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Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Resumo

A resistência à insulina é um efeito reduzido da insulina sobre suas células-alvo, geralmente derivado da diminuição da sinalização dos receptores de insulina. A resistência à insulina contribui para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças derivadas da obesidade de alta prevalência em todo o mundo. Portanto, a compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência à insulina é de grande relevância. Vários modelos têm sido utilizados para estudar a resistência à insulina tanto in vivo quanto in vitro; Os adipócitos primários representam uma opção atraente para estudar os mecanismos de resistência à insulina e identificar moléculas que neutralizam essa condição e os alvos moleculares de drogas sensibilizadoras de insulina. Neste trabalho, estabelecemos um modelo de resistência insulínica utilizando adipócitos primários em cultura tratada com fator de necrose tumoral α (TNF-α).

As células precursoras de adipócitos (APCs), isoladas do tecido adiposo subcutâneo de camundongos digerido pela colagenase por tecnologia de separação magnética celular, são diferenciadas em adipócitos primários. A resistência à insulina é então induzida pelo tratamento com TNF-α, uma citocina pró-inflamatória que reduz a fosforilação/ativação da tirosina dos membros da cascata de sinalização da insulina. A diminuição da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato do receptor de insulina (IRS-1) e proteína quinase B (AKT) são quantificados por western blot. Este método fornece uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo.

Introdução

A insulina é um hormônio anabólico produzido pelas células β das ilhotas pancreáticas e o principal regulador do metabolismo da glicose e dos lipídios. Dentre suas diversas funções, a insulina regula a captação de glicose, a síntese de glicogênio, a gliconeogênese, a síntese proteica, a lipogênese e a lipólise1. O sinal molecular inicial após a interação da insulina com seu receptor (IR) é a ativação da atividade intrínseca da tirosina proteína quinase do IR2, resultando em sua autofosforilação3 e na subsequente ativação de uma família de proteínas conhecidas como substratos do receptor de insulina (IRS), que se liga a proteínas adaptadoras levando à ativação de uma cascata de proteínas quinases4 . A insulina ativa duas vias principais de sinalização: fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)-proteína quinase B (AKT) e proteína quinase ativada por mitógeno Ras (MAPK). O primeiro constitui um importante ponto de ramificação ou nó 4,5 para a ativação de numerosos efetores a jusante envolvidos em diversas funções fisiológicas, incluindo a regulação da homeostase do combustível, enquanto o segundo regula o crescimento e diferenciação celular 4,6. As ações da insulina dependem, em última instância, do tipo celular e do contexto fisiológico7.

Um dos principais tecidos metabólicos responsivos à insulina é o tecido adiposo. O tecido adiposo branco é o tipo de gordura mais abundante em humanos e roedores, distribuído na gordura subcutânea (entre a pele e os músculos) e na gordura visceral (ao redor dos órgãos da cavidade abdominal). Dado o seu grande volume, os adipócitos ou células adiposas são o tipo celular mais abundante no tecido adiposo. Essas células adiposas podem ser marrons/beges (termogênicas), róseas (na glândula mamária) ebrancas 8,9. Os adipócitos brancos mantêm as principais reservas energéticas do organismo na forma de triglicerídeos, um processo insulino-dependente. A insulina promove o transporte de glicose e a lipogênese, ao mesmo tempo em que inibe a lipólise ou a degradação lipídica 7,10. Também facilita a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos — as células maduras que armazenam gordura11.

A resistência à insulina ocorre quando um nível normal de insulina produz uma resposta biológica atenuada, resultando em hiperinsulinemia compensatória12. A resistência à insulina é uma condição associada ao sobrepeso e àobesidade5, que quando combinada leva ao diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças metabólicas13. A hiperinsulinemia compensa a resistência à insulina nos tecidos periféricos para manter os níveis glicêmicos normais14. No entanto, eventual perda ou exaustão de células β, juntamente com resistência insulínica exacerbada, leva a níveis elevados de glicose no sangue consistentes com DT25. Portanto, a resistência insulínica e a hiperinsulinemia podem contribuir para o desenvolvimento de doenças metabólicas derivadas da obesidade15. Além disso, a obesidade pode causar inflamação local crônica de baixo grau, promovendo resistência à insulina no tecido adiposo15,16,17. Além disso, alterações no tecido adiposo derivadas da obesidade, como fibrose, inflamação e redução da angiogênese e adipogênese, levam a níveis séricos mais baixos de adiponectina (um sensibilizador de insulina) e aumento da secreção de fatores como inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), ácidos graxos livres e exossomos na corrente sanguínea, exacerbando a resistência à insulina17.

