Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Özet

İnsülin direnci, insülinin hedef hücreleri üzerindeki azaltılmış bir etkisidir ve genellikle azalmış insülin reseptör sinyalizasyonundan kaynaklanır. İnsülin direnci, tip 2 diyabet (T2D) ve dünya çapında yüksek prevalansı olan diğer obezite kaynaklı hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. Bu nedenle, insülin direncinin altında yatan mekanizmaları anlamak büyük önem taşımaktadır. İnsülin direncini hem in vivo hem de in vitro olarak incelemek için çeşitli modeller kullanılmıştır; Primer adipositler, insülin direncinin mekanizmalarını incelemek ve bu duruma ve insülin duyarlılaştırıcı ilaçların moleküler hedeflerine karşı koyan molekülleri tanımlamak için çekici bir seçenektir. Burada, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanarak bir insülin direnci modeli oluşturduk.

Manyetik hücre ayırma teknolojisi ile kollajenaz ile sindirilmiş fare deri altı yağ dokusundan izole edilen adiposit öncü hücreleri (APC'ler), primer adipositlere ayrılır. İnsülin direnci daha sonra insülin sinyal kaskadı üyelerinin tirozin fosforilasyonunu / aktivasyonunu azaltan proinflamatuar bir sitokin olan TNF-α ile tedavi ile indüklenir. İnsülin reseptörünün (IR), insülin reseptör substratının (IRS-1) ve protein kinaz B'nin (AKT) azalmış fosforilasyonu, batı lekesi ile ölçülür. Bu yöntem, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için mükemmel bir araç sağlar.

Giriş

İnsülin, pankreas adacığı β hücreleri tarafından üretilen anabolik bir hormondur ve glikoz ve lipit metabolizmasının anahtar düzenleyicisidir. Birçok işlevi arasında, insülin glikoz alımını, glikojen sentezini, glukoneogenezi, protein sentezini, lipogenezi ve lipoliz1'i düzenler. Reseptörü (IR) ile insülin etkileşiminden sonraki ilk moleküler sinyal, IR2'nin intrinsik tirozin protein kinaz aktivitesinin aktivasyonudur, bu da otofosforilasyon3 ile sonuçlanır ve daha sonra adaptör proteinlerine bağlanan insülin reseptör substratları (IRS) olarak bilinen bir protein ailesinin aktivasyonudur. protein kinazları4 . İnsülin iki ana sinyal yolunu aktive eder: fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K)-protein kinaz B (AKT) ve Ras-mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz (MAPK). Birincisi, yakıt homeostazının düzenlenmesi de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik fonksiyonlarda yer alan çok sayıda aşağı akış efektörünün aktivasyonu için ana bir dal noktası veya düğüm 4,5 oluştururken, ikincisi hücre büyümesini ve farklılaşmasını düzenler 4,6. İnsülin eylemleri sonuçta hücre tipine ve fizyolojik bağlama bağlıdır7.

İnsüline duyarlı ana metabolik dokulardan biri yağ dokusudur. Beyaz yağ dokusu, insanlarda ve kemirgenlerde, deri altı yağ (cilt ve kaslar arasında) ve viseral yağ (karın boşluğundaki organların etrafında) içinde dağılmış en bol yağ türüdür. Büyük hacimleri göz önüne alındığında, adipositler veya yağ hücreleri yağ dokusunda en bol bulunan hücre tipidir. Bu yağ hücreleri kahverengi/bej (termojenik), pembe (meme bezinde) ve beyaz 8,9 olabilir. Beyaz adipositler vücuttaki ana enerji rezervlerini insüline bağımlı bir süreç olan trigliseritler şeklinde tutar. İnsülin glikoz taşınımını ve lipogenezi teşvik ederken, lipoliz veya lipit parçalanmasını inhibe eder 7,10. Aynı zamanda preadipositlerin adipositlere farklılaşmasını kolaylaştırır - olgun yağ depolayan hücreler11.

