réglez les diamètres des points laser sur Moyen, car il s’agit du profil de faisceau modulé pour une largeur raster de 40 μm, et collectez des données d’imagerie en additionnant 500 tirs à un taux de répétition laser de 1 000 Hz par position de réseau.
    3. Utiliser un logiciel (voir le tableau des matériaux) pour enregistrer et traiter les données spectrales. Effectuer une analyse des données d’imagerie à l’aide de la normalisation du carré moyen (RMS) pour générer des images ioniques à une largeur de bac de ±0,10 Da. Aligner les spectres de l’OCT et du tissu cérébral de la même expérience à l’aide du logiciel pour évaluer les pics qui se chevauchent et l’interférence de suppression ionique de l’OCT (figure supplémentaire S1). Après l’expérience, traiter les lames MALDI contenant les échantillons de tissus par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E), comme décrit précédemment11.

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Résultats

La perte du récepteur neuronal LpR1 de la lipocaline gliale sécrétée par les astrocytes (GLaz), un homologue de la drosophile de l’ApoD humain, a été supposée pouvoir provoquer une diminution de la teneur globale en lipides dans le cerveau de la drosophile. Pour tester cela, MALDI MSI a été utilisé pour profiler les lipides dans les cerveaux mutants LpR1−/− et de type sauvage de la drosophile, ce qui est expliqué ci-dessous.

L’e...

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Discussion

Comme démontré dans l’étude sur les variations de la composition lipidique dans les cerveaux mutants et sauvages de drosophiles, MALDI MSI peut être une technique d’imagerie sans marquage précieuse pour l’analyse in situ des modèles de distribution moléculaire dans les organes de petits insectes. En effet, étant donné que les lipides sont distribués à la fois dans le tissu cérébral et dans les corps adipeux des têtes de drosophile, les approches lipidomiques conventionnelles...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy et Mayan Hein sont soutenues par le programme de recherche d’été CUNY de la Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin est soutenu par le programme de recherche intra-muros du projet numéro 1ZIANS003137 des National Institutes of Health. Le soutien à ce projet a été fourni par un prix PSC-CUNY à Ye He et Rinat Abzalimov, financé conjointement par le Congrès du personnel professionnel et l’Université de la ville de New York.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)Millipore Sigma Aldrich85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5Fisher ScientificNC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT CompoundFisher Scientific14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLEFisher Scientific50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS systemBruker Daltonics IncMALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok TipsFisher Scientific14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe NeedlesFisher Scientific23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNGFisher ScientificNC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS OrganicsAC219095000
Epson Perfection V600 Photo ScannerAmazonPerfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide MailerFisher ScientificHS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range MultimeterFisher Scientific01-241-1
FlexImaging v3.0Bruker Daltonics IncBruker MS imaging analysis software
HPLC Grade MethanolFisher ScientificMMX04751
HPLC Grade WaterFisher ScientificW5-1
HTX M5 SprayerHTX Technologies, LLCAutomatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipersFisher Scientific06-666A
MSC Ziploc Freezer BagFisher Scientific50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)SCiLS LabAdvanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 CryostatFisher Thermo Scientific95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design DesiccatorFisher Scientific08-642-7

Références

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