Muitos aspectos subjacentes à resistência à insulina permanecem desconhecidos. Modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina nos principais tecidos-alvo, incluindo o tecido adiposo. A vantagem dos modelos in vitro é que os pesquisadores têm maior controle das condições ambientais e podem avaliar a resistência à insulina em tipos celulares específicos. Particularmente, as células precursoras de adipócitos (APCs) têm o fenótipo individual do tecido doador, o que pode refletir melhor a fisiologia do que as linhagens celulares de adipócitos. Um dos principais fatores indutores de resistência à insulina in vitro é o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória secretada por adipócitos e macrófagos no tecido adiposo18. Embora seja necessária para o adequado remodelamento e expansão do tecido adiposo19, a exposição prolongada ao TNF-α induz resistência à insulina no tecido adiposo in vivo e nos adipócitos in vitro20. O tratamento crônico com TNF-α de vários tipos celulares leva ao aumento da fosforilação da serina, tanto do IR quanto do IRS-1, promovendo assim a diminuição da fosforilação da tirosina21. O aumento da fosforilação da IRS-1 sobre resíduos de serina inibe a atividade da tirosina quinase IR e pode ser um dos principais mecanismos pelos quais o tratamento crônico do TNF-α prejudica a ação da insulina22,23. O TNF-α ativa vias envolvendo o inibidor de serina/treonina quinase do fator nuclear ĸB quinase β (IKKβ) e c-Jun N quinase terminal (JNK)24. JNK induz um complexo programa transcricional pró-inflamatório, mas também fosforila diretamente IRS-16.

A compreensão da patogênese da resistência à insulina tem se tornado cada vez mais importante para orientar o desenvolvimento de futuras terapias contra a DM2. As VPAs têm se mostrado um excelente modelo para o estudo da biologia das células adiposas, incluindo a sensibilidade e resistência à insulina, e para a identificação das propriedades intrínsecas dos adipócitos independente do ambiente sistêmico. As APCs podem ser facilmente obtidas de diferentes depósitos adiposos e, sob condições apropriadas, diferenciadas em adipócitos maduros. Com esse método, efeitos diretos sobre a resistência/sensibilidade à insulina podem ser avaliados em adipócitos.

Protocolo

Todos os experimentos com roedores foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da UNAM, protocolo número 075.