İnsülin direnci, normal bir insülin seviyesi zayıflatılmış bir biyolojik yanıt ürettiğinde ortaya çıkar ve telafi edici hiperinsülinemi12 ile sonuçlanır. İnsülin direnci, aşırı kilolu ve obezite5 ile ilişkili bir durumdur, kombine edildiğinde tip 2 diyabet (T2D) ve diğer metabolik hastalıklara yol açar13. Hiperinsülinemi, normal kan şekeri seviyelerini korumak için periferik dokulardaki insülin direncini telafi eder14. Bununla birlikte, nihai β hücre kaybı veya tükenmesi, şiddetlenmiş insülin direnci ile birlikte, T2D5 ile tutarlı yüksek kan şekeri seviyelerine yol açar. Bu nedenle, insülin direnci ve hiperinsülinemi obezite kaynaklı metabolik hastalıkların gelişimine katkıda bulunabilir15. Ayrıca, obezite yağ dokusunda insülin direncini artıran kronik düşük dereceli lokal inflamasyona neden olabilir15,16,17. Ek olarak, yağ dokusunda fibroz, inflamasyon ve azalmış anjiyogenez ve adipogenez gibi obezite kaynaklı değişiklikler, adiponektin serum seviyelerinin (bir insülin duyarlılaştırıcı) düşmesine ve plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1), serbest yağ asitleri ve eksozomlar gibi faktörlerin kan dolaşımına salgılanmasının artmasına neden olarak insülin direncini şiddetlendirir17.

İnsülin direncinin altında yatan birçok yön bilinmemektedir. İn vitro ve in vivo modeller, yağ dokusu da dahil olmak üzere ana hedef dokularda insülin direncine aracılık eden mekanizmaları incelemek için geliştirilmiştir. İn vitro modellerin avantajı, araştırmacıların çevresel koşullar üzerinde daha fazla kontrole sahip olmaları ve spesifik hücre tiplerinde insülin direncini değerlendirebilmeleridir. Özellikle, adiposit öncü hücreleri (APC'ler), fizyolojiyi adiposit hücre hatlarından daha iyi yansıtabilecek donör dokunun bireysel fenotipine sahiptir. İn vitro insülin direncini indükleyen ana faktör tümör nekroz faktörü-α'dir (TNF-α). TNF-α, adipoz doku18'de adipositler ve makrofajlar tarafından salgılanan proinflamatuar bir sitokindir. Uygun yağ dokusu yeniden şekillenmesi ve genişlemesi için gerekli olsa da19, TNF-α'ye uzun süreli maruz kalma, in vivo yağ dokusunda ve in vitro20 adipositlerde insülin direncini indükler. Çeşitli hücre tiplerinin kronik TNF-α tedavisi, hem IR hem de IRS-1'in serin fosforilasyonunun artmasına neden olur, böylece azalmış tirozin fosforilasyonunu teşvik eder21. IRS-1'in serin kalıntıları üzerindeki fosforilasyonunun artması, IR tirozin kinaz aktivitesini inhibe eder ve kronik TNF-α tedavisinin insülin etkisini bozduğu anahtar mekanizmalardan biri olabilir22,23. TNF-α, nükleer faktör ĸB kinaz β (IKKβ) ve c-Jun N terminal kinazın (JNK)24'ün serin/treonin kinaz inhibitörünü içeren yolları aktive eder. JNK, karmaşık bir proinflamatuar transkripsiyonel programı indükler, ancak aynı zamanda IRS-16'yı doğrudan fosforile eder.

İnsülin direncinin patogenezini anlamak, T2D'ye karşı gelecekteki tedavilerin geliştirilmesine rehberlik etmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. APC'lerin, insüline duyarlılık ve direnç de dahil olmak üzere yağ hücresi biyolojisinin incelenmesi ve sistemik ortamdan bağımsız olarak adipositlerin içsel özelliklerinin tanımlanması için mükemmel bir model olduğu kanıtlanmıştır. APC'ler farklı yağ depolarından kolayca elde edilebilir ve uygun koşullar altında olgun adipositlere ayrılabilir. Bu yöntemle adipositlerde insülin direnci/duyarlılığı üzerine doğrudan etkiler değerlendirilebilir.

Protokol

Tüm kemirgen deneyleri, UNAM Nörobiyoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi, protokol numarası 075 tarafından onaylanmıştır.

