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요약

모기 유충 방제를 위해 Carpesium abrotanoides L. 식물을 사용하면 Aedes albopictus 모기 개체수를 효과적으로 줄이고 식물 유래 살충제를 설계하기 위한 기초를 제공할 수 있습니다.

초록

뎅기열, 황열병 및 기타 모기 매개 질병의 중요한 매개체인 Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)는 전 세계에 널리 분포할 수 있으며 공중 보건에 심각한 위협을 일으킬 수 있습니다. 현재까지 모기에서 빠르게 출현하는 살충제 저항성을 고려할 때 Ae. albopictus 를 통제하고 줄이기 위한 새로운 식물 살충제의 개발이 시급하고 중요합니다. 따라서 모기 유충 사멸에 대한 식물 C. abrotanoides L.의 달인 효과를 조사하기 위해 일련의 시점(12시간, 24시간, 36시간 및 48시간) 내에서 다른 농도(60mg/mL, 120mg/mL 및 180mg/mL)로 달인 처리 후 유충의 폐사율을 감지했습니다. 180mg/mL C. abrotanoides L. 달인 24시간 동안 대조군 치료에 비해 모기가 92.35% 죽었다는 것을 확인했다. 한편, 120mg/mL로 36시간 동안 모기를 죽이면 모기의 90% 이상을 죽일 수 있습니다. 또한, Carassius auratus 개체군은 36시간 동안 120mg/mL C. abrotanoides L. 달임에 노출되었으며 죽지 않았습니다. 사망률 평가는 이 농도가 생태 환경 오염의 유해한 수준이 아님을 나타냈습니다. 이 연구는 식물 유래 살충제를 설계하는 데 사용할 수 있는 가능한 식물 후보를 제공합니다. 또한 이러한 방법을 변경하여 다른 모기 종에 적용할 수 있습니다.

서문

"아시아 호랑이 모기"라고도 알려진 Aedes albopictus는 인간과 동물의 피를 빨아먹음으로써 뎅기열, 치쿤구니야열, 지카 바이러스 질병과 같은 다양한 질병을 퍼뜨릴 수 있습니다1. Ae. albopictus의 광범위한 분포로 인해 최근 몇 년 동안 뎅기열과 같은 모기 매개 질병의 전염병 상황이 점점 더 심각해지고 전 세계 사람들의 생명과 건강에 심각한 위협이 되고 있습니다2. 현재 대부분의 모기 매개 질병에 대한 효과적인 백신이나 특정 치료법은 없습니다. 화학 살충제로 모기를 죽이는 것은 여전히 모기 매개 질병을 통제하는 주요 수단입니다3. 화학 살충제를 사용하는 화학적 방제 방법은 모기를 빠르고 효율적으로 죽일 수 있으며 모기 매개체 방제의 주요 수단이되었습니다4. 그러나 살충제의 장기적이고 대규모적인 사용으로 인해 살충제에 대한 Ae. albopictus의 민감성이 감소하고 살충제 내성이 감소하여 모기 매개 질병을 통제하는 데 가장 큰 장애물이되었습니다. 따라서 고효율, 안전성 및 환경 보호 기능을 갖춘 새로운 유형의 모기 살충제를 개발하는 것은 실질적으로 매우 중요합니다.

