マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージングを用いた ショウジョウバエ 脳における迅速な脂質分析のためのサンプル調製

要約

このプロトコルの目的は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析イメージングを使用して、 ショウジョウバエ 脳などの小組織における脂質および代謝産物分析のための適切なサンプル調製に関する詳細なガイダンスを提供することです。

要約

脂質プロファイリング、またはリピドミクスは、細胞または組織の脂質含有量全体を研究するために用いられる十分に確立された技術である。リピドミクスから得られた情報は、発生、疾患、細胞代謝に関与する経路を研究する上で貴重である。多くのツールや機器がリピドミクスプロジェクト、特に質量分析と液体クロマトグラフィー技術のさまざまな組み合わせを支援してきました。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージング(MALDI MSI)は、従来のアプローチを補完する強力なイメージング技術として最近登場しました。この新規な技術は、以前は過度の修飾を使用せずには達成できなかった組織区画内の脂質の空間分布に関するユニークな情報を提供する。MALDI MSIアプローチのサンプル調製は極めて重要であるため、本稿の焦点です。この論文では、最適な切断温度化合物(OCT)に埋め込まれた多数の ショウジョウバエ 脳の迅速な脂質分析を提示し、脂質分析またはMALDI MSIを介した代謝産物および小分子分析のための小組織を調製するための詳細なプロトコルを提供する。

概要

脂質は、幅広い生物学的プロセスに関与しており、その構造的多様性に基づいて、脂肪酸、トリアシルグリセロール(TAG)、リン脂質、ステロール脂質、およびスフィンゴ脂質の5つのカテゴリーに大別することができます¹。脂質の基本的な機能は、生物学的プロセス(すなわち、TAG)のためのエネルギー源を提供し、細胞膜(すなわち、リン脂質およびコレステロール)を形成することである。しかし、脂質の付加的な役割は、発生および疾患において注目されており、生物医学分野で広く研究されている。例えば、異なる長さの脂肪酸がユニークな治療的役割を有する可能性があることが報告されている。短い脂肪酸鎖は自己免疫疾患に対する防御機構に関与することができ、中長脂肪酸鎖は発作を緩和することができる代謝産物を産生し、長い脂肪酸鎖は代謝障害を治療するために使用できる代謝産物を生成する²。神経系では、グリア由来のコレステロールおよびリン脂質がシナプス形成に不可欠であることが示されている^3,4。他のタイプの脂質は、薬物送達系において利用されるスフィンゴ脂質および免疫系を支持するために使用されるサッカロ脂質を含む、医療用途において有望であることが示されている^5,6。生物医学分野における脂質の多くの役割と潜在的な治療用途により、リピドミクス(細胞脂質の経路と相互作用の研究)は重要かつますます重要な分野となっています。

リピドミクスは、分析化学を利用してリピドームを大規模に研究します。リピドミクスで利用される主な実験方法は、様々なクロマトグラフィーおよびイオン移動度技術と組み合わせた質量分析(MS)に基づいている^7,8。この領域におけるMSの使用は、その高い特異性および感度、獲得の速度、および(1)低および一過性レベルでも生じる脂質および脂質代謝産物を検出する、(2)単一の実験で何百もの異なる脂質化合物を検出する、(3)これまで知られていなかった脂質を同定する、および(4)脂質異性体を区別するためのユニークな能力のために有利である。脱離エレクトロスプレーイオン化(DESI)、MALDI、および二次イオン質量分析(SIMS)を含むMSの発展の中で、MALDI MSIは、組織区画内の脂質の空間分布に関する独自の情報を提供することにより、従来のMSベースのアプローチを補完する強力なイメージング技術として浮上しています^9,10。

リピドミクスの典型的なワークフローは、サンプル調製、質量分析技術を用いたデータ収集、およびデータ分析¹¹からなる。サンプル中の脂質および代謝産物の研究は、生物における代謝プロセスの生理学的および病理学的状態を理解するための技術の出現につながった。生物学的相互作用を理解することは重要ですが、脂質および代謝産物の感受性は、色素または他の修飾なしにそれらを画像化および同定することを困難にする。代謝産物レベルまたは分布の変化は、表現型の変化をもたらし得る。メタボロミクスプロファイリングに使用されるツールの1つは、何百もの分子を同時に検出できるラベルフリーの in situ イメージング技術であるMALDI MSIです。MALDIイメージングは、サンプル中の代謝産物と脂質の完全性と空間分布を維持しながら、その可視化を可能にします。脂質プロファイリングの以前の技術では、放射性化学物質を使用して脂質を個別にマッピングしていましたが、MALDIイメージングはこれを放棄し、さまざまな脂質を同時に検出することを可能にします。

