Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Résumé

La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).

Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.

Introduction

L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse¹. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR², entraînant son autophosphorylation³ et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous le nom de substrats des récepteurs de l’insuline (PID), qui se lie aux protéines adaptatrices conduisant à l’activation d’une cascade de protéines kinases⁴ . L’insuline active deux voies de signalisation principales: la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protéine kinase B (AKT) et la protéine kinase activée par Ras-mitogène (MAPK). Le premier constitue un point de branche ou nœud majeur ^4,5 pour l’activation de nombreux effecteurs en aval impliqués dans diverses fonctions physiologiques, y compris la régulation de l’homéostasie du carburant, tandis que le second régule la croissance et la différenciation cellulaires ^4,6. Les actions de l’insuline dépendent en fin de compte du type cellulaire et du contexte physiologique⁷.

L’un des principaux tissus métaboliques sensibles à l’insuline est le tissu adipeux. Le tissu adipeux blanc est le type de graisse le plus abondant chez les humains et les rongeurs, distribué dans la graisse sous-cutanée (entre la peau et les muscles) et la graisse viscérale (autour des organes de la cavité abdominale). Compte tenu de leur grand volume, les adipocytes ou cellules graisseuses sont le type de cellule le plus abondant dans le tissu adipeux. Ces cellules graisseuses peuvent être brunes/beiges (thermogéniques), roses (dans la glande mammaire) et blanches ^8,9. Les adipocytes blancs conservent les principales réserves d’énergie dans le corps sous forme de triglycérides, un processus insulino-dépendant. L’insuline favorise le transport du glucose et la lipogenèse, tout en inhibant la lipolyse ou la dégradation des lipides ^7,10. Il facilite également la différenciation des préadipocytes en adipocytes – les cellules matures stockant les graisses¹¹.

La résistance à l’insuline se produit lorsqu’un taux d’insuline normal produit une réponse biologique atténuée, entraînant une hyperinsulinémie compensatoire¹². La résistance à l’insuline est une affection associée au surpoids et à l’obésité⁵ qui, lorsqu’elle est combinée, entraîne le diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies métaboliques¹³. L’hyperinsulinémie compense la résistance à l’insuline dans les tissus périphériques pour maintenir une glycémie normale¹⁴. Cependant, la perte ou l’épuisement éventuel de cellules β, ainsi qu’une résistance exacerbée à l’insuline, entraînent une glycémie élevée compatible avec le DT25. Par conséquent, la résistance à l’insuline et l’hyperinsulinémie peuvent contribuer au développement de maladies métaboliques dérivées de l’obésité¹⁵. En outre, l’obésité peut provoquer une inflammation locale chronique de bas grade favorisant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux^15,16,17. En outre, les altérations du tissu adipeux dérivées de l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation et la réduction de l’angiogenèse et de l’adipogenèse, entraînent une baisse des taux sériques d’adiponectine (un sensibilisant à l’insuline) et une augmentation de la sécrétion de facteurs tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 (PAI-1), les acides gras libres et les exosomes dans la circulation sanguine, exacerbant la résistance à l’insuline¹⁷.

De nombreux aspects sous-jacents à la résistance à l’insuline restent inconnus. Des modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans les principaux tissus cibles, y compris le tissu adipeux. L’avantage des modèles in vitro est que les chercheurs ont plus de contrôle sur les conditions environnementales et peuvent évaluer la résistance à l’insuline dans des types cellulaires spécifiques. En particulier, les cellules précurseurs adipocytaires (APC) ont le phénotype individuel du tissu donneur, ce qui pourrait mieux refléter la physiologie que les lignées cellulaires adipocytes. L’un des principaux facteurs induisant la résistance à l’insuline in vitro est le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes et les macrophages dans le tissu adipeux¹⁸. Bien qu’elle soit nécessaire pour un remodelage et une expansion appropriés du tissu adipeux¹⁹, l’exposition à long terme au TNF-α induit une résistance à l’insuline dans le tissu adipeux in vivo et dans les adipocytes in vitro²⁰. Le traitement chronique par le TNF-α de plusieurs types cellulaires entraîne une augmentation de la phosphorylation de la sérine de l’IR et de l’IRS-1, favorisant ainsi une diminution de la phosphorylation de la tyrosine²¹. L’augmentation de la phosphorylation de l’IRS-1 sur les résidus de sérine inhibe l’activité de la tyrosine kinase IR et peut être l’un des principaux mécanismes par lesquels le traitement chronique par le TNF-α altère l’action de l’insuline^22,23. Le TNF-α active des voies impliquant l’inhibiteur de la sérine/thréonine kinase du facteur nucléaire ĸB kinase β (IKKβ) et de la kinase terminale c-Jun N (JNK)²⁴. JNK induit un programme transcriptionnel pro-inflammatoire complexe mais phosphoryle aussi directement IRS-1⁶.

Comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline est devenu de plus en plus important pour guider le développement de futures thérapies contre le DT2. Les APC se sont révélés être un excellent modèle pour l’étude de la biologie des cellules adipeuses, y compris la sensibilité et la résistance à l’insuline, et pour identifier les propriétés intrinsèques des adipocytes indépendamment de l’environnement systémique. Les APC peuvent être facilement obtenus à partir de différents dépôts adipeux et, dans les conditions appropriées, différenciés en adipocytes matures. Avec cette méthode, les effets directs sur la résistance / sensibilité à l’insuline peuvent être évalués dans les adipocytes.

Protocole

Toutes les expériences sur les rongeurs ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’UNAM, protocole numéro 075.

1. Isolement de cellules précurseurs adipocytaires de souris

1. Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines (p. ex. par inhalation de CO₂ et luxation cervicale subséquente) (quatre animaux par isolement). Désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70% et obtenez le tissu adipeux immédiatement après le sacrifice.
   REMARQUE: Après l’euthanasie des rongeurs, isoler immédiatement le tissu adipeux et effectuer toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Les souris sont maintenues sous des cycles lumière/obscurité de 12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.
2. Disséquer le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris. Retirer seulement le tissu adipeux, en évitant l’ablation du muscle, de la peau ou de tout autre tissu, et le recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de collagénase de type 1 (1,5 mg/mL) sur de la glace. Dissoudre la collagénase de type 1 dans l’albumine sérique bovine (BSA) à haute teneur en glucose et 1% de Dulbecco Eagle Medium (DMEM) et filtrer à travers des filtres à seringue de 0,2 μm.
3. Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type 1 à 37 °C dans un agitateur orbital (150 tr/min) pendant 30 min (placer le tube contenant de la graisse et de la collagénase en position horizontale pour une plus grande surface agitée). Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne (la dégradation des tissus est visible) et pour éviter la surdigestion (voir la figure supplémentaire S1).
4. Filtrer à l’aide d’une seringue à mailles de 200 μm (préalablement autoclavée) pour éliminer les tissus non digérés avec de la collagénase. Passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution. Ajouter 15 mL de DMEM-1% BSA froid pour arrêter la digestion et centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C.
5. Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide; Évitez de toucher ou de déranger le granulé. Ajouter 20 mL de sérum de bœuf bovin fœtal (PBS) tamponné au phosphate froid (PBS) à 2 % et remettre le granulé en suspension. Centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
6. Retirez le surnageant, en aspirant d’abord la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et la graisse restants. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium potassium (ACK) (pour lyser les globules rouges) et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ajouter 10 mL de PBS-2% FBS, mélanger et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
7. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de solution anti-Fc (CD16/CD32 anti-souris de rat purifié dilué dans du FBS PBS-2% [1:150]) pour réduire la liaison médiée par le récepteur Fc par les anticorps d’intérêt. Incuber sur la glace pendant 5 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL qui s’insère dans les racks prérefroidis d’un séparateur de cellules magnétiques et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
8. Éliminer le surnageant, ajouter 200 μL du mélange d’anticorps monoclonal CD31(PECAM-1) (390)-biotine (1:100) et d’anticorps monoclonal CD45 (30-F11)-biotine (1:100), bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes (préparer les dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc; voir Tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
   NOTE: CD31 et CD45 sont des marqueurs des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques, respectivement.
9. Aspirer le surnageant et incuber dans 100 μL de microbilles antibiotines (1:5) pendant 15 min sur glace (préparer des dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc, voir le tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 350 μL de PBS-2% FBS. Éliminer les agrégats cellulaires ou les grosses particules des suspensions unicellulaires à l’aide d’un filtre de préséparation (70 μm). Tout d’abord, activez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS, passez la suspension cellulaire à travers le filtre (recueillir dans un tube propre) et enfin lavez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS.
11. Effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative avec un séparateur de cellules magnétiques.
    1. Placer l’échantillon dans la position A de la grille de refroidissement (s’assurer que la grille est prérefroidie) et deux tubes vides en position B et C pour récupérer les cellules non marquées et étiquetées, respectivement.
    2. Chargez le tampon de lavage et le tampon de fonctionnement dans les bouteilles correspondantes avant d’allumer l’équipement. Programmer l’équipement pour effectuer la séparation magnétique des cellules avec le protocole DEPLETE .
       REMARQUE: Ce protocole est pour la déplétion en mode standard pour l’élimination des cellules avec une expression antigénique normale (dans ce cas, les cellules marquées avec anti-CD31 et anti-CD45), si la récupération est la plus haute priorité.
    3. Dans la section de séparation , sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole DEPLETE . Appuyez sur Exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérer les cellules non marquées et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.
12. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de croissance (tableau 1).
13. Ensemencer les APC dans un puits d’une plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 % (environ 50 000 à 75 000 cellules sont obtenues). Ajouter 400 μL de matrice membranaire basale à 2,5 % pour couvrir toute la surface de chaque puits. Immédiatement après avoir retiré l’excès de solution et ne laisser qu’une petite couche, laissez sécher la plaque (sans couvercle) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h. Incuber à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO₂ . Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
14. À 80% de confluence, retirer complètement le milieu et laver avec 350 μL de PBS-2% FBS. Récolter les cellules avec 350 μL de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de croissance et recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL, puis centrifuger à 400 × g pendant 5 min.
15. Passage des APC vers des plaques à 12 puits (10 000 à 20 000 cellules par puits) préalablement recouvertes d’une matrice membranaire basale à 2,5 %. Incuber à 37 °C avec 5% de CO₂. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.
    REMARQUE: Les APC peuvent être passés une fois. Par la suite, ils perdent leur capacité à proliférer et à se différencier. Voir le workflow pour le processus d’isolation des APC dans la figure supplémentaire S2.

