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Resumo

O uso da planta Carpesium abrotanoides L. para controle de larvas de mosquitos pode efetivamente reduzir a população de mosquitos Aedes albopictus e fornecer uma base para o projeto de inseticidas derivados de plantas.

Resumo

Como vetor vital da dengue, febre amarela e outras doenças transmitidas por mosquitos, o Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) pode ser amplamente distribuído em todo o mundo e causar uma grave ameaça à saúde pública. Até o momento, considerando a rápida resistência emergente a inseticidas no mosquito, o desenvolvimento de novos inseticidas botânicos para controlar e reduzir o Ae. albopictus é urgente e crucial. Portanto, para investigar o efeito da decocção da planta C. abrotanoides L. na morte de larvas de mosquitos, detectamos a mortalidade de larvas após o tratamento com diferentes concentrações (60 mg/mL, 120 mg/mL e 180 mg/mL) de decocção em uma série de pontos de tempo (12 h, 24 h, 36 h e 48 h). Verificou-se que 24 h com 180 mg/mL de C. abrotanoides L. o tratamento com decocção matou 92,35% dos mosquitos em relação ao tratamento controle. Enquanto isso, 36 h com 120 mg/mL também podem matar mais de 90% dos mosquitos. Além disso, as populações de Carassius auratus foram expostas a 120 mg/mL de decocção de C. abrotanoides L. por 36 h e não estavam mortas. A avaliação da mortalidade indicou que essa concentração não é um nível prejudicial de poluição ambiental ecológica. Este estudo fornece um possível candidato a planta que pode ser usado para projetar inseticidas derivados de plantas. Além disso, esses métodos podem ser alterados e aplicados a outras espécies de mosquitos.

Introdução

O Aedes albopictus, também conhecido como "mosquito tigre asiático", pode espalhar uma variedade de doenças, como dengue, febre chikungunya e doença do vírus Zika, sugando sangue humano e animal1. Devido à ampla distribuição de Ae. albopictus, a situação epidêmica de doenças transmitidas por mosquitos, como a dengue, tornou-se cada vez mais grave nos últimos anos, representando uma grave ameaça à vida e à saúde das pessoas em todo o mundo2. Atualmente, para a maioria das doenças transmitidas por mosquitos, não existe uma vacina eficaz ou medicamento terapêutico específico. Matar mosquitos com inseticidas químicos ainda é o principal meio de controle de doenças transmitidas por mosquitos3. O método de controle químico usando inseticidas químicos pode matar mosquitos de forma rápida e eficiente e tornou-se o principal meio de controle de mosquitos vetores4. No entanto, o uso prolongado e em larga escala de inseticidas levou a um declínio na sensibilidade de Ae. albopictus a inseticidas e resistência a inseticidas, que se tornou o maior obstáculo para o controle de doenças transmitidas por mosquitos. Portanto, é de grande importância prática desenvolver um novo tipo de inseticida para mosquitos com alta eficiência, segurança e proteção ambiental.

Na natureza, as plantas são as principais produtoras. Insetos e muitos animais comem plantas. Quando as plantas sofrem de vários "desastres naturais e causados pelo homem", elas produzem metabólitos secundários para sobreviver. Essas substâncias geralmente têm a capacidade de resistir à alimentação de outros organismos, doenças e resistência a insetos. Eles não apenas têm efeitos sobre uma variedade de pragas, mas também têm um baixo risco de toxicidade ambiental5. Carpesium abrotanoides L. é uma erva perene do gênero Carpesium abrotanoides de Compositae, também conhecida como "sapo azul", "grama viva de veado", "tabaco selvagem", etc. É amplamente distribuído na China e no Leste Asiático. Seus caules e folhas podem ser usados como inseticidas nessas áreas para tratar escoriações e febre6. Seu fruto é conhecido localmente como "Bei-He-Shi" na China e é usado para tratar tênia e Ascaris lumbricoides na medicina popular 7,8. Foi relatado que a planta é rica em monoterpenos, sesquiterpenos, fenóis e outros componentes característicos e tem efeitos farmacológicos eficazes, como efeitos anti-inflamatórios, antifúngicos, antiparasitários, antitumorais e antivirais7. Estudos recentes descobriram que ele tem um efeito antialimentar sobre Spodoptera exigua9, toxicidade de contato para Sitophilus zeamais10, capacidade de matar para cysticercus cellulosae de Taenia asiatica8, atividade antialimentar e toxicidade de contato para lagarta-do-cartucho e Plutella xylostella11. Progressos preliminares foram feitos no estudo dos efeitos tóxicos de C. abrotanoides L. em alguns parasitas, pragas agrícolas e pragas sanitárias, que podem ser usados para controlar as larvas de Aedes albopictus.