脂質代謝および恒常性は、神経系の維持および発達などの細胞生理学において重要な機能を果たしている。神経系脂質代謝の1つの重要な側面は、超低密度リポタンパク質(VLDL)、低密度リポタンパク質(LDL)、および高密度リポタンパク質(HDL)を含む分子キャリアリポタンパク質によって媒介されるニューロンとグリア細胞との間の脂質シャットリングである¹²。リポタンパク質は、脂質貨物の構造ブロックおよびリポタンパク質受容体のリガンドとして機能するApoBおよびApoDなどのアポリポタンパク質(Apo)を含む。脂質のニューロンとグリアのクロストークには、グリア由来のApoD、ApoE、ApoJなどの複数のプレーヤーと、それらのニューロンLDL受容体(LDLR)が関与します^13,14。ショウジョウバエにおいて、ApoBファミリーのメンバーであるアポリポフォリンは、主要な血リンパ脂質担体¹⁵である。アポリポホリンは、哺乳類LDLR ^15,16のホモログである2つの密接に関連したリポホリン受容体(LpRs)、^LpR1およびLpR2を有する。以前の研究では、ヒトApoDのショウジョウバエのホモログであるアストロサイト分泌リポカリングリア・ラザリロ(GLaz)とそのニューロン受容体LpR1が、ニューロン - グリア脂質シャットリングを協調的に媒介し、樹状突起形態形成を調節することが発見された¹⁷。したがって、LpR1の喪失はショウジョウバエの脳内の全体的な脂質含量の減少を引き起こすと推測された。MALDI MSIは、この研究で実証されているように、LpR1^-/-変異型および野生型ショウジョウバエ脳の小さな組織における脂質含有量をプロファイリングするための適切なツールとなる。

MALDI MSIの人気が高まっているにもかかわらず、この装置の高コストと実験の複雑さは、多くの場合、個々のラボでの実装を妨げます。したがって、ほとんどのMALDI MSI研究は、共有コア施設を使用して実施されています。MALDI MSIの他のアプリケーションと同様に、信頼性の高い結果を達成するためには、リピドミクスの慎重なサンプル調製プロセスが不可欠です。しかし、サンプルスライドの準備は通常、個々の研究所で行われるため、MALDI MSIの取得にばらつきが生じる可能性があります。これに対抗するために、この論文は、例として、正イオンモードの成体ショウジョウバエ脳の大群の脂質分析を用いたMALDI MSI測定前の小さな生物学的サンプルのサンプル調製のための詳細なプロトコルを提供することを目的としている^11,17。しかしながら、いくつかのリン脂質クラスおよび大部分の小さな代謝産物は、以前に¹¹に記載された負イオンモードでのMALDIイメージングによって良好に検出される。したがって、これら2つの研究例を用いて、自立型大組織対埋め込み小組織、融解マウント対ウォームスライドマウント、および正イオンモード対マイナスイオンモードの様々な組み合わせの詳細なサンプル調製プロトコルを提供したいと考えています。

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プロトコル

1.フライヘッド埋め込み

注:全体の手順は〜45-60分かかります。

1. 表面が平坦な最適な切削温度コンパウンド(OCTコンパウンド)ステージを用意します。
   1. プラスチック製のクライオモールド(15 mm x 15 mm x 5 mm)にOCTをクライオモールドの深さの半分まで加え、気泡の形成を避けます。金型を平らな面に数分間放置してから、ドライアイス上に移します。
   2. クライオモールドをドライアイス上で平らに保ち、OCTが平坦で均一な表面を形成できるようにします。OCT が金型内で完全に固化するまで待ちます。凍結したOCTステージをすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。
2. CO2(すなわち、_{CO2パッド)}を用いて成虫のハエを麻酔する。
   1. 実験用ワイプの入ったペトリ皿を用意する。静電気を減らすために、ワイプの一部を湿らせるために水を使用してください。ワイプを半分濡らし、半分乾かしてください。
   2. 解剖スコープ1の下で、鉗子を使用してフライヘッドを切断します。毎回4〜5個の頭を集め、実験室の拭き取りの乾燥した領域に置きます。
      注:4〜5ヘッドのコレクションには〜2分かかります。
3. OCT ステージをドライアイスから解剖スコープに移します。
   1. OCT ステージをドライアイスから顕微鏡 2 に移し、すぐにヘッドを OCT ステージに移し、素早く配置します。OCT の融解を避けるために約 30 秒かかります。OCTからの適切なサポートを確保するために、各フライブレインの周りに約1mmの空白スペースを残し、ブロックの端から4〜5mmの空白スペースを確保して、セクションを処理するのに十分なスペースを提供します。胸郭が長すぎる場合は、先端を取り外します。長すぎない場合は、そのままにしておきます。OCT ステージをドライアイスの上に置き、OCT ステージが凍って固まったままであることを確認するために、約 3 分間オンにしておきます。
   2. OCT ステージがドライアイスに戻り、固化を待っていたら、別のラウンドのヘッドを集めます。手順 1.2 と 1.3 を繰り返して、ステージ上の残りのスペースに追加のサンプルを転送します。
      注:通常、遺伝子型ごとに8つのヘッドが用意されており、この研究室では1つのOCT段階で4つの遺伝子型が使用されています。
   3. 2つの解剖顕微鏡を並べて使用して、焦点を変えたり、OCTステージ上のヘッドの移動と配置にかかる時間を増やしたりしないようにし、OCTステージの溶融のリスクを下げます。
4. すべてのフライ ヘッドの位置が揃ったら、OCT ステージをドライアイスの上にさらに 5 ~ 10 分間放置します。
5. OCTステージをドライアイスから取り出し、平らな表面(ベンチ)に置き、その後、大量のOCT化合物を加えてすべてのサンプルを覆い、クライオモールド全体を充填します。
6. 直ちにクライオモールドをドライアイスに戻し、包埋組織を含むOCTブロック全体を凍結します。OCT ステージをドライアイスの上にさらに 5 ~ 10 分間放置します。クライオモールドの余白にサンプルにラベルを付けます。
7. 凍結したサンプルは、切片化の準備ができるまで-80°Cで保管します。

