原代培养中分化的小鼠脂肪细胞:胰岛素抵抗模型

摘要

该协议描述了从皮下脂肪中分离小鼠前脂肪细胞，它们分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗。通过蛋白质印迹的胰岛素信号通路成员的磷酸化/激活来评估胰岛素作用。该方法可以直接测定原代脂肪细胞的胰岛素抵抗/敏感性。

摘要

胰岛素抵抗是胰岛素对其靶细胞的影响降低，通常源于胰岛素受体信号传导的减少。胰岛素抵抗导致2型糖尿病（T2D）和其他肥胖衍生疾病的发展，这些疾病在世界范围内患病率很高。因此，了解胰岛素抵抗的潜在机制非常重要。几种模型已被用于研究 体内 和 体外胰岛素抵抗;原代脂肪细胞是研究胰岛素抵抗机制和鉴定抵消这种情况的分子和胰岛素增敏药物分子靶标的一种有吸引力的选择。在这里，我们使用用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的培养物中的原代脂肪细胞建立了胰岛素抵抗模型。

通过磁细胞分离技术从胶原酶消化的小鼠皮下脂肪组织中分离出的脂肪细胞前体细胞（APC）分化为原代脂肪细胞。然后通过TNF-α治疗诱导胰岛素抵抗，TNF-是一种促炎细胞因子，可减少胰岛素信号级联反应成员的酪氨酸磷酸化/激活。通过蛋白质印迹定量胰岛素受体 （IR）、胰岛素受体底物 （IRS-1） 和蛋白激酶 B （AKT） 磷酸化降低。该方法为研究脂肪组织中介导胰岛素抵抗的机制提供了极好的工具。

引言

胰岛素是由胰岛β细胞产生的合成代谢激素，是葡萄糖和脂质代谢的关键调节因子。在其众多功能中，胰岛素调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖异生、蛋白质合成、脂肪生成和脂肪分解¹。胰岛素与其受体（IR）相互作用后的初始分子信号是IR²的内在酪氨酸蛋白激酶活性的激活，导致其自身磷酸化³和随后称为胰岛素受体底物（IRS）的蛋白质家族的激活，其与衔接蛋白结合导致级联蛋白激酶的激活4.胰岛素激活两种主要的信号通路:磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白激酶B（AKT）和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。前者构成一个主要的分支点或节点⁴，^5，用于激活参与各种生理功能的众多下游效应子，包括调节燃料稳态，而后者调节细胞生长和分化4^，6。胰岛素作用最终取决于细胞类型和^{生理环境7}。

主要的胰岛素反应代谢组织之一是脂肪组织。白色脂肪组织是人类和啮齿动物中最丰富的脂肪类型，分布在皮下脂肪（皮肤和肌肉之间）和内脏脂肪（腹腔器官周围）中。鉴于其体积大，脂肪细胞或脂肪细胞是脂肪组织中最丰富的细胞类型。这些脂肪细胞可以是棕色/米色（产热）、粉红色（乳腺）和白色^8，9。白色脂肪细胞以甘油三酯的形式保持体内的主要能量储备，这是一种胰岛素依赖性过程。胰岛素促进葡萄糖转运和脂肪生成，同时抑制脂肪分解或脂质分解^7，10。它还有助于前脂肪细胞分化为脂肪细胞 - 成熟的脂肪储存细胞¹¹。

当正常胰岛素水平产生减弱的生物反应时，就会发生胰岛素抵抗，从而导致代偿性高胰岛素血症¹²。胰岛素抵抗是一种与超重和肥胖相关的^疾病5，当它们结合在一起时会导致2型糖尿病（T2D）和其他代谢性疾病¹³。高胰岛素血症补偿外周组织中的胰岛素抵抗，以维持正常的血糖水平¹⁴。然而，最终的β细胞丢失或衰竭，以及胰岛素抵抗加剧，导致血糖水平升高，符合T2D⁵。因此，胰岛素抵抗和高胰岛素血症可导致肥胖衍生代谢疾病的发展¹⁵。此外，肥胖可能导致慢性低度局部炎症，促进脂肪组织中的胰岛素抵抗¹⁵，^16，17。此外，肥胖引起的脂肪组织改变，如纤维化、炎症以及血管生成和脂肪生成减少，导致脂联素血清水平（一种胰岛素增敏剂）降低，纤溶酶原激活剂抑制剂 1 （PAI-1）、游离脂肪酸和外泌体等因子分泌增加进入血液，加剧胰岛素抵抗¹⁷。