Este estudo discute o protocolo de controle de larvas de Ae. albopictus com C. abrotanoides L. Neste protocolo, a decocção de C. abrotanoides L. foi usada para atuar nas larvas de quarto ínstar de Ae. albopictus, e a morte larval foi detectada após o tratamento com a decocção de C. abrotanoides L. em diferentes concentrações (60 mg/mL, 120 mg/mL e 180 mg/mL) em uma série de pontos de tempo (12 h, 24 h, 36 h, e 48 h). Determinar o efeito de morte da decocção de C. abrotanoides L. em larvas de Ae. albopictus fornece uma nova ideia para o controle adicional de mosquitos com alta eficiência, baixa toxicidade e uso de inseticidas botânicos ecologicamente corretos.

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Protocolo

O sangue de cabra usado para alimentar mosquitos fêmeas foi coletado de um matadouro local na cidade de Duyun, Guizhou, China, e usado seguindo as diretrizes e regulamentos éticos do Laboratório Chave de Doenças Parasitárias Humanas na Prefeitura de Qiannan, Duyun, Guizhou, China.

1. Preparação de reagentes

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de equipamentos, reagentes e outros consumíveis usados neste protocolo.

  1. Extração e identificação de C. abrotanoides L.
    1. Colete toda a grama de C. abrotanoides L. A grama inteira de C. abrotanoides L. neste estudo foi coletada no Condado Autônomo de Sandu Shui, Província de Guizhou (N: 25,95, E: 107,87) em abril de 2021.As fotos do local de coleta de C. abrotanoides L. na Figura 1.
      NOTA: De acordo com a distribuição de recursos, propriedades medicinais, estrutura tecidual e características de identificação física e química de C. abrotanoides L., a identificação de C. abrotanoides L. foi o seguinte: A planta inteira tem 30-100 cm de altura, com caules eretos, muitos ramos na parte superior, folhas alternadas na parte inferior do caule, folhas ligeiramente pecioladas, ovais, 10-15 cm de comprimento e 5-8 cm de largura, cheias ou irregularmente serrilhadas, as folhas na parte superior do caule são quase sésseis, ovais longas, gradualmente menor para cima, e a cabeça é axilar, quase séssil, com flores caídas, gás especial, sabor leve e pungente. A planta foi identificada como C. abrotanoides L. por professores especializados em medicina tradicional chinesa em nossas afiliações.
  2. C. abrotanoides L. limpeza, secagem e trituração
    1. Remova as impurezas, como folhas mortas e sujeira, do C. abrotanoides L. coletado e limpe-o. Seque ao ar por 10-15 dias em condições ventiladas ou seque-o em forno seco a 95 °C por 6 h.
      NOTA: Durante o processo de secagem de C. abrotanoides L., é necessário virá-lo para que possa secar uniformemente. Se o tecido de C. abrotanoides L. não for facilmente esmagado durante o processo de trituração, ele pode ser seco novamente e depois triturado.
  3. Preparação de C. abrotanoides L. decocção de essência
    1. Pesar 360 g de pó refinado de C. abrotanoides L. , adicionar 1000 mL de água destilada e decoctar com fogo lento (potência de 800 W) por 2 h.
    2. Filtrar a decocção com papel de filtro vulgar e concentrar-se num evaporador rotativo para fazer um extracto. Diluir o extracto com água destilada até 1000 ml e preparar um C. abrotanoides L.decocção de água refinada contendo 360 mg/ml do material medicinal original.
    3. Pegue 50 mL, 100 mL e 150 mL de decocção de água refinada de C. abrotanoides L. e dilua-os para preparar decocções de água contendo 120 mg / mL, 240 mg / mL e 360 mg / mL dos materiais medicinais originais, 150 mL cada para espera.
      NOTA: Durante o processo de fervura, o calor deve ser bem controlado. Após a fervura, o fogo foi reduzido e o líquido foi mantido a 100 °C e levemente fervido.

2. Preparação da amostra do mosquito

  1. Fonte de mosquitos
    1. Coleção de larvas de Ae. albopictus . Neste estudo, as larvas de Ae. albopictus foram coletadas na área residencial da cidade de Duyun (N: 26,25, E: 107,52), província de Guizhou, em agosto de 2020.
    2. De acordo com a distribuição, características morfológicas larvais e adultas de Ae. albopictus, a identificação de Aedes albopictus foi a seguinte: A base de Ctenophora de larvas de Aedes albopictus tem um finedraw; sela de cauda incompleta; o tubo de respiração é preto, curto e grosso; os adultos de Aedes albopictus são mosquitos de pequeno a médio porte. O mosquito fêmea é de tamanho médio e preto. O escutelo torácico médio tem uma faixa longitudinal branca, geralmente afinando gradualmente na parte traseira e bifurcando-se na área anterior do pequeno escutelo. A articulação do pé tem um anel branco de base e toda ou a maior parte da articulação 5 é branca. Os mosquitos foram identificados como Ae. albopictus por professores de Parasitologia e especialidade de mosquitos em nossas afiliações.
    3. Mantenha a alimentação convencional a uma temperatura de 25 ± 1 °C e umidade relativa de 70% ± 10%, e use lâmpada fluorescente de 80 W como fonte de luz (claro: escuro = 14 h:10 h).
    4. Alimente as larvas com pó de fígado de galinha e os mosquitos adultos com 10% de água com açúcar.
  2. Coleção de ovos de mosquito
    1. Quando as larvas de Ae. albopictus se transformaram em pupas, suge as pupas usando uma pipeta de plástico descartável Pasteur e transfira-as para a gaiola do mosquito adulto.
    2. Após 3-5 dias da emergência do mosquito adulto, os mosquitos fêmea e macho acasalam. Neste momento, alimente os mosquitos fêmeas com sangue por 4-8 h.
      NOTA: O sangue adicionado com anticoagulante foi colocado em uma placa de cultura, aquecido com água morna a 37 °C e coberto com uma camada de gaze para os mosquitos fêmeas sugarem o sangue.
    3. Colete os ovos de Aedes albopictus usando um copo coletor de ovos (caseiro: copo plástico opaco de 300 mL de face reta contendo 250 mL de água destilada e, em seguida, o papel de filtro foi imerso até a metade da borda interna do copo).
      NOTA: Os ovos de Ae. albopictus podem ser armazenados por 3-6 meses.
  3. Incubação e alimentação de mosquitos
    1. Durante o experimento, Ae. albopictus geralmente eclodiu com 1 semana de antecedência. Coloque os ovos de Aedes albopictus em uma placa de esmalte, adicione 1000 mL de água da torneira e deixe repousar por mais de 24 h. Os ovos eclodem em larvas em 1-2 dias.
    2. As larvas mudam uma vez a cada 1-2 dias, ou seja, aumentam um ínstar. Selecione 1000 larvas no final do terceiro ínstar ou no início do quarto ínstar após reprodução por 2-3 gerações sem entrar em contato com nenhum inseticida químico no laboratório para o teste.
      NOTA: Se a densidade das larvas for muito alta, divida-as em placas para permitir que as larvas cresçam normalmente.

3. Detecção do efeito tóxico da decocção de C. abrotanoides L. sobre larvas de Ae. albopictus pelo método de imersão

  1. Agrupamento de conjuntos
    1. Defina o grupo experimental: Prepare decocções de C. abrotanoides L. (50 mL) com três concentrações de drogas (120 mg / mL, 240 mg / mL e 360 mg / mL).
    2. Grupo de controle em branco: Use água sem cloro (caseira: água da torneira em repouso por mais de 24 h) com o mesmo volume do medicamento.
    3. Grupo de controle positivo: Prepare o medicamento deltametrina, um inseticida químico comum, na concentração final de 0,05 mg/mL.
  2. Adicionando medicamento líquido
    1. Use vários copos plásticos descartáveis com volume superior a 200 mL e adicione 35 larvas de Ae. albopictus no final do terceiro ou início do quarto ínstar a 50 mL de água desclorada.
    2. No grupo experimental, adicione 50 mL de decocção de água refinada de C. abrotanoides L. de cada concentração, agite suavemente e misture uniformemente para um volume total de 100 mL. As concentrações finais da decocção de água refinada de C. abrotanoides L. são 60 mg/mL, 120 mg/mL e 180 mg/mL.
    3. No grupo de controle em branco, adicione 50 mL de água desclorada a um volume total de 100 mL e marque-o como controle em branco.
    4. No grupo de controle positivo, adicione 50 mL de solução de deltametrina com uma concentração de 0,1 mg / mL, agite suavemente e misture uniformemente para um volume total de 100 mL até uma concentração final de 0,05 mg / mL e marque-o como controle positivo.
  3. Observações
    1. Transfira suavemente os copos plásticos marcados para a sala de observação com o mesmo ambiente de alimentação e registre as mortes de Ae. larvas de albopictus em cada grupo experimental e controle em 12 h, 24 h, 36 h e 48 h, respectivamente. Observe os indivíduos mortos ao microscópio e compare-os com as larvas normais de Ae. albopictus .
    2. No ponto de observação acima, se as larvas foram agitadas com uma agulha fina afiada e não puderam escapar ou não tiveram resposta, considere-as mortas. Repita o teste três vezes.
      NOTA: Se a mortalidade das larvas no grupo controle excedesse 20%, os resultados do teste eram inválidos e precisavam ser repetidos. A abordagem geral está resumida na Figura 2.