2. 組織を凍結切除する

メモ:酸化インジウム錫(ITO)スライドを取り扱うときは、組織の汚染を避けるために常に手袋を着用してください。スライド上で直接呼吸するのを避けるために、マスクを着用することもお勧めします。

1. 抵抗に設定された電圧計を使用してITOスライドの導電性をテストして、ITOコーティングされた側を確認します。抵抗測定で側を組織を接着する側としてマークします。ラベルを付け、スライドの汚れを避けるために、スライドの下部に必ず実験室用ワイプをセットしてください。
2. クライオスタットチャンバー内で組織を30〜45分間平衡化させます。
   1. OCTの溶融を避けるため、鉗子や先端の細いアーティストブラシなどの必要なツールをすべて事前にクライオスタットチャンバーに入れて予冷します。
3. クライオスタットを、好ましくは70%エタノールで洗浄する。ロールプレートとステージを拭き取り、使用済みのブレードを取り外します。追加のきれいなワイプを使用して、エタノールが蒸発し、切断が始まる前にすべての表面が乾燥していることを確認してください。
4. 組織の種類に応じてクライオスタットチャンバーと標本ヘッドの温度を調整します(例えば、肝臓の場合は-14 °C、筋肉の場合は-20 °C^{、皮膚の場合は}-25 °C、このプロトコルではフライヘッドの場合は-18 °C)。
5. OCT を使用して組織を標本ホルダーに取り付けます。OCT ブロックのベースを覆うのに十分な OCT を使用し、ブロックをできるだけ平らに取り付けるように注意してください。
6. 清潔なブレードをステージに置き、ロックします。必要に応じて試料のヘッドをステージに向けて配置し、所望の切断角度を達成します。
   1. すべての遺伝子型/治療群がブレードに対して垂直に配置される方向に標本ブロックを置きます。
      メモ:これにより、一貫した切断面が保証され、異なるグループからの交差汚染が回避されます。異なる組織ブロックを切断する場合は、サンプル間で新しいブレードに切り替えて、交差汚染を防止します。
7. 関心領域(例えば、脳の所望の領域)が見つかるまで、厚い切片(50〜100μm)で切断を開始する。
   1. 予冷されたアーティストブラシで余分な部分を常にブラッシングして、ステージを清潔に保ちます。
8. 所望の領域に達したら、切片の厚さを10〜12μmに変更する。
   1. 必要に応じてチャンバーの温度を少し調整します。たとえば、断面が剥がれたり、簡単に崩壊したりする傾向がある場合は、より高い温度を設定します。
      メモ: OCT ブロックの推奨温度は -18 °C です。
9. 目的のセクションを慎重に収集し、ITOスライドに貼り付けます。この操作はクライオスタットチャンバー内で行います。
   1. 室温のITOスライドを取り、セクションの上に配置して、セクションを優しく素早く近づけて、クライオスタットステージに痕跡を残さずにセクションがスライドに付着するようにします。
      注:OCTは溶けてスライドにしがみつきます。
10. スライドをラックに脇に置き、複数のセクションのコレクションの間にクライオスタットの外側にあるラボ用ワイプを置きます。
11. 同じコホートの異なるサンプル間での比較が必要な場合は、複数のサンプルの切片を1つのスライドに配置して、同時分析と変動を最小限に抑えます。必要に応じて、MALDIターゲットホルダーは1回の実行で2つのスライドを収容できるため、2つのスライドに分けます。
12. 真空ボックス内のスライドを、乾燥剤を最下層として使用したデシケータに輸送します。スライドを真空下で30〜60分間乾燥させます。
    注:または、ラボに真空デシケーターが装備されていない場合は、脂質または代謝産物の劣化を避けるために、スライドを24時間以内に-80°Cで保管するか、ドライアイスで出荷するまで、プロセス全体を通して-20°Cに保持する必要があります。
13. マトリックス堆積に進みます。マトリックスとしてメタノール/水(70/30、v / v)中の2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)を使用します。
14. スライドをすぐに実行しない場合は、スライドを-80°C(ハエ脳切片は最大1ヶ月、げっ歯類脳切片は最大6ヶ月)で保管するか、適切なドライアイスを添えて直ちにMALDIコア施設にサンプルを出荷してください。最適な保管と出荷のために、スライドをスライドトランスポーターに入れ、開口部をワックスフィルムでしっかりと密封します。ジップバッグでシールし、乾燥剤を入れた別のジップバッグに入れ、外側にラベルを付けます。
    メモ: スライドスキャン、マトリックス蒸着、および MALDI イメージング手順¹¹ の後続の手順については、前の作業を参照してください。
15. 自動HTX M5マトリックス噴霧器とメタノール/水(70/30、v/v)中のDHBの40mg/mL溶液を使用してマトリックス堆積を行います。0.12 mL/minのカスタマイズされた流量と85°Cのノズル温度でマトリックスを10パスでスプレーします。10psiの_N2 ガス圧力を使用してください。
