用 Carpesium abrotanoides L. 控制白纹伊蚊蚊幼虫。

摘要

使用 Carpesium abrotanoides L. 植物控制蚊子幼虫可有效减少 白纹伊蚊 种群数量，为设计植物来源杀虫剂提供基础。

摘要

作为登革热、黄热病和其他蚊媒疾病的重要媒介， 白纹伊蚊 （双翅目： Culicidae）可广泛分布于世界范围内，对公共卫生造成严重威胁。迄今为止，考虑到蚊子中迅速出现的杀虫剂耐药性，开发新的植物杀虫剂来控制和减少白 纹 Ae. albopictus 是紧迫而关键的。因此，为研究植物 C. abrotanoides L. 的煎煮对灭蚊幼虫的影响，我们检测了在一系列时间点（12 h、24 h、36 h 和 48 h）内不同浓度 （60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL） 煎煮后幼虫的死亡率。我们发现，与对照处理相比，180 mg/mL C. abrotanoides L. 煎剂治疗 24 h 杀死了 92.35% 的蚊子。同时，120 mg/mL 的 36 h 也能杀死 90% 以上的蚊子。此外， Carassius auratus 种群暴露于 120 mg/mL C. abrotanoides L. 煎剂 36 h，未死亡。死亡率评价表明，该浓度不属于生态环境污染的有害水平。本研究提供了一种可能的候选植物，可用于设计植物来源的杀虫剂。此外，这些方法可以改变并应用于其他蚊子种类。

引言

白纹伊蚊，又称“亚洲虎蚊”，可通过吸食人类和动物的血液传播多种疾病，如登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病¹。由于白 纹 Ae. albopictus 的广泛分布，近年来登革热等蚊媒疾病的流行情况日益严重，对全世界人民的生命健康构成严重威胁²。目前，对于大多数蚊媒疾病，尚无有效的疫苗或特异性治疗药物。用化学杀虫剂杀死蚊子仍然是控制蚊媒疾病的主要手段³。使用化学杀虫剂的化学防治方法可以快速有效地杀死蚊子，已成为蚊媒控制的主要手段⁴.然而，杀虫剂的长期和大规模使用导致 白纹 Ae. albopictus 对杀虫剂的敏感性和杀虫剂耐药性下降，这已成为控制蚊媒疾病的最大障碍。因此，开发高效、安全、环保的新型灭蚊剂具有重要的现实意义。

在自然界中，植物是主要生产者。昆虫和许多动物吃植物。当植物遭受各种“自然和人为灾害”时，它们会产生次生代谢物来生存。这些物质通常具有抵抗其他生物的摄食、疾病和昆虫抵抗力的能力。它们不仅对各种害虫有影响，而且环境毒性的风险也很低⁵。 Carpesium abrotanoides L. 是菊科 Carpesium abrotanoides 属的多年生草本植物，也被称为 “蟾蜍蓝”、“鹿活草”、“野生烟草”等。它广泛分布于中国和东亚。它的茎和叶可以用作这些区域的杀虫剂，以治疗擦伤和发烧⁶。它的果实在中国当地被称为“北合石”，在民间医学中用于治疗绦虫和蛔虫 ^7,8。据报道，该植物富含单萜、倍半萜、酚类和其他特征成分，并具有有效的药理作用，如抗炎、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤和抗病毒作用⁷。最近的研究发现，它对 Spodoptera exigua⁹ 有抗摄食作用，对 Sitophilus zeamais¹⁰ 有接触毒性，对 Taenia asiatica⁸ 的囊尾蚴有杀伤能力，对粘虫和 Plutella xylostella¹¹ 有抗摄食活性。在研究 C. abrotanoides L. 对某些寄生虫、农业害虫和卫生害虫的毒性作用方面已取得初步进展，可用于控制白纹伊蚊的幼虫。

本研究讨论了用 C. abrotanoides L. 控制 Ae. albopictus 幼虫的方案。在该方案中，使用C. abrotanoides L.汤剂作用于Ae. albopictus的第四龄幼虫，并在一系列时间点（12 h、24 h、36 h、 和 48 小时）。确定 C. abrotanoides L. 汤剂对 Ae. albopictus 幼虫的杀灭效果，为进一步高效、低毒和利用环保植物杀虫剂的蚊子控制提供了新思路。

