Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии

Резюме

Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).

Аннотация

Липидное профилирование, или липидомика, является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для изучения всего содержания липидов в клетке или ткани. Информация, полученная от липидомики, ценна при изучении путей, участвующих в развитии, болезни и клеточном метаболизме. Многие инструменты и приборы помогли проектам липидомики, в первую очередь различные комбинации методов масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрии (MALDI MSI) недавно стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы. Этот новый метод предоставляет уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах, которое ранее было недостижимо без использования чрезмерных модификаций. Выборочная подготовка подхода MALDI MSI имеет решающее значение и, следовательно, находится в центре внимания настоящего документа. В этой статье представлен быстрый липидный анализ большого количества мозгов дрозофилы , встроенных в соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы обеспечить подробный протокол подготовки мелких тканей к анализу липидов или метаболитному и мелкомолекулярному анализу с помощью MALDI MSI.

Введение

Липиды участвуют в широком спектре биологических процессов и могут быть широко классифицированы на пять категорий на основе их структурного разнообразия: жирные кислоты, триацилглицерины (TAGs), фосфолипиды, липиды стеринов и сфинголипиды¹. Фундаментальные функции липидов заключаются в обеспечении источников энергии для биологических процессов (т.е. TAGs) и образовании клеточных мембран (т.е. фосфолипидов и холестерина). Тем не менее, дополнительные роли липидов были отмечены в развитии и заболеваниях и были широко изучены в биомедицинской области. Например, отчеты показали, что жирные кислоты разной длины могут играть уникальную терапевтическую роль. Короткие цепи жирных кислот могут быть вовлечены в защитные механизмы против аутоиммунных заболеваний, цепи жирных кислот средней длины производят метаболиты, которые могут смягчать судороги, а длинные цепи жирных кислот генерируют метаболиты, которые могут быть использованы для лечения метаболических нарушений². В нервной системе было показано, что холестерин и фосфолипиды, полученные из глии, жизненно важны для синаптогенеза ^3,4. Другие типы липидов показали многообещающие результаты в медицинских применениях, включая сфинголипиды, используемые в системах доставки лекарств, и сахаролипиды, используемые для поддержки иммунной системы ^5,6. Многочисленные роли и потенциальные терапевтические применения липидов в биомедицинской области сделали липидомику — изучение путей и взаимодействий клеточных липидов — критической и все более важной областью.

Липидомика использует аналитическую химию для изучения липидома в больших масштабах. Основные экспериментальные методы, используемые в липидомике, основаны на масс-спектрометрии (МС) в сочетании с различными методами хроматографии и ионной подвижности ^7,8. Использование РС в этой области выгодно из-за его высокой специфичности и чувствительности, скорости приобретения и уникальных возможностей для (1) обнаружения липидов и липидных метаболитов, встречающихся даже на низких и переходных уровнях, (2) обнаружения сотен различных липидных соединений в одном эксперименте, (3) выявления ранее неизвестных липидов и (4) различения липидных изомеров. Среди разработок в области РС, включая десорбционную электрораспылительную ионизацию (DESI), MALDI и масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), MALDI MSI стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы на основе MS, предоставляя уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах ^9,10.

Типичный рабочий процесс липидомики состоит из пробоподготовки, сбора данных с использованием технологии масс-спектрометрии и анализа данных¹¹. Изучение липидов и метаболитов в образцах привело к появлению методик по пониманию физиологических и патологических состояний обменных процессов в организмах. Хотя понимание биологических взаимодействий важно, чувствительность липидов и метаболитов затрудняет их изображение и идентификацию без красителей или других модификаций. Изменения в уровнях или распределении метаболитов могут привести к фенотипическим изменениям. Одним из инструментов, используемых для метаболомического профилирования, является MALDI MSI, метод визуализации in situ без меток, способный обнаруживать сотни молекул одновременно. Визуализация MALDI позволяет визуализировать метаболиты и липиды в образцах, сохраняя при этом их целостность и пространственное распределение. Предыдущая технология профилирования липидов включала использование радиоактивных химических веществ для индивидуального картирования липидов, в то время как визуализация MALDI отказывается от этого и позволяет одновременно обнаруживать ряд липидов.