2. Différenciation des adipocytes et induction de la résistance à l’insuline

REMARQUE : Maintenir les cellules à 37 °C dans 5 % de CO₂ et effectuer des étapes impliquant un changement de milieu et des traitements avec du TNF-α et de l’insuline à l’intérieur d’une cagoule stérile.

1. À 80% de confluence, commencer le processus de différenciation; aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 μL de milieu de différenciation (tableau 1) contenant 3,3 nM de protéine morphogénétique osseuse (BMP4) dans chaque puits.
2. Après 48 h, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (500 μL par puits) et le cocktail de différenciation (tableau 1).
3. Retirer le milieu 72 h plus tard et ajouter 100 nM d’insuline dans 500 μL de milieu de différenciation frais.
   REMARQUE: Les cellules commencent à montrer un aspect rond avec de petites gouttelettes lipidiques à l’intérieur.
4. Aspirer tout milieu de différenciation et le remplacer par 500 μL de milieu simple - FBS à 2% (tableau 1) 48 h plus tard. Induire une résistance à l’insuline avec 4 ng/mL de TNF-α. Inclure les puits témoins sans traitement au α au TNF.
5. Après 24 heures d’incubation, ajouter 4 ng/mL de TNF-α dans du FBS simple à 0 % (tableau 1). Maintenir les puits de contrôle sans traitement au α TNF.
6. Activer la voie de signalisation de l’insuline 24 h plus tard en ajoutant 100 nM d’insuline et incuber pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère de CO₂ à 5%. Retirer le milieu et laver avec 500 μL de PBS. Inclure les puits témoins sans traitement à l’insuline.