자연에서 식물은 주요 생산자입니다. 곤충과 많은 동물이 식물을 먹습니다. 식물은 다양한 "자연 재해 및 인위적 재해"로 고통받을 때 생존을 위해 2차 대사 산물을 생성합니다. 이러한 물질은 종종 다른 유기체의 먹이, 질병 및 곤충 저항력에 저항할 수 있는 능력을 가지고 있습니다. 그들은 다양한 해충에 영향을 미칠 뿐만 아니라 환경 독성의 위험이 낮습니다5. Carpesium abrotanoides L.은 "두꺼비 블루", "사슴 살아있는 풀", "야생 담배" 등으로도 알려진 Compositae의 Carpesium abrotanoides 속의 다년생 허브입니다. 중국과 동아시아에 널리 분포되어 있습니다. 줄기와 잎은 찰과상과 발열을 치료하기 위해 이 부위에 살충제로 사용할 수 있다6. 그 열매는 중국에서 "Bei-He-Shi"로 알려져 있으며 민간 요법에서 촌충 및 Ascaris lumbricoides를 치료하는 데 사용됩니다 7,8. 이 식물은 모노테르펜, 세스키테르펜, 페놀 및 기타 특징적인 성분이 풍부하며 항염증, 항진균, 항기생충, 항종양, 항바이러스 효과 등 효과적인 약리효과가 있는 것으로 보고되고 있다7. 최근 연구에 따르면 Spodoptera exigua9에 대한 항 사료 효과, Sitophilus zeamais10에 대한 접촉 독성, Taenia asiatica8의 cysticercus cellulosae에 대한 사멸 능력, 항 사료 활성, armyworm 및 Plutella xylostella11에 대한 접촉 독성이 있음이 밝혀졌습니다. Aedes albopictus의 유충을 방제하는 데 사용할 수 있는 일부 기생충, 농업 해충 및 위생 해충에 대한 C. abrotanoides L.의 독성 효과를 연구하는 데 예비 진전이 이루어졌습니다.

이 연구는 C. abrotanoides L.을 사용하여 Ae. albopictus 유충을 방제하는 프로토콜에 대해 논의합니다. 이 프로토콜에서 C. abrotanoides L. 달인은 Ae. albopictus의 네 번째 instar 유충에 작용하기 위해 사용되었으며, 일련의 시점(12시간, 24시간, 36 시간, 및 48 h). Ae. albopictus 유충에 대한 C. abrotanoides L. 달인의 사멸 효과를 결정하는 것은 고효율, 낮은 독성 및 환경 친화적 인 식물 살충제의 사용으로 추가 모기 방제에 대한 새로운 아이디어를 제공합니다.

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프로토콜

암컷 모기의 먹이로 사용되는 염소 혈액은 중국 구이저우성 두윈시 두윈시의 현지 도살장에서 채취하여 중국 구이저우성 두윈시 첸난현에 있는 인간 기생충 질병 핵심 연구소의 윤리 지침 및 규정에 따라 사용되었습니다.

1. 시약의 준비

참고: 이 프로토콜에 사용되는 장비, 시약 및 기타 소모품 목록은 재료 표를 참조하십시오.

  1. C. abrotanoides L.의 추출 및 식별.
    1. C. abrotanoides L.의 전체 풀을 수집합니다. 본 연구에서 C. abrotanoides L.의 전체 풀은 2021년 4월 구이저우성 산두수이족 자치현(N: 25.95, E: 107.87)에서 수집되었으며, 그림 1의 C. abrotanoides L. 채취 현장 사진.
      참고: C. abrotanoides L.의 자원 분포, 의약 특성, 조직 구조 및 물리적 및 화학적 식별 특성에 따라 C. abrotanoides L.의 식별.전체 식물은 높이가 30-100cm이며 줄기가 곧고 윗부분에 가지가 많고 줄기 아래쪽에 번갈아 가며 잎이 번갈아 가며 약간 잎자루가 있고 타원형 잎, 길이 10-15cm, 너비 5-8cm, 전체 또는 불규칙한 톱니, 줄기 윗부분의 잎은 거의 고착되고 긴 타원형입니다. 점차 위쪽으로 작아지고 머리는 겨드랑이이며 거의 고착되어 있으며 처진 꽃, 특별한 가스, 가벼운 맛 및 매운맛이 있습니다. 이 식물은 우리 소속에서 중국 전통 의학을 전문으로 하는 교사들에 의해 C. abrotanoides L.로 확인되었습니다.
  2. C. 아브로타노이데스 L. 청소, 건조 및 분쇄
    1. 채취한 C. abrotanoides L. 에서 죽은 잎이나 흙 등의 불순물을 제거하고 청소합니다. 통풍이 잘되는 조건에서 10-15일 동안 자연 건조하거나 95°C의 건조 오븐에서 6시간 동안 건조하십시오.
      참고: C. abrotanoides L.의 건조 과정에서 균일하게 건조될 수 있도록 뒤집어야 합니다. C. abrotanoides L. 조직이 파쇄 과정에서 쉽게 파쇄되지 않으면 다시 건조시킨 다음 파쇄할 수 있습니다.
  3. C. abrotanoides L. 에센스 달인의 준비
    1. C. abrotanoides L. 정제 분말 360g의 무게를 달고 증류수 1000mL를 넣고 2시간 동안 느린 불(전력 800W)로 달입니다.
    2. 일반 여과지로 달인을 여과한 다음 회전 증발기에 농축하여 추출물을 만듭니다. 추출물을 증류수로 1000mL로 희석하고 C. abrotanoides L을 준비합니다.원래 의약 물질 360 mg / mL를 함유 한 정제수 달인.
    3. C. abrotanoides L. 정제수 달인 50mL, 100mL, 150mL를 취하여 희석하여 원래 약용 물질 120mg/mL, 240mg/mL 및 360mg/mL(각각 150mL)를 포함하는 물 달인을 제조합니다.
      알림: 끓는 과정에서 열을 잘 조절해야 합니다. 끓인 후 열을 줄이고 액체를 100°C로 유지하고 약간 끓였습니다.