Липидный обмен и гомеостаз играют важную роль в физиологии клеток, таких как поддержание и развитие нервной системы. Одним из существенных аспектов липидного обмена нервной системы является перемещение липидов между нейронами и глиальными клетками, которое опосредовано молекулярными липопротеинами-носителями, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП)¹². Липопротеины содержат аполипопротеины (Апо), такие как ApoB и ApoD, которые функционируют как структурные блоки липидного груза и как лиганды для липопротеиновых рецепторов. Перекрестные помехи липидов нейрон-глия включают в себя несколько игроков, таких как ApoD, ApoE и ApoJ, полученные из глии, и их нейронные рецепторы ЛПНП (LDLRs)^13,14. У дрозофилы аполипофорин, член семейства ApoB, является основным носителем липидов гемолимфы¹⁵. Аполипофорин имеет два тесно связанных липофориновых рецептора (LpR), LpR1 и LpR2, которые являются гомологами LDLR^15,16 млекопитающих. В предыдущих исследованиях было обнаружено, что астроцитарно-секретируемый липокалин Glial Lazarillo (GLaz), гомолог дрозофилы человеческого ApoD, и его нейрональный рецептор LpR1 совместно опосредуют липидный шаттлинг нейрон-глия, тем самым регулируя морфогенез дендрита¹⁷. Поэтому было высказано предположение, что потеря LpR1 вызовет снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы. MALDI MSI будет подходящим инструментом для профилирования липидного содержимого в небольших тканях мозга дрозофилы LpR1^−/−, как показано в этом исследовании.

Несмотря на растущую популярность MALDI MSI, высокая стоимость и экспериментальная сложность прибора часто препятствуют его внедрению в отдельных лабораториях. Таким образом, большинство исследований MALDI MSI проводятся с использованием общих основных средств. Как и в случае с другими применениями MALDI MSI, тщательный процесс подготовки образцов для липидомики имеет решающее значение для достижения надежных результатов. Однако, поскольку подготовка образцовых слайдов обычно выполняется в отдельных исследовательских лабораториях, существует вероятность вариаций в приобретении MALDI MSI. Чтобы бороться с этим, эта статья направлена на предоставление подробного протокола для пробоподготовки небольших биологических образцов до измерения MALDI MSI с использованием анализа липидов большой группы взрослых мозгов дрозофилы в режиме положительных ионов в качестве примера^11,17. Однако некоторые классы фосфолипидов и большинство мелких метаболитов благоприятно обнаруживаются с помощью визуализации MALDI в режиме отрицательных ионов, который был описан ранее¹¹. Таким образом, с помощью этих двух примеров исследований мы надеемся предоставить подробные протоколы пробоподготовки различных комбинаций: отдельно стоящая большая ткань против встроенной мелкой ткани, оттаивание по сравнению с установкой с теплым скольжением и режим положительных ионов против режима отрицательных ионов.

протокол

1. Встраивание головки мухи

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура занимает ~45-60 мин.

1. Подготовьте оптимальную стадию температурного компаунда резки (OCT compound) с плоской поверхностью.
   1. Добавьте OCT в пластиковый криомольд (15 мм x 15 мм x 5 мм) на половину глубины криомольда и избегайте образования пузырьков. Оставьте плесень на ровной поверхности на несколько минут, а затем переложите ее на сухой лед.
   2. Держите криомольд плоским на сухом льду и позвольте ОКТ сформировать плоскую и ровную поверхность. Подождите, пока OCT полностью затвердеет в пресс-форме. Немедленно используйте замороженные стадии OCT или храните их при температуре −80 °C.
2. Обезболивайте взрослых мух с помощью CO₂ (т.е. подушечки CO₂ ).
   1. Приготовьте чашку Петри, содержащую кусочек лабораторной салфетки. Используйте воду для увлажнения части салфетки, чтобы уменьшить статическое электричество. Держите салфетку наполовину влажной и наполовину сухой.
   2. При рассечении прицела 1 используйте щипцы, чтобы разрезать голову мухи. Каждый раз соберите по 4-5 головок и положите их на сухую область лабораторной салфетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор из 4-5 голов занимает ~ 2 минуты.
3. Перенесите стадию OCT из сухого льда в область рассечения.
   1. Возьмите стадию OCT от сухого льда до микроскопа 2, немедленно перенесите головки на стадию OCT и быстро расположите их, что занимает ~ 30 с, чтобы избежать таяния OCT. Оставьте ~ 1 мм пустого пространства вокруг каждого мозга мухи, чтобы обеспечить адекватную поддержку от OCT и 4-5 мм пустого пространства от края блока, чтобы обеспечить достаточное пространство для обработки секции. Если хоботок слишком длинный, удалите кончик; если он не слишком длинный, сохраните его в целости и сохранности. Поместите стадию OCT обратно на сухой лед и дайте ей оставаться включенной в течение ~ 3 минут, чтобы убедиться, что стадия OCT остается замороженной и твердой.
   2. Когда стадия OCT вернется на сухой лед и будет ждать затвердевания, соберите еще один раунд головок. Повторите шаги 1.2 и 1.3, чтобы перенести дополнительные образцы в оставшееся пространство на сцене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого генотипа обычно готовят восемь головок, а четыре генотипа используются на одном этапе ОКТ в этой лаборатории.
   3. Используйте два микроскопа для рассечения, бок о бок, чтобы избежать изменения фокуса и увеличения времени, затрачиваемого на перенос и расположение головок на стадии OCT, а также снизить риск плавления стадии OCT.
4. После того, как все головки мух выровнены, дайте стадии OCT посидеть на сухом льду еще 5-10 минут.
5. Уберите стадию OCT подальше от сухого льда, положите ее на ровную поверхность (скамейку), а затем, быстро, добавьте большое количество соединения OCT, чтобы покрыть все образцы и заполнить весь криомольд, что занимает ~ 3 с.
6. Немедленно перенесите криомольд обратно на сухой лед и заморозьте весь блок OCT, содержащий внедренные ткани. Оставьте стадию OCT на сухом льду еще 5-10 минут. Пометьте образцы на полях криомольда.
7. Храните замороженные образцы при температуре −80 °C до готовности к разделению.