    メモ:噴霧器のN2ガス圧力が5psi以下に低下した場合、噴霧器の安全機構は、噴霧速度1,300mm、トラック間隔2mm、流量3L/分、ノズル高さ40mmで噴霧器への損傷を避けるために、ヒーターを一度にシャットダウンします。
16. MALDI飛行時間(TOF)MS計器( 材料表を参照)を正イオンモードで使用して、m/z 50-1,000の質量範囲内の質量スペクトルを取得します。
    1. 装置を較正するには、アセトニトリル中の赤リンエマルジョン0.5μLをITOスライド上にスポットし、そのスペクトルを使用して、二次検量線²を適用して50〜1,000 m/z質量範囲で装置を較正します。
    2. レーザースポット直径を40μmラスター幅の変調ビームプロファイルとして Mediumに設定し、アレイ位置あたり1,000Hzのレーザー繰り返し速度で500ショットを合計してイメージングデータを収集します。
    3. ソフトウェア(材料表を参照)を使用して、スペクトルデータを記録および処理します。二乗平均平方根(RMS)正規化を使用してイメージングデータ解析を実行し、±0.10Daのビン幅でイオン画像を生成します。ソフトウェアを使用して、同じ実験のOCTと脳組織の両方のスペクトルを整列させ、重なり合うピークとOCTのイオン抑制干渉を評価します(補足図S1)。実験後、組織サンプルを含むMALDIスライドを、先に記載したようにヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色によって処理^する。

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結果

ヒトApoDのショウジョウバエホモログであるアストロサイト分泌リポカリングリアラザリロ(GLaz)のニューロン受容体LpR1の喪失は、ショウジョウバエ脳内の全体的な脂質含量の減少を引き起こす可能性があると仮説された。これを試験するために、MALDI MSIを使用して、LpR1^−/−変異型および野生型ショウジョウバエ脳の脂質をプロファイルした。

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ディスカッション

変異型および野生型ショウジョウバエの脳における脂質組成の変動に関する研究で実証されているように、MALDI MSIは、小型昆虫の器官内の分子分布パターンのin situ分析のための貴重なラベルフリーイメージング技術となり得る。実際、脂質はショウジョウバエの頭の脳組織と脂肪体の両方に分布しているため、液体クロマトグラフィーおよび質量分析(LC-MS)に基づく従来?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)	Millipore Sigma Aldrich	85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5	Fisher Scientific	NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE	Fisher Scientific	50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system	Bruker Daltonics Inc		MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG	Fisher Scientific	NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics		AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner	Amazon	Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer	Fisher Scientific	HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter	Fisher Scientific	01-241-1
FlexImaging v3.0	Bruker Daltonics Inc		Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol	Fisher Scientific	MMX04751
HPLC Grade Water	Fisher Scientific	W5-1
HTX M5 Sprayer	HTX Technologies, LLC		Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag	Fisher Scientific	50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)	SCiLS Lab		Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat	Fisher Thermo Scientific	95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator	Fisher Scientific	08-642-7