2. 모기 샘플 준비

  1. 모기의 근원
    1. Ae. albopictus 유충 수집. 본 연구에서는 2020년 8월 구이저우성 두윈시(Duyun City, N: 26.25, E: 107.52)에서 Ae. albopictus 유충을 수집하였다.
    2. Ae. albopictus의 분포, 유충 및 성체 형태 학적 특성에 따르면 Aedes albopictus의 식별은 다음과 같습니다 : Aedes albopictus 유충의 Ctenophora의 기저부는 finedraw를 가지고 있습니다. 불완전한 꼬리 안장; 호흡관은 검고 짧고 두껍습니다. Aedes albopictus의 성충은 중소형 모기입니다. 암컷 모기는 중간 크기이며 검은 색입니다. midthoracic scutelum은 흰색 세로 줄무늬를 가지고 있으며, 일반적으로 뒤쪽에서 점차적으로 가늘어지고 작은 scutelum의 앞쪽 영역에서 갈라집니다. 발 관절에는 흰색 고리가 있으며 관절 5의 전부 또는 대부분이 흰색입니다. 모기는 우리 소속의 기생충학 및 모기 전문 교사에 의해 Ae. albopictus로 확인되었습니다.
    3. 25 ± 1 °C의 온도와 70% ± 10%의 상대 습도에서 기존 사료를 유지하고 80W 형광등을 광원으로 사용합니다(조명: 어둡게 = 14시간:10시간).
    4. 유충에게는 닭 간 가루를, 성충에게는 설탕 10%를 먹이십시오.
  2. 모기 알 컬렉션
    1. Ae. albopictus의 유충이 번데기로 자랐을 때 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 번데기를 빨아서 성인 모기장으로 옮깁니다.
    2. 성충 모기가 출현한 지 3-5일이 지나면 암컷과 수컷 모기가 짝짓기를 합니다. 이때 암컷 모기에게 4-8 시간 동안 혈액을 먹이십시오.
      참고: 항응고제가 첨가된 혈액을 배양 접시에 넣고 37°C의 따뜻한 물로 가열한 다음 암컷 모기가 피를 빨 수 있도록 거즈 천으로 덮었습니다.
    3. 난자 수집 컵(수제: 250mL의 증류수가 들어 있는 300mL 직선 불투명 플라스틱 컵)을 사용하여 Aedes albopictus 의 난자를 수집합니다.
      참고: Ae. albopictus 의 난자는 3-6개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 모기 부화 및 먹이주기
    1. 실험 기간 동안 Ae. albopictus는 일반적으로 1주일 전에 부화했습니다. 에나멜 플레이트에 Aedes albopictus 의 알을 놓고 수돗물 1000mL를 넣고 24시간 이상 그대로 둡니다. 알은 1-2일 안에 유충으로 부화합니다.
    2. 유충은 1-2일에 한 번씩 털갈이를 했는데, 즉, 한 개의 instar가 증가했습니다. 테스트를 위해 실험실에서 화학 살충제와 접촉하지 않고 2-3 세대 동안 번식 한 후 세 번째 instar 끝 또는 네 번째 instar 시작 부분에 1000 마리의 유충을 선택하십시오.
      참고: 유충의 밀도가 너무 높으면 유충이 정상적으로 자랄 수 있도록 플레이트로 나눕니다.