4. Experiência exterior da simulação

  1. Aplique as três concentrações de decocção de C. abrotanoides L. às larvas de Ae. albopictus em condições externas para observar a morte larval. Compare se existe alguma diferença entre o efeito tóxico e o do laboratório.
  2. Aplique as três concentrações de C. abrotanoides L. decocção de água refinada à carpa cruciana selvagem em condições externas para observar se isso afetou o crescimento da carpa cruciana. Isso é para julgar preliminarmente se o C. abrotanoides L.A decocção de água refinada causa danos ao meio ambiente ecológico.
    NOTA: As concentrações foram semelhantes às concentrações mencionadas na etapa 3.2.2. Os pontos de tempo usados são 12 h, 24 h, 36 h e 48 h, respectivamente. O efeito do experimento de simulação de campo foi julgado comparando a mortalidade de Ae. albopictus tratado com decocção de C. abrotanoides L. em condições de alimentação em laboratório e condições naturais ao ar livre.

5. Análise estatística

  1. Expresse os dados quantitativos em Média ± DP e os dados de contagem como porcentagens (%).
    NOTA: O método de inferência estatística utilizado foi de p < 0,05, e a diferença foi estatisticamente significativa.
  2. Utilizou-se software apropriado para análise estatística dos dados e as toxicidades de três diferentes concentrações de C. abrotanoides A decocção de L. para larvas de Ae. albopictus foi utilizada para determinar preliminarmente qual concentração de decocção teve a melhor toxicidade para larvas de Ae. albopictus .

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Resultados

Aqui, capim inteiro de C. abrotanoides L. neste estudo foi coletado da natureza (Figura 1). Após a identificação de C. abrotanoides L., a decocção de C. abrotanoides L. foi obtida pelo método de decocção (Figura 2) e preparada em diferentes concentrações (60 mg/mL, 120 mg/mL e 180 mg/mL). Foi aplicado em larvas de Ae. albopictus pelo método de imersão lar...

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Discussão

Atualmente, Ae. albopictus tornou-se uma das 100 espécies mais invasoras do mundo. De acordo com estatísticas da Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2020, as áreas mais afetadas por Ae. albopictus na Ásia serão responsáveis por aproximadamente 70% da carga global de doenças12. Como vetor vital da dengue, febre amarela e outras doenças transmitidas por mosquitos, o Ae. albopictus pode ser amplamente distribuído em todo o mu...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Xin-Ru Wang, da Universidade de Minnesota, por sugestões e orientações perspicazes. Este trabalho foi apoiado pelo fundo de pesquisa científica da Faculdade de Medicina de Qiannan para Nacionalidades (Qnyz202112, QNYZ202205) e pelo Fundo de Ciência e Tecnologia da Comissão Provincial de Saúde de Guizhou (qwjh [2022] No. 101, projeto gzwkj2023-251).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone (analytical purity)Shanghai Shenbo Chemical Co., Ltd
Crucian carpGuangzhou Yunfeng aquaculture Co., Ltd
Chicken liver powderself made
Dechlorinated waterself madeThe tap water standing for more than 24 hours
Deltamethrin technicalNanjing Lesheng Biotechnology Co., LtdPurity: 94.62%
Disposable plastic cupGuizhou Fuqiang technology Packaging Co., Ltd220ML-A1
Egg collecting cupself made
Electric blast drying ovenHangzhou Aipu Instrument Equipment Co., LtdWGLL-230BE
Electric water distillerBeijing Xinrun Kono Instrument Co., LtdTT-98-II
GraphPad PrismGraphPad SoftwareData processing and graphics software
Integrated digital microscopeChongqing Aote Optical Instrument Co., LtdSMARTe-500
Mosquito feeding cageNanjing Lesheng Biotechnology Co., Ltdcustom made
Multifunctional induction cookerGuangdong Midea living appliance manufacturing Co., LtdC21-WK2102custom made
Qualitative filter paperHangzhou Fuyang Beimu pulp and Paper Co., Ltd15cm-102
Rotary evaporatorHenan Jingbang Instrument Equipment Co., LtdR-1010
Small crusherJinhua Mofei household appliances Co., LtdCHY-6001
SPSS Version 25.0IBMstatistical software
Standard sample sieveHebei Hengshui Anping lvruo wire mesh products Co., Ltd100-30custom made
Sugar water,10%self made

Referências

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