胰岛素抵抗的许多方面仍然未知。已经开发了体外和体内模型来研究介导主要靶组织（包括脂肪组织）中胰岛素抵抗的机制。体外模型的优点是研究人员可以更好地控制环境条件，并且可以评估特定细胞类型的胰岛素抵抗。特别是，脂肪细胞前体细胞（APC）具有供体组织的个体表型，这可能比脂肪细胞系更好地反映生理学。体外诱导胰岛素抵抗的一个主要因素是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。TNF-α是由脂肪组织中的脂肪细胞和巨噬细胞分泌的促炎细胞因子¹⁸。虽然适当的脂肪组织重塑和扩增是必需的¹⁹，但长期暴露于TNF-α会在体内脂肪组织和体外脂肪细胞中诱导胰岛素抵抗²⁰。几种细胞类型的慢性TNF-α处理导致IR和IRS-1的丝氨酸磷酸化增加，从而促进酪氨酸磷酸化减少²¹。IRS-1在丝氨酸残基上的磷酸化增加抑制IR酪氨酸激酶活性，可能是慢性TNF-α治疗损害胰岛素作用的关键机制之一^22，23。TNF-α激活涉及核因子ĸB激酶β（IKKβ）和c-Jun N末端激酶（JNK）的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的途径²⁴。JNK诱导复杂的促炎转录程序，但也直接磷酸化IRS-1⁶。

了解胰岛素抵抗的发病机制对于指导未来针对T2D的疗法的开发变得越来越重要。APC已被证明是研究脂肪细胞生物学的优秀模型，包括对胰岛素的敏感性和抵抗力，以及独立于全身环境鉴定脂肪细胞的内在特性。APC可以很容易地从不同的脂肪库获得，并在适当的条件下分化成成熟的脂肪细胞。使用这种方法，可以评估对脂肪细胞中胰岛素抵抗/敏感性的直接影响。