3. 침지 방법에 의한 Ae. albopictus 유충에 대한 C. abrotanoides L. 달인의 독성 효과 검출

  1. 그룹화 설정
    1. 실험 그룹 설정: 세 가지 약물 농도(120mg/mL, 240mg/mL 및 360mg/mL)로 C. abrotanoides L. 달임(50mL)을 준비합니다.
    2. 블랭크 대조군: 약물과 동일한 부피의 탈염소수(수제: 24시간 이상 수돗물)를 사용하십시오.
    3. 양성 대조군: 일반적인 화학 살충제인 델타메트린(deltamethrin)을 최종 농도 0.05mg/mL로 준비합니다.
  2. 액상의약품 첨가
    1. 부피가 200mL 이상인 일회용 플라스틱 컵 여러 개를 사용하고 탈염소수 50mL에 세 번째 instar 끝 또는 네 번째 instar 시작 부분에 35 Ae. albopictus 유충을 추가합니다.
    2. 실험 그룹에서 각 농도의 C. abrotanoides L. 정제수 달인 50mL를 첨가하고 부드럽게 흔든 다음 골고루 섞어 총 부피 100mL를 만듭니다. C. abrotanoides L. 정제수 달인의 최종 농도는 60mg/mL, 120mg/mL 및 180mg/mL입니다.
    3. 블랭크 대조군에서 총 부피 50mL에 탈염소수 100mL를 추가하고 블랭크 대조군으로 표시합니다.
    4. 양성 대조군에서 0.1mg/mL 농도의 델타메트린 용액 50mL를 첨가하고 부드럽게 흔든 다음 총 부피 100mL를 최종 농도 0.05mg/mL까지 균일하게 혼합하고 양성 대조군으로 표시합니다.
  3. 관찰
    1. 표시된 플라스틱 컵을 동일한 섭식 환경의 관찰실로 부드럽게 옮기고 각 실험 및 대조군에서 각각 12시간, 24시간, 36시간 및 48시간에 Ae. albopictus 유충의 죽음을 기록합니다. 현미경으로 죽은 개체를 관찰하고 정상적인 Ae. albopictus 유충과 비교하십시오.
    2. 위의 관찰 시점에서 유충이 날카로운 미세한 바늘로 저어주었는데 탈출할 수 없거나 반응이 없으면 죽은 것으로 간주합니다. 테스트를 세 번 반복합니다.
      참고: 대조군의 유충 폐사율이 20%를 초과하면 검사 결과가 유효하지 않으므로 반복해야 합니다. 전반적인 접근 방식은 그림 2에 요약되어 있습니다.

4. 야외 시뮬레이션 실험

  1. C . abrotanoides L. 달인의 세 가지 농도를 실외 조건에서 Ae. albopictus 유충에 적용하여 유충의 죽음을 관찰합니다. 독성 효과와 실험실에서의 영향 사이에 차이가 있는지 비교하십시오.
  2. C . abrotanoides L. 정제수 달인의 세 가지 농도를 야외 조건에서 야생 붕어에 적용하여 붕어의 성장에 영향을 미치는지 관찰합니다. 이것은 C. abrotanoides L.정제수 달인은 생태 환경에 해를 끼칩니다.
    참고: 농도는 3.2.2단계에서 언급한 농도와 유사했습니다. 사용되는 시점은 각각 12시간, 24시간, 36시간 및 48시간입니다. 현장 시뮬레이션 실험의 효과는 실험실 사육 조건과 실외 자연 조건에서 C. abrotanoides L. 달인과 함께 처리된 Ae. albopictus의 사망률을 비교하여 판단했습니다.