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研究方案

用于喂养雌蚊的山羊血是从中国贵州都云市的当地屠宰场采集的，并按照中国贵州都云黔南州黔南州人类寄生虫病重点实验室的伦理准则和规定使用。

1. 试剂的制备

注：有关本实验步骤中使用的设备、试剂和其他消耗品的列表，请参阅 材料表 。

1. C. abrotanoides L. 的提取和鉴定。
   1. 收集 C. abrotanoides L 的整株草。本研究中的C. abrotanoides L.全草于2021年4月从贵州省三都水自治县（N： 25.95， E： 107.87）采集。
      注：根据 C. abrotanoides L. 的资源分布、药性、组织结构和理化鉴定特征，鉴定 C. abrotanoides L. 如下：全株高30-100厘米，茎直立，上部有许多分枝，茎下部互生叶，略叶柄状，椭圆形叶子，长10-15厘米，宽5-8厘米，全齿或不规则锯齿，茎上部叶近无柄，长椭圆形， 向上逐渐变小，头部腋生，近无柄，花下垂，有特殊的气体，味道清淡，有辛辣。该植物被我们附属机构专门研究中医的教师鉴定为 C. abrotanoides L. 。
2. C. abrotanoides L. 清洁、干燥和破碎
   1. 从收集的 C. abrotanoides L. 中去除枯叶和土壤等杂质并清洁。在通风条件下风干 10-15 天，或在 95 °C 的干燥箱中干燥 6 小时。
      注意：在 C. abrotanoides L. 的干燥过程中，必须将其翻转过来，使其干燥均匀。如果 C. abrotanoides L. 组织在粉碎过程中不易粉碎，可以再次干燥，然后粉碎。
3. C. abrotanoides L. 香精汤的制备
   1. 称取 360 g C. abrotanoides L. 精制粉末，加入 1000 mL 蒸馏水，用慢火（功率 800 W）煎煮 2 小时。
   2. 用普通滤纸过滤汤剂，然后在旋转蒸发器中浓缩，制成萃取物。用蒸馏水将提取物稀释至 1000 mL，并制备 C. abrotanoides L。含 360 mg/mL 原药材的精制水汤。
   3. 取 50 mL、100 mL 和 150 mL 的 C. abrotanoides L. 精制水煎剂稀释，制成含 120 mg/mL、240 mg/mL 和 360 mg/mL 的原始药材的水煎剂，各 150 mL 备用。
      注意：在煮沸过程中，应控制好热量。煮沸后减火，将液体保持在 100 °C 并微沸。

2. 蚊子样品制备

1. 蚊子的来源
   1. Ae. albopictus 幼虫的收集。本研究于 2020 年 8 月在贵州省都云市 （N： 26.25， E： 107.52） 居民区收集了白纹 Ae. albopictus 幼虫。
   2. 根据白纹 伊蚊的分布、幼虫和成虫形态特征，白纹 伊蚊 的鉴定如下： 白纹伊蚊 幼虫的 Ctenophora 基部有细纹;不完整的尾鞍;呼吸管黑色、短而粗; 白纹伊蚊 的成虫是中小型蚊子。雌性蚊子中等大小，呈黑色。胸中盾片有一条白色的纵条纹，通常在后部逐渐变细，并在小盾片的前部分叉。足关节有一个基部白色环，关节 5 的全部或大部分为白色。这些蚊子被我们附属机构的寄生虫学和蚊子专业教师鉴定为 Ae. albopictus 。
   3. 将常规进料保持在 25 ± 1 °C 的温度和 70% ± 10% 的相对湿度，并使用 80 W 荧光灯作为光源（亮：暗 = 14 h：10 h）。
   4. 用鸡肝粉喂养幼虫，用 10% 的糖水喂养成年蚊子。
2. 蚊子蛋系列
   1. 当 Ae. albopictus 的幼虫长成蛹时，用一次性塑料巴斯德吸管将蛹吸出并转移到成年蚊笼中。
   2. 成蚊出现 3-5 天后，雌性和雄性蚊子交配。此时，用血喂雌蚊 4-8 小时。
      注意：将加入抗凝剂的血液放入培养皿中，用37°C温水加热，并覆盖一层纱布供雌蚊吸血。
   3. 使用集卵杯（自制：300 mL 直边不透明塑料杯，盛入 250 mL 蒸馏水，然后将滤纸浸入杯内边缘的一半）收集白 纹伊蚊 的卵。
      注意： Ae. albopictus 的卵可以储存 3-6 个月。
3. 蚊子孵化和喂食
   1. 在实验期间， Ae. albopictus 通常提前 1 周孵化。将白 纹伊蚊 的卵放在搪瓷板上，加入 1000 mL 自来水，静置 24 小时以上。卵在 1-2 天内孵化成幼虫。
   2. 幼虫每 1-2 天蜕皮一次，即增加 1 龄。在繁殖 2-3 代后，选择第 3 龄末或第 4 龄初的 1000 只幼虫，不接触实验室中的任何化学杀虫剂进行测试。
      注意：如果幼虫的密度太高，请将它们分成板，让幼虫正常生长。