研究方案

所有啮齿动物实验均由墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理学委员会批准，协议编号075。

1.小鼠脂肪细胞前体细胞的分离

1. 对8-10周龄的雄性C57BL / 6小鼠实施安乐死（例如，通过CO₂吸入和随后的宫颈脱位）（每次分离四只动物）。用70%乙醇摩擦对小鼠进行消毒，并在处死后立即获得脂肪组织。
   注意:啮齿动物安乐死后，立即分离脂肪组织并在无菌层流罩内执行所有步骤。将小鼠保持在12小时的光照/黑暗循环下，自由获取食物和水。
2. 解剖每只小鼠的腹股沟皮下脂肪组织。仅去除脂肪组织，避免去除肌肉、皮肤或任何其他组织，并将其收集在含有 15 mL 1 型胶原酶溶液 （1.5 mg/mL） 的 50 mL 锥形管中。将 1 型胶原酶溶解在 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 高葡萄糖-1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中，并通过 0.2 μm 注射器过滤器过滤。
3. 用无菌手术剪刀将脂肪组织切成小块，并通过在37°C的轨道振荡器（150rpm）中与1型胶原酶溶液孵育30分钟来消化样品（将含有脂肪和胶原酶的管放在水平位置以获得更大的振荡表面）。每10分钟检查一次消化，以确保其有效（组织降解可见）并防止消化过度（见 补充图S1）。
4. 使用200μm网状注射器（先前高压灭菌）过滤以消除未被胶原酶消化的组织。将过滤器穿过管的边缘，将尽可能多的细胞排入溶液中。加入15mL冷DMEM-1%BSA停止消化并在4°C下以400× g 离心10分钟。
5. 吸出含有成熟脂肪细胞的顶层和大部分液体层;避免触摸或干扰颗粒。加入 20 mL 冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS）-2% 胎牛血清 （FBS） 并重悬沉淀。在4°C下以400× g 离心5分钟。
6. 除去上清液，首先吸出上层以消除残留的脂肪细胞和脂肪。将沉淀重悬于1mL氯化铵钾（ACK）裂解缓冲液（以裂解红细胞）中，并在冰上孵育5分钟。加入10mL的PBS-2%FBS，混合，并在4°C下以400× g 离心5分钟。
7. 吸出上清液并将沉淀重悬于200μL抗Fc溶液（纯化的大鼠抗小鼠CD16 / CD32稀释于PBS-2%FBS [1:150]中）中，以减少目标抗体的Fc受体介导的结合。在冰上孵育5分钟。将细胞悬液转移到适合磁性细胞分离器的预冷架中的5mL管中，并在4°C下以400 ×g 离心5分钟。
8. 消除上清液，加入200μLCD31（PECAM-1）单克隆抗体（390）-生物素（1:100）和CD45单克隆抗体（30-F11）-生物素（1:100）的混合物，混合均匀，并在冰上孵育15分钟（在抗Fc溶液中制备抗体稀释液;见 表1）。加入400μLPBS-2%FBS，并在4°C下以400× g 离心5分钟。
   注意:CD31和CD45分别是内皮细胞和造血细胞的标志物。
9. 吸出上清液并在 100 μL 抗生物素微珠 （1:5） 中在冰上孵育 15 分钟（在抗 Fc 溶液中制备抗体稀释液，参见 表 1）。加入400μLPBS-2%FBS，并在4°C下以400× g 离心5分钟。
10. 弃去上清液并将沉淀重悬于350μLPBS-2%FBS中。用预分离过滤器（70μm）从单细胞悬浮液中去除细胞聚集体或大颗粒。首先，用 100 μL PBS-2% FBS 激活过滤器，将细胞悬液通过过滤器（收集在干净的管中），最后用 100 μL PBS-2% FBS 清洗过滤器。
11. 使用带有磁性细胞分离器的负分离策略对细胞进行磁分离。
    1. 将样品放在冷藏架的位置A（确保架子预冷），将两个空管放在位置B和C，以分别回收未标记和标记的细胞。
    2. 在打开设备之前，将洗涤缓冲液和电泳缓冲液装入相应的瓶子中。对设备进行编程，以使用 耗尽 方案对细胞进行磁分离。
       注意:如果回收是最高优先级，则本协议用于在 标准模式下 去除具有正常抗原表达的细胞（在这种情况下，用抗CD31和抗CD45标记的细胞）。
    3. 在分离部分中，选择要分离的样品数量，然后选择耗尽方案。按运行并开始分离。在程序结束时，回收未标记的细胞并在4°C下以400×g离心5分钟。
12. 除去上清液并将沉淀重悬于500μL生长培养基中（表1）。
13. 将APC接种在先前涂有2.5%基底膜基质的12孔板的一个孔中（获得约50，000-75，000个细胞）。加入 400 μL 2.5% 基底膜基质以覆盖每个孔的整个表面。去除过量溶液并仅留下一小层后，立即让板在层流罩内干燥（没有盖子）至少1小时。在37°C的5%CO₂ 气氛中孵育。每48小时更换一次培养基，直到细胞达到80%汇合。
14. 在 80% 汇合时，完全除去培养基并用 350 μL PBS-2% FBS 洗涤。用350μL的0.05%胰蛋白酶-EDTA在37°C下收获细胞2分钟。 加入 2 mL 生长培养基并将细胞收集在新的 50 mL 锥形管中，然后以 400 × g 离心 5 分钟。
15. 将APC传代到先前用2.5%基底膜基质包被的12孔板（每孔10，000-20，000个细胞）中。在37°C与5%CO₂孵育。每48小时更换一次培养基，直到细胞达到80%汇合。
    注意:APC 可以传代一次。随后，它们失去了增殖和分化的能力。请参阅 补充图 S2 中 APC 隔离过程的工作流程。

2.脂肪细胞分化和胰岛素抵抗的诱导

注意:将细胞保持在37°C的5%CO₂中，并在无菌罩内执行涉及更换培养基和TNF-α和胰岛素处理的步骤。

1. 在80%汇合时，开始分化过程;吸出任何生长培养基，并在每个孔中用含有3.3nM骨形态发生蛋白（BMP4）的500μL分化培养基（表1）代替。
2. 48小时后，用分化培养基（每孔500μL）和分化混合物（表1）替换培养基。
3. 72小时后取出培养基，并在500μL新鲜分化培养基中加入100nM胰岛素。
   注意:细胞开始呈现圆形外观，内部有小脂滴。
4. 吸出任何分化培养基，并在48小时后用500μL简单培养基-2%FBS替换（表1）。用 4 ng/mL 的 TNF-α 诱导胰岛素抵抗。包括未经TNF-α处理的对照孔。
5. 孵育24小时后，在简单的培养基-0%FBS中加入4ng / mL TNF-α（表1）。维护没有TNF-α处理的控制井。
6. 24小时后通过加入100nM胰岛素激活胰岛素信号通路，并在37°C下在5%CO₂ 气氛中孵育15分钟。取出培养基并用 500 μL PBS 洗涤。包括没有胰岛素治疗的对照孔。