5. 통계 분석

  1. 정량적 데이터는 평균 ± SD로 표현하고 개수 데이터는 백분율(%)로 표현합니다.
    참고: 여기에 사용된 통계적 추론 방법은 p < 0.05였으며 그 차이는 통계적으로 유의했습니다.
  2. 데이터의 통계 분석과 Ae. albopictus 유충에 대한 C. abrotanoides L. 달인의 독성을 세 가지 다른 농도의 독성을 위해 적절한 소프트웨어를 사용하여 Ae. albopictus 유충에 대한 달인 농도를 예비적으로 결정했습니다.

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결과

여기서, 이 연구에서 C. abrotanoides L.의 전체 풀은 야생에서 수집되었습니다(그림 1). C. abrotanoides L.의 확인 후, C. abrotanoides L.의 달인은 달인 방법(그림 2)으로 얻어지고 다른 농도(60 mg/mL, 120 mg/mL 및 180 mg/mL)로 제조되었습니다. 그것은 애벌레 담그는 방법에 의해 Ae. albopictus 유충에 적...

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토론

현재 Ae. albopictus 는 세계에서 가장 침입적인 100종 중 하나가 되었습니다. 세계보건기구(WHO)의 통계에 따르면, 2020년 아시아에서 Ae. albopictus 의 영향을 가장 많이 받는 지역은 전 세계 질병 부담의 약 70%를 차지할 것으로 예상됩니다12. 뎅기열, 황열병 및 기타 모기 매개 질병의 중요한 매개체인 Ae. albopictus 는 전 세계적으로 널리 분포할...

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공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

통찰력 있는 제안과 지도를 해주신 미네소타 대학교의 Xin-Ru Wang 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 첸난의과대학의 과학연구기금(Qnyz202112, QNYZ202205)과 구이저우성 보건위원회의 과학기술기금(qwjh [2022] No. 101, 프로젝트 gzwkj2023-251)의 지원을 받았다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone (analytical purity)Shanghai Shenbo Chemical Co., Ltd
Crucian carpGuangzhou Yunfeng aquaculture Co., Ltd
Chicken liver powderself made
Dechlorinated waterself madeThe tap water standing for more than 24 hours
Deltamethrin technicalNanjing Lesheng Biotechnology Co., LtdPurity: 94.62%
Disposable plastic cupGuizhou Fuqiang technology Packaging Co., Ltd220ML-A1
Egg collecting cupself made
Electric blast drying ovenHangzhou Aipu Instrument Equipment Co., LtdWGLL-230BE
Electric water distillerBeijing Xinrun Kono Instrument Co., LtdTT-98-II
GraphPad PrismGraphPad SoftwareData processing and graphics software
Integrated digital microscopeChongqing Aote Optical Instrument Co., LtdSMARTe-500
Mosquito feeding cageNanjing Lesheng Biotechnology Co., Ltdcustom made
Multifunctional induction cookerGuangdong Midea living appliance manufacturing Co., LtdC21-WK2102custom made
Qualitative filter paperHangzhou Fuyang Beimu pulp and Paper Co., Ltd15cm-102
Rotary evaporatorHenan Jingbang Instrument Equipment Co., LtdR-1010
Small crusherJinhua Mofei household appliances Co., LtdCHY-6001
SPSS Version 25.0IBMstatistical software
Standard sample sieveHebei Hengshui Anping lvruo wire mesh products Co., Ltd100-30custom made
Sugar water,10%self made

참고문헌

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