3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western

1. Extraction et quantification des protéines
   1. Lavez chaque puits de cellules avec 500 μL de PBS et conservez-les sur la glace pour lyser les cellules dans 50 μL de tampon RIPA (tableau 1) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase à 1 % ajouté juste avant l’isolement de l’échantillon. Grattez toute la surface du puits avec une pointe et transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL (garder sur la glace).
   2. Incuber pendant 1 h à 4 °C dans un agitateur rotatif, mélanger par tourbillon, centrifuger à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C et récupérer le surnageant (garder sur la glace).
   3. Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford (ne pas diluer l’échantillon pour quantifier).
   4. Prélever le volume nécessaire correspondant à 40-60 μg et dénaturer avec 6x tampon Laemmli (tableau 1) en incubant à 97 °C pendant 15 min tout en agitant à 550 tr/min. Congeler jusqu’à utilisation.
2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS
   1. Effectuer une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) avec un gel de polyacrylamide à 7,5% d’épaisseur de 1,5 mm. Insérez le gel dans le réservoir et remplissez-le de tampon courant (tableau 1).
   2. Ajouter 3 μL de protéine étalon précolorée au premier puits du gel et charger chaque échantillon dans les puits suivants.
   3. Exécutez le gel à 80 V pendant environ 15 minutes pour s’assurer que l’échantillon pénètre dans la matrice de gel du concentrateur de polyacrylamide. Par la suite, augmentez la tension à 90 V pendant 2,5 h ou jusqu’à ce que le marqueur de poids moléculaire de 37 kDa puisse être vu sur le bord inférieur du gel.
   4. Transférer les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose dans une chambre semi-sèche pendant 35 min à 25 V. Au préalable, immergez le gel, la membrane et les filtres dans un tampon de transfert (tableau 1) pendant quelques minutes.
3. Western blot
   1. Après le transfert, laver la membrane avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (tableau 1) pendant 3 min en agitant à 30 tr/min.
   2. Bloquer la membrane avec une solution de blocage (tableau 1) à 4 °C pendant 1 h en rotation constante.
   3. Couper la membrane en trois parties selon le marqueur de poids moléculaire à incuber pendant une nuit avec différents anticorps primaires (dilués dans une solution bloquante) à 4 °C en rotation constante : anticorps Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1 000), bande attendue à 180 kDa ; Anticorps β récepteur phospho-insuline (Tyr1150/1151) (1:1 000), bande attendue à 95 kDa; Anticorps Phospho-Akt (Ser473) (1:1 000), bande attendue à 60 kDa.
   4. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
   5. Incuber les membranes avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase correspondant (dilué dans une solution bloquante) pendant 2 h à température ambiante en rotation constante : peroxydase affiniPure ânesse anti-lapin IgG (H+L) (1:5 000).
   6. Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.
   7. Détecter les protéines à l’aide du système de détection par chimiluminescence. Préparez le substrat conformément aux instructions du fabricant.
   8. Placez le transfert dans un sac en plastique et ajoutez 200 μL de substrat chimioluminescent pour recouvrir complètement la membrane. Vidangez l’excès de substrat et éliminez les bulles d’air.
   9. Exposez chaque transfert pendant 30-60 s dans un système d’imagerie haute performance compatible avec la chimiluminescence.
   10. Dénuder les membranes (étapes 10 à 13 de la section Western blot) pour briser les interactions anticorps-antigène et permettre ainsi aux membranes de nitrocellulose d’être regonflées. Récupérer les membranes et laver 3x pendant 5 min chacune avec TBS-T 1% à 50 tr/min.
   11. Incuber pendant 7 min avec 10 mL de NaOH 0,2 M à 50 rpm.
   12. Laver 3x pendant 5 min chacun avec de l’eau du robinet à 50 tr/min.
   13. Laver pendant 10 min avec TBS-T 1 % à 50 tr/min.
   14. Répéter les étapes 2 à 9 de la section Western blot pour incuber la membrane avec de la tubuline anti-bêta (55 kDa) comme contrôle de charge en utilisant une dilution de 1:1 000.
   15. Effectuer une analyse densitométrique²⁵ pour chaque protéine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

Résultats

Au cours des dernières années, la prévalence accrue de l’obésité et du DT2 a suscité une recherche intense des mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux. Avec le protocole décrit ici, les APC peuvent être différenciés en adipocytes matures pour évaluer la résistance et la sensibilité à l’insuline. Une fois que les APC atteignent la confluence, il faut 10 jours pour compléter leur différenciation en adipocytes matures et leur induction de résistance à l’insuline méd...

Discussion

Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires²⁶. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer	LONZA	10-548E
Anti-Biotin Microbeads	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Growth factor
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin	eBioscience	13-0451-85
Collagenase, Type 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexamethasone	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM low glucose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Growth factor
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Growth factor
Linoleic acid-albumin	Sigma	L9530
MCDB 201 medium	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18	Growth factor
Peniciline-Streptomycine	BioWest	L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)	Miltenyi	130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]	Sigma	I5879	Differentiation cocktail
BMP4	R&D Systems	5020-BP-010	Differentiation cocktail
Dexamethasone	Sigma	D1756	Differentiation cocktail
Insulin	Sigma	I9278
Rosiglitazone	Cayman	71742	Differentiation cocktail
TNFα	R&D Systems	210-TA-005
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody	Abcam	ab6046
Bromophenol blue	BioRad	161-0404	Laemmli buffer
EDTA	Sigma	E5134	RIPA buffer
EGTA	Sigma	E4378	RIPA buffer
FluorChem E system	ProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Running and Transfer buffer
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoethanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Methanol	JT Baker	907007	Transfer buffer
NaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Nitrocellulose membrane	BioRad	1620112
Nonfat dry milk	BioRad	1706404	Blocking solution
Prestained protein standard	BioRad	1610395
Protease inhibitor cocktail	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β	Cell signaling	3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody	Cell signaling	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody	Millipore	9432
Saccharose	JT Baker	407205	RIPA buffer
SDS	BioRad	1610302	Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	RIPA buffer - TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T