1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongos

  1. Eutanásia de camundongos C57BL/6 machos de 8-10 semanas de idade (por exemplo, por inalação de CO2 e subsequente deslocamento cervical) (quatro animais por isolamento). Desinfetar os camundongos esfregando com etanol 70% e obter o tecido adiposo imediatamente após o sacrifício.
    NOTA: Após a eutanásia dos roedores, isolar o tecido adiposo imediatamente e realizar todas as etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril. Os ratos são mantidos sob ciclos claro/escuro de 12 h com livre acesso a comida e água.
  2. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal de cada camundongo. Retirar apenas o tecido adiposo, evitando a remoção de músculo, pele ou qualquer outro tecido, e coletá-lo em um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de colagenase tipo 1 (1,5 mg/mL) sobre gelo. Dissolver a colagenase tipo 1 no meio Modified Eagle Medium (DMEM) de alta glicose e albumina de soro bovino (BSA) de Dulbecco e filtrar através de filtros de seringa de 0,2 μm.
  3. Cortar o tecido adiposo em pequenos pedaços com tesoura cirúrgica estéril e digerir as amostras por incubação com solução de colagenase tipo 1 a 37 °C em agitador orbital (150 rpm) por 30 min (colocar o tubo contendo gordura e colagenase em posição horizontal para uma maior superfície de agitação). Verifique a digestão a cada 10 min para se certificar de que funciona (a degradação do tecido é visível) e para evitar a sobredigestão (ver Figura Suplementar S1).
  4. Filtrar com uma seringa de tela de 200 μm (previamente autoclavada) para eliminar o tecido não digerido com colagenase. Passe o filtro sobre a borda do tubo para drenar o maior número possível de células para a solução. Adicionar 15 ml de DMEM-1% BSA frio para interromper a digestão e centrifugar a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C.
  5. Aspirar a camada superior contendo adipócitos maduros e a maior parte da camada líquida; Evite tocar ou perturbar o pellet. Adicionar 20 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS)-2% de soro fetal bovino (SFB) e ressuspender o pellet. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  6. Retire o sobrenadante, aspirando primeiro a camada superior para eliminar os adipócitos e gordura remanescentes. Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão lisante cloreto de amônio potássio (ACK) (para lisar hemácias) e incubar em gelo por 5 min. Adicionar 10 mL de PBS-2% FBS, misturar e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de solução anti-Fc (purificada de rato anti-camundongo CD16/CD32 diluída em PBS-2% FBS [1:150]) para reduzir a ligação mediada pelo receptor Fc por anticorpos de interesse. Incubar no gelo por 5 min. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 5 mL que se encaixe nos racks pré-resfriados de um separador magnético de células e centrífuga a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  8. Elimine o sobrenadante, adicione 200 μL da mistura de CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonal (390)-biotina (1:100) e CD45 anticorpo monoclonal (30-F11)-biotina (1:100), misture bem e incube no gelo por 15 min (prepare diluições de anticorpos em solução anti-Fc; ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
    OBS: CD31 e CD45 são marcadores de células endoteliais e hematopoiéticas, respectivamente.
  9. Aspirar o sobrenadante e incubar em 100 μL de microesferas anti-biotina (1:5) durante 15 minutos em gelo (preparar diluições de anticorpos em solução anti-Fc, ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 350 μL de PBS-2% FBS. Remova agregados celulares ou partículas grandes das suspensões unicelulares com um filtro de pré-separação (70 μm). Primeiro, ative o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS, passe a suspensão celular através do filtro (colete em um tubo limpo) e, finalmente, lave o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS.
  11. Realizar a separação magnética de células usando a estratégia de separação negativa com um separador magnético de células.
    1. Coloque a amostra na posição A do rack de frio (certifique-se de que o rack esteja pré-resfriado) e dois tubos vazios na posição B e C para recuperar as células não marcadas e marcadas, respectivamente.
    2. Coloque o tampão de lavagem e o tampão de lavagem nos frascos correspondentes antes de ligar o equipamento. Programar o equipamento para realizar a separação magnética das células com o protocolo DEPLETE .
      NOTA: Este protocolo é para depleção no modo padrão para a remoção de células com expressão normal de antígeno (neste caso, células marcadas com anti-CD31 e anti-CD45), se a recuperação for a prioridade mais alta.
    3. Na seção de separação , selecione o número de amostras a serem separadas e selecione o protocolo DEPLETE . Pressione Executar e inicie a separação. Ao final do programa, recuperar as células não marcadas e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.
  12. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura (Tabela 1).
  13. Semeando as APCs em um poço de uma placa de 12 poços previamente revestida com 2,5% de matriz de membrana basal (aproximadamente 50.000-75.000 células são obtidas). Adicionar 400 μL de 2,5% de matriz de membrana basal para cobrir toda a superfície de cada poço. Imediatamente após retirar o excesso de solução e deixar apenas uma pequena camada, deixe a placa secar (sem tampa) dentro da capela de fluxo laminar por pelo menos 1 h. Incubar a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 . Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência.
  14. A 80% de confluência, remova completamente o meio e lave com 350 μL de PBS-2% FBS. Colher as células com 350 μL de tripsina-EDTA a 0,05% por 2 min a 37 °C. Adicionar 2 mL de meio de cultura e coletar as células em um novo tubo cônico de 50 mL e, em seguida, centrifugar a 400 × g por 5 min.
  15. Passagem das APCs para placas de 12 poços (10.000-20.000 células por poço) previamente revestidas com 2,5% de matriz de membrana basal. Incubar a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência.
    NOTA: APCs podem ser passados uma vez. Posteriormente, perdem a capacidade de proliferar e se diferenciar. Consulte o fluxo de trabalho para o processo de isolamento de APCs na Figura Suplementar S2.

2. Diferenciação dos adipócitos e indução da resistência à insulina

NOTA: Manter as células a 37 °C em CO2 a 5% e realizar etapas que envolvem troca de meio e tratamentos com TNF-α e insulina dentro de uma capa estéril.

  1. A 80% de confluência, inicia-se o processo de diferenciação; aspirar qualquer meio de crescimento e substituí-lo por 500 μL de meio de diferenciação (Tabela 1) contendo 3,3 nM de proteína morfogenética óssea (BMP4) em cada poço.
  2. Após 48 h, substituir o meio pelo meio de diferenciação (500 μL por poço) e pelo coquetel de diferenciação (Tabela 1).
  3. Retirar o meio 72 h depois e adicionar 100 nM de insulina em 500 μL de meio de diferenciação fresco.
    NOTA: As células começam a mostrar uma aparência redonda com pequenas gotículas lipídicas dentro.
  4. Aspirar qualquer meio de diferenciação e substituí-lo por 500 μL de SFB médio simples a 2% (Tabela 1) 48 h mais tarde. Induzir resistência à insulina com 4 ng/mL de TNF-α. Incluir poços de controle sem tratamento com TNF-α.
  5. Após 24 h de incubação, adicionar 4 ng/mL de TNF-α em SFB simples de 0% (Tabela 1). Manter poços de controle sem tratamento com TNF-α.
  6. Ativar a via de sinalização da insulina 24 h mais tarde adicionando insulina 100 nM e incubar por 15 min a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 . Retire o meio e lave com 500 μL de PBS. Incluir poços de controle sem tratamento com insulina.

3. Avaliação da via de sinalização da insulina por western blot

  1. Extração e quantificação de proteínas
    1. Lavar cada poço de células com 500 μL de PBS e manter no gelo para lisar as células em 50 μL de tampão RIPA (Tabela 1) contendo 1% de coquetel inibidor de protease adicionado imediatamente antes do isolamento da amostra. Raspar toda a superfície do poço com uma ponta e transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL (manter no gelo).
    2. Incubar durante 1 h a 4 °C num agitador rotativo, misturar por vórtice e centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C e recuperar o sobrenadante (manter no gelo).
    3. Determinar a concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford (não diluir a amostra para quantificar).
    4. Tomar o volume necessário correspondente a 40-60 μg e desnaturar com tampão Laemmli 6x (Tabela 1) incubando a 97 °C por 15 min enquanto agita a 550 rpm. Congelar até usar.
  2. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS
    1. Realizar eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) com gel de poliacrilamida a 7,5% de 1,5 mm de espessura. Inserir o gel no tanque e encher com tampão de corrida (Tabela 1).
    2. Adicionar 3 μL de proteína padrão pré-configurada ao primeiro poço do gel e carregar cada amostra em poços subsequentes.
    3. Passe o gel a 80 V por aproximadamente 15 min para garantir que a amostra entre na matriz de gel concentrador de poliacrilamida. Depois disso, aumente a tensão para 90 V por 2,5 h ou até que o marcador de peso molecular de 37 kDa possa ser visto na borda inferior do gel.
    4. Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose em uma câmara semi-seca por 35 min a 25 V. Antes, submergir o gel, a membrana e os filtros em tampão de transferência (Tabela 1) por alguns minutos.
  3. Mancha ocidental
    1. Após a transferência, lavar a membrana com solução salina tamponada Tris (TBS) contendo Tween 20 a 0,1% (TBS-T 0,1%) (Tabela 1) por 3 min com agitação a 30 rpm.
    2. Bloquear a membrana com solução de bloqueio (Tabela 1) a 4 °C durante 1 h em rotação constante.
    3. Cortar a membrana em três partes de acordo com o marcador de peso molecular para incubar durante a noite com diferentes anticorpos primários (diluídos em solução de bloqueio) a 4 °C em rotação constante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda esperada em 180 kDa; Anticorpo do receptor fosfo-insulina β (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda esperada em 95 kDa; Anticorpo fosfo-Akt (Ser473) (1:1.000), banda esperada em 60 kDa.
    4. Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.
    5. Incubar as membranas com o anticorpo secundário acoplado à peroxidase correspondente (diluído em solução de bloqueio) durante 2 h à temperatura ambiente em rotação constante: peroxidase affiniPure burro anti-coelho IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.
    7. Detectar as proteínas usando o sistema de detecção por quimioluminescência. Prepare o substrato de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Coloque a mancha em um saco plástico e adicione 200 μL de substrato quimioluminescente para cobrir completamente a membrana. Escorra o excesso de substrato e remova as bolhas de ar.
    9. Exponha cada blot por 30-60 s em um sistema de imagem de alto desempenho compatível com quimioluminescência.
    10. Retirar as membranas (passos 10-13 da seção western blot) para quebrar as interações anticorpo-antígeno e, assim, permitir que as membranas de nitrocelulose sejam re-blotted. Recupere as membranas e lave 3x por 5 min cada com TBS-T 1% a 50 rpm.
    11. Incubar por 7 min com 10 mL de NaOH 0,2 M a 50 rpm.
    12. Lave 3x por 5 min cada com água da torneira a 50 rpm.
    13. Lave por 10 min com TBS-T 1% a 50 rpm.
    14. Repita os passos 2-9 da seção do western blot para incubar a membrana com tubulina antibeta (55 kDa) como controle de carga usando diluição 1:1.000.
    15. Realizar análise densitométrica25 para cada proteína utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