2. Криосечение ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с горками из оксида индия-олова (ITO) всегда надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения тканей. Также рекомендуется носить маску, чтобы избежать дыхания непосредственно на горке.

1. Подтвердите сторону с покрытием ITO, проверив проводимость слайдов ITO с помощью вольтметра, настроенного на сопротивление. Отметьте сторону с измерением сопротивления как сторону, к которой нужно прилипнуть к ткани. Нанесите метку и всегда устанавливайте лабораторную салфетку на нижнюю часть слайда, чтобы избежать загрязнения слайда.
2. Дайте тканям уравновеситься в криостатной камере в течение 30-45 мин.
   1. Чтобы избежать плавления OCT, поместите все необходимые инструменты, такие как щипцы и кисть художника с тонким наконечником, в криостатную камеру заранее, чтобы предварительно охладить их.
3. Очистите криостат, желательно с 70% этанолом. Протрите рулонную пластину и ступень и удалите использованные лезвия. Используйте дополнительные чистые салфетки, чтобы убедиться, что этанол испарился и что все поверхности высохли до начала секционирования.
4. Отрегулируйте температуру криостатной камеры и головки образца в соответствии с типом ткани (например, −14 °C для печени, −20 °C для мышц и −25 °C для кожи¹⁰; −18 °C для голов мух в этом протоколе).
5. Установите ткань на держатель образца с помощью OCT. Будьте осторожны, чтобы использовать достаточное количество OCT, чтобы покрыть основание блока OCT и установить блок как можно более плоским.
6. Поместите чистое лезвие в сцену и зафиксируйте его. Расположите головку образца по направлению к ступени по мере необходимости для достижения желаемого угла резания.
   1. Поместите блок образца в ориентацию, где все генотипы/группы обработки расположены вертикально к лезвию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает последовательную плоскость резки и позволяет избежать перекрестного загрязнения из разных групп. При разрезании другого блока ткани переключитесь на новое лезвие между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
7. Начинайте резку толстыми срезами (50-100 мкм) до тех пор, пока не будет найдена интересующая область (например, желаемая область мозга).
   1. Постоянно смахивайте лишние части предварительно охлажденной кистью художника, чтобы сохранить сцену в чистоте.
8. Измените толщину секций на 10-12 мкм, как только будет достигнута нужная область.
   1. Отрегулируйте температуру камеры немного по мере необходимости. Например, установите более высокую температуру, если секция имеет тенденцию к отслаиванию или легко развалу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая температура для блоков OCT составляет −18 °C.
9. Тщательно соберите нужный раздел и приклейте его к слайду ITO. Выполните эту операцию в криостатной камере.
   1. Возьмите слайд ITO комнатной температуры и расположите его над секцией, осторожно и быстро подойдите к секции, чтобы секция прилипла к слайду, не оставляя следов на стадии криостата.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Oct будет плавиться и цепляться за слайд.
10. Поместите слайд в сторону в стойку или лабораторную салфетку вне криостата между коллекциями нескольких секций.
11. Если требуется сравнение между различными образцами одной и той же когорты, поместите разделы из нескольких образцов на один слайд для одновременного анализа и минимальных вариаций. При необходимости раздельно два слайда, так как держатель мишени MALDI может вместить две горки за один прогон.
12. Транспортируйте слайды в вакуумной коробке в осушитель с осушителем в качестве нижнего слоя. Высушите горки под вакуумом в течение 30-60 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, если лаборатория не оборудована вакуумным осушителем, слайды следует держать при температуре −20°C на протяжении всего процесса до хранения при температуре −80°C в течение 24 ч или транспортировки на сухом льду во избежание порчи липидов или метаболитов.
13. Переходим к матричному осаждению. Используйте 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) в метаноле/воде (70/30, v/v) в качестве матрицы.