3. 浸渍法检测 C. abrotanoides L. 煎剂对白 纹 Ae. albopictus 幼虫的毒作用

1. 设置分组
   1. 设置实验组：用三种药物浓度（120 mg/mL、240 mg/mL 和 360 mg/mL）制备 C. abrotanoides L. 汤剂 （50 mL）。
   2. 空白对照组：使用与药物体积相同的脱氯水（自制：自来水静置 24 小时以上）。
   3. 阳性对照组：制备药物溴氰菊酯，一种常见的化学杀虫剂，终浓度为 0.05 mg/mL。
2. 添加药液
   1. 使用几个容量大于 200 mL 的一次性塑料杯，并在第三龄末或第四龄初将 35 只白纹 Ae. albopictus 幼虫加入 50 mL 脱氯水中。
   2. 在实验组中，加入 50 mL 每种浓度的 C. abrotanoides L. 精制水煎剂，轻轻摇晃并混合均匀，总体积为 100 mL。 C. abrotanoides L. 精制水汤的最终浓度为 60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL。
   3. 在空白对照组中，加入 50 mL 脱氯水至总体积为 100 mL，并将其标记为空白对照。
   4. 在阳性对照组中，加入 50 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的溴氰菊酯溶液，轻轻摇动并混合均匀，总体积为 100 mL，终浓度为 0.05 mg/mL，并标记为阳性对照。
3. 观察
   1. 将标记好的塑料杯轻轻转移到相同摄食环境的观察室中，分别在12 h、24 h、36 h和48 h记录各实验组和对照组 Ae. albopictus 幼虫的死亡情况。在显微镜下观察死去的个体，并将它们与正常的 Ae. albopictus 幼虫进行比较。
   2. 在上述观察时间点，如果幼虫被锋利的细针搅动，无法逃脱或没有反应，则认为它们已经死亡。重复测试三次。
      注：如果对照组幼虫死亡率超过 20%，则检测结果无效，需要重复检测。 图 2 总结了总体方法。

4. 户外模拟实验

1. 在室外条件下，将三种浓度的 C. abrotanoides L. 煎剂应用于 Ae. albopictus 幼虫，以观察幼虫死亡。比较毒性作用与实验室中的毒性作用是否有任何差异。
2. 在室外条件下，将三种浓度的 C. abrotanoides L. 精制水煎剂应用于野生鲫鱼，观察是否影响鲫鱼的生长。这是为了初步判断 C. abrotanoides L.精制水煎剂对生态环境造成破坏。
   注：浓度与步骤 3.2.2 中提到的浓度相似。使用的时间点分别为 12 h、24 h、36 h 和 48 h。通过比较实验室饲养条件和室外自然条件下 C. abrotanoides L. 煎剂处理的白纹 Ae. 白纹 Ae. 白纹 Ae. 的死亡率来判断田间模拟实验的效果。

5. 统计分析

1. 以 SD 均值表示定量数据±以百分比 （%） 表示计数数据。
   注意：此处使用的统计推断方法是 p < 0.05，差异具有统计学意义。
2. 使用适当的软件对数据和三种不同浓度的 C. abrotanoides L. 汤剂对 Ae. albopictus 幼虫的毒性进行统计分析，以初步确定哪种浓度的汤剂对 Ae. albopictus 幼虫的毒性最好。

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结果

在这里，本研究中的 C. abrotanoides L. 的全草是从野外收集的（图 1）。鉴定出 C. abrotanoides L. 后，通过煎煮法获得 C. abrotanoides L. 的汤剂 （图 2） 并制备不同浓度 （60 mg/mL、120 mg/mL 和 180 mg/mL）。它通过幼虫浸渍法应用于 Ae. albopictus 幼虫。发现 120 mg/mL C. abrotanoides L. 煎...

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讨论

目前， Ae. albopictus 已成为世界上 100 种最具入侵性的物种之一。根据世界卫生组织 （WHO） 的统计数据，到 2020 年，亚洲受 白纹 Ae. albopictus 影响最严重的地区将占全球疾病负担的约 70%¹²。作为登革热、黄热病和其他蚊媒疾病的重要媒介， 白纹 Ae. albopictus 可广泛分布在世界范围内，对公共卫生造成严重威胁。在这里，开发新的植物杀...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone (analytical purity)	Shanghai Shenbo Chemical Co., Ltd
Crucian carp	Guangzhou Yunfeng aquaculture Co., Ltd
Chicken liver powder	self made
Dechlorinated water	self made		The tap water standing for more than 24 hours
Deltamethrin technical	Nanjing Lesheng Biotechnology Co., Ltd		Purity: 94.62%
Disposable plastic cup	Guizhou Fuqiang technology Packaging Co., Ltd	220ML-A1
Egg collecting cup	self made
Electric blast drying oven	Hangzhou Aipu Instrument Equipment Co., Ltd	WGLL-230BE
Electric water distiller	Beijing Xinrun Kono Instrument Co., Ltd	TT-98-II
GraphPad Prism	GraphPad Software		Data processing and graphics software
Integrated digital microscope	Chongqing Aote Optical Instrument Co., Ltd	SMARTe-500
Mosquito feeding cage	Nanjing Lesheng Biotechnology Co., Ltd		custom made
Multifunctional induction cooker	Guangdong Midea living appliance manufacturing Co., Ltd	C21-WK2102	custom made
Qualitative filter paper	Hangzhou Fuyang Beimu pulp and Paper Co., Ltd	15cm-102
Rotary evaporator	Henan Jingbang Instrument Equipment Co., Ltd	R-1010
Small crusher	Jinhua Mofei household appliances Co., Ltd	CHY-6001
SPSS Version 25.0	IBM		statistical software
Standard sample sieve	Hebei Hengshui Anping lvruo wire mesh products Co., Ltd	100-30	custom made
Sugar water,10%	self made