3. 蛋白质印迹评估胰岛素信号通路

1. 蛋白质提取和定量
   1. 用 500 μL PBS 洗涤每个细胞孔，并保持在冰上以在样品分离前添加的含有 1% 蛋白酶抑制剂混合物的 50 μL RIPA 缓冲液（表 1）中裂解细胞。用尖端刮擦孔的整个表面，并将裂解物转移到0.6 mL微量离心管中（保持在冰上）。
   2. 在旋转摇床中于4°C孵育1小时，涡旋混合，并在4°C下以8，000× g 离心15分钟，并回收上清液（保持在冰上）。
   3. 使用布拉德福德测定法测定蛋白质浓度（不要稀释样品进行定量）。
   4. 取对应于40-60μg的必要体积，并通过在97°C下孵育15分钟，同时以550rpm振荡，用6x Laemmli缓冲液（表1）变性。冷冻直至使用。
2. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
   1. 使用1.5毫米厚的7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将凝胶插入电泳槽中并填充电泳缓冲液（表1）。
   2. 向凝胶的第一个孔中加入 3 μL 预染色蛋白质标准品，并将每个样品加载到后续孔中。
   3. 在80 V下运行凝胶约15分钟，以确保样品进入聚丙烯酰胺浓缩器凝胶基质。此后，将电压增加到90 V2.5小时或直到在凝胶底部边缘可以看到37 kDa分子量标记。
   4. 将蛋白质从凝胶转移到半干燥室中的硝酸纤维素膜上，以25V的速度35分钟。 事先将凝胶，膜和过滤器浸入转膜缓冲液（表1）中几分钟。
3. 蛋白质印迹
   1. 转移后，用含有0.1%吐温20（TBS-T 0.1%）（表1）的Tris缓冲盐水（TBS）洗涤膜3分钟，以30rpm振荡。
   2. 用封闭溶液（表1）在4°C下恒定旋转1小时封闭膜。
   3. 根据分子量标记将膜切成三部分，与不同的一抗（在封闭溶液中稀释）在4°C下孵育过夜，恒定旋转:磷酸化IRS1（Tyr608）抗体（1:1，000），预期条带为180kDa;磷酸化胰岛素受体β（Tyr1150/1151）抗体（1:1，000），预期条带为95 kDa;磷酸化-Akt （Ser473） 抗体 （1:1，000），预期条带为 60 kDa。
   4. 用TBS-T 0.1%洗涤膜5次，每次5分钟。
   5. 将膜与相应的过氧化物酶偶联二抗（在封闭溶液中稀释）在室温下孵育2小时，恒定旋转:过氧化物酶亲和纯驴抗兔IgG（H + L）（1:5，000）。
   6. 用TBS-T 0.1%洗涤膜5次，每次5分钟。
   7. 使用化学发光检测系统检测蛋白质。根据制造商的说明准备基材。
   8. 将印迹膜放入塑料袋中，加入 200 μL 化学发光底物以完全覆盖膜。排出多余的基材并去除任何气泡。
   9. 在与化学发光兼容的高性能成像系统中将每个印迹曝光30-60秒。
   10. 剥离膜（蛋白质印迹部分的步骤10-13）以破坏抗体 - 抗原相互作用，从而使硝酸纤维素膜重新印迹。回收膜并以50rpm的速度用TBS-T 1%洗涤3次5分钟。
   11. 用 10 mL 的 0.2 M NaOH 以 50 rpm 孵育 7 分钟。
   12. 用自来水以 50 rpm 的速度清洗 3 次，每次 5 分钟。
   13. 用TBS-T 1%以50rpm洗涤10分钟。
   14. 重复蛋白质印迹切片的步骤2-9，以1:1，000稀释度将膜与抗β微管蛋白（55 kDa）作为上样对照孵育。
   15. 使用 ImageJ 软件 （https://imagej.nih.gov/） 对每种蛋白质进行密度分析²⁵。

结果

在过去的几年中，肥胖和T2D患病率的增加促使人们强烈寻找介导脂肪组织中胰岛素抵抗的机制。通过此处描述的方案，APC可以分化为成熟的脂肪细胞，以评估胰岛素抵抗和敏感性。一旦APC达到汇合，则需要10天才能完成分化为成熟脂肪细胞及其TNF-α介导的胰岛素抵抗诱导（图1）。

APCs显示出成纤维细胞样形态，其特征在于其扁平和细长的形状以及它们在?...

讨论

本文提供了一种研究胰岛素抵抗的方法，该方法使用用TNF-α处理的培养物中的原代脂肪细胞。该模型的优点是原代脂肪细胞可以在规定的条件下长时间培养，并严格控制细胞环境因素²⁶。测定持续时间为15-20天，尽管实验之间可能发生分化脂肪细胞百分比的变化。原代脂肪细胞比细胞系具有优势，因为它们在培养中没有持续扩增，并且更紧密地捕获了它们来源的组织多样性

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer - TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T