14. Если слайды не запускаются немедленно, либо храните слайды при температуре −80 ° C (до 1 месяца для секций мозга мухи и 6 месяцев для секций мозга грызунов), либо немедленно отправляйте образец в основные объекты MALDI с достаточным количеством сухого льда. Для оптимального хранения и транспортировки поместите слайды в транспортер для слайдов и надежно закройте отверстие восковой пленкой. Запечатайте пакетом-молнией, поместите его в другой пакет-молнию, содержащий влагопоглотители, и пометьте снаружи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущей работе для последующих этапов сканирования слайдов, матричного осаждения и процедур визуализации MALDI¹¹.
15. Выполнить матричное осаждение с помощью автоматического матричного опрыскивателя HTX M5 и раствора DHB 40 мг/мл в метаноле/воде (70/30, v/v). Распыляйте матрицу с заданным расходом 0,12 мл/мин и температурой сопла 85 °C в течение 10 проходов. Используйте давление газа N₂ 10 фунтов на квадратный дюйм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если давление газа N2 в опрыскивателе опущено ниже 5 фунтов на квадратный дюйм, предохранительный механизм в опрыскивателе немедленно отключит нагреватель, чтобы избежать повреждения опрыскивателя со скоростью распыления 1 300 мм / мин, расстоянием между гусеницами 2 мм, скоростью потока 3 л / мин и высотой сопла 40 мм.
16. Используйте прибор MALDI time of flight (TOF) MS (см. Таблицу материалов) в режиме положительных ионов для получения массового спектра в пределах диапазонов масс от м/з 50 до 1000.
    1. Чтобы откалибровать прибор, нанесите 0,5 мкл эмульсии красного фосфора в ацетонитриле на слайды ITO и используйте его спектры для калибровки прибора в диапазоне масс 50-1000 м/з путем применения квадратичной калибровочной кривой².
    2. Установите диаметры лазерных пятен на Средний, так как это модулированный профиль луча для ширины растра 40 мкм, и соберите данные изображения, суммируя 500 снимков с частотой повторения лазера 1000 Гц на позицию массива.
    3. Используйте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для записи и обработки спектральных данных. Выполните анализ данных визуализации с использованием нормализации среднеквадратического значения (RMS) для генерации ионных изображений при ширине бункера ±0,10 Да. Выровняйте спектры как OCT, так и мозговой ткани из одного и того же эксперимента с использованием программного обеспечения для оценки перекрывающихся пиков и интерференции подавления ионов OCT (дополнительный рисунок S1). После эксперимента обработайте слайды MALDI, содержащие образцы тканей, окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E), как описано ранее¹¹.

Результаты

Было высказано предположение, что потеря нейронального рецептора LpR1 астроцитарно-секретируемого липокалина Glial Lazarillo (GLaz), гомолога дрозофилы человеческого ApoD, способна вызвать снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы . Чтобы проверить это, MALDI MSI был использован д...

Обсуждение

Как было продемонстрировано в исследовании вариаций липидного состава в мозге дрозофилы мутантного и дикого типа, MALDI MSI может быть ценным методом визуализации без меток для анализа in situ молекулярных моделей распределения в органах мелких насекомых. Действительно, поскольку ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)	Millipore Sigma Aldrich	85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5	Fisher Scientific	NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE	Fisher Scientific	50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system	Bruker Daltonics Inc		MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips	Fisher Scientific	14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles	Fisher Scientific	23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG	Fisher Scientific	NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics		AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner	Amazon	Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer	Fisher Scientific	HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter	Fisher Scientific	01-241-1
FlexImaging v3.0	Bruker Daltonics Inc		Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol	Fisher Scientific	MMX04751
HPLC Grade Water	Fisher Scientific	W5-1
HTX M5 Sprayer	HTX Technologies, LLC		Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers	Fisher Scientific	06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag	Fisher Scientific	50-111-3769
SCiLS Lab (2015b)	SCiLS Lab		Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat	Fisher Thermo Scientific	95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator	Fisher Scientific	08-642-7