Resultados

Nos últimos anos, o aumento da prevalência de obesidade e DM2 tem motivado uma intensa busca pelos mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo. Com o protocolo aqui descrito, as VPAs podem ser diferenciadas em adipócitos maduros para avaliar a resistência e a sensibilidade à insulina. Uma vez que as VPAs atingem a confluência, são necessários 10 dias para completar sua diferenciação em adipócitos maduros e sua indução de resistência à insulina mediada pelo TNF-α (

Discussão

Este trabalho fornece um método para estudar a resistência à insulina que utiliza adipócitos primários em cultura tratada com TNF-α. Esse modelo tem a vantagem de que adipócitos primários podem ser cultivados em condições definidas por longos períodos de tempo com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares26. A duração do ensaio é de 15-20 dias, embora variações na porcentagem de adipócitos diferenciados possam ocorrer entre os experimentos. Os adipócitos primários ap...

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo pela assistência técnica e Jessica Gonzalez Norris pela edição crítica do manuscrito. Este protocolo foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer LONZA10-548E
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Growth factor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin eBioscience13-0451-85
Collagenase, Type 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM low glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Growth factor
FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
L-ascorbic acid 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Growth factor
Linoleic acid-albuminSigmaL9530
MCDB 201 mediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Growth factor
Peniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)Miltenyi130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Differentiation cocktail
BMP4R&D Systems5020-BP-010Differentiation cocktail
DexamethasoneSigmaD1756Differentiation cocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Differentiation cocktail
TNFαR&D Systems210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibodyAbcamab6046
Bromophenol blueBioRad161-0404Laemmli buffer
EDTASigmaE5134RIPA buffer
EGTASigmaE4378RIPA buffer
FluorChem E systemProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli buffer
GlycineSigmaG7126Running and Transfer buffer
IgepalSigmaI3021RIPA buffer
2- mercaptoethanolSigmaM3148Laemmli buffer
MethanolJT Baker907007Transfer buffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA buffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA buffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA buffer
Nitrocellulose membrane BioRad1620112
Nonfat dry milkBioRad1706404Blocking solution
Prestained protein standard BioRad1610395
Protease inhibitor cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β Cell signaling3024
Phospho-Akt (Ser473) AntibodyCell signaling9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibodyMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA buffer
SDSBioRad1610302Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA buffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

Referências

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  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
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  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
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