1. Fare adiposit öncü hücrelerinin izolasyonu

  1. 8-10 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri ötenazi yapın (örneğin, CO2 inhalasyonu ve müteakip servikal çıkık ile) (izolasyon başına dört hayvan). Fareleri %70 etanol ile ovalayarak dezenfekte edin ve kurbandan hemen sonra yağ dokusunu elde edin.
    NOT: Kemirgenlerin ötenazisinden sonra, yağ dokusunu derhal izole edin ve steril laminer akış başlığı içindeki tüm adımları gerçekleştirin. Fareler, yiyecek ve suya serbest erişim ile 12 saat açık / karanlık döngüleri altında tutulur.
  2. Kasık altı yağ dokusunu her fareden diseke edin. Kas, cilt veya başka herhangi bir dokunun çıkarılmasından kaçınarak sadece yağ dokusunu çıkarın ve buz üzerinde 15 mL tip 1 kollajenaz çözeltisi (1.5 mg / mL) içeren 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Tip 1 kollajenazı Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) yüksek glikoz-%1 sığır serum albümininde (BSA) çözün ve 0,2 μm şırınga filtrelerinden geçirin.
  3. Yağ dokusunu steril cerrahi makasla küçük parçalara ayırın ve numuneleri 30 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda (150 rpm) 37 ° C'de tip 1 kollajenaz çözeltisi ile inkübe ederek sindirin (daha büyük bir sallama yüzeyi için yağ ve kollajenaz içeren tüpü yatay konuma getirin). Çalıştığından emin olmak (doku bozulması görülebilir) ve aşırı sindirimi önlemek için sindirimi her 10 dakikada bir kontrol edin (Ek Şekil S1'e bakınız).
  4. Kollajenaz ile sindirilmeyen dokuyu ortadan kaldırmak için 200 μm'lik bir ağ şırıngası (daha önce otoklavlanmış) kullanarak filtreleyin. Çözeltiye mümkün olduğunca çok hücre boşaltmak için filtreyi tüpün kenarından geçirin. Sindirimi durdurmak için 15 mL soğuk DMEM-1% BSA ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.
  5. Olgun adipositleri ve sıvı tabakanın çoğunu içeren üst tabakayı aspire edin; Peletlere dokunmaktan veya rahatsız etmekten kaçının. 20 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS)-% 2 fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve peletleri yeniden askıya alın. 400 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj.
  6. Süpernatanı çıkarın, kalan adipositleri ve yağları ortadan kaldırmak için önce üst tabakayı aspire edin. Peletleri 1 mL amonyum klorür potasyum (ACK) lizing tamponunda (kırmızı kan hücrelerini lize etmek için) tekrar askıya alın ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 10 mL PBS-%2 FBS ekleyin, karıştırın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.
  7. Süpernatantı aspire edin ve ilgili antikorlar tarafından Fc reseptörü aracılı bağlanmayı azaltmak için peleti 200 μL anti-Fc çözeltisinde (PBS-% 2 FBS [1:150] içinde seyreltilmiş saflaştırılmış sıçan anti-fare CD16 / CD32) içinde yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hücre süspansiyonunu, manyetik hücre ayırıcısının önceden soğutulmuş raflarına uyan 5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj.
  8. Süpernatanı ortadan kaldırın, CD31 (PECAM-1) monoklonal antikor (390)-biyotin (1:100) ve CD45 monoklonal antikor (30-F11)-biyotin (1:100) karışımından 200 μL ekleyin, iyice karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin (anti-Fc çözeltisinde antikor seyreltmeleri hazırlayın; bakınız Tablo 1). 400 μL PBS-2% FBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.
    NOT: CD31 ve CD45 sırasıyla endotel hücrelerinin ve hematopoetik hücrelerin belirteçleridir.
  9. Süpernatantı aspire edin ve buz üzerinde 15 dakika boyunca 100 μL anti-biyotin mikroboncuk (1:5) içinde inkübe edin (anti-Fc çözeltisinde antikor seyreltmeleri hazırlayın, bakınız Tablo 1). 400 μL PBS-2% FBS ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.
  10. Süpernatantı atın ve pelet 350 μL PBS-2% FBS'de yeniden askıya alın. Hücre agregalarını veya büyük parçacıkları tek hücreli süspansiyonlardan bir ön ayırma filtresi (70 μm) ile çıkarın. İlk olarak, filtreyi 100 μL PBS-2% FBS ile etkinleştirin, hücre süspansiyonunu filtreden geçirin (temiz bir tüpte toplayın) ve son olarak filtreyi 100 μL PBS-2% FBS ile yıkayın.
  11. Manyetik hücre ayırıcı ile negatif ayırma stratejisini kullanarak hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirin.
    1. Etiketlenmemiş ve etiketlenmiş hücreleri geri kazanmak için numuneyi soğutma rafının A konumuna (rafın önceden soğutulduğundan emin olun) ve B ve C konumuna iki boş tüp yerleştirin.
    2. Ekipmanı açmadan önce yıkama tamponunu ve çalışma tamponunu ilgili şişelere yükleyin. DEPLETE protokolü ile hücrelerin manyetik ayrımını gerçekleştirmek için ekipmanı programlayın.
      NOT: Bu protokol, iyileşme en yüksek öncelikse, normal antijen ekspresyonuna sahip hücrelerin (bu durumda, anti-CD31 ve anti-CD45 ile etiketlenmiş hücreler) çıkarılması için standart modda tükenme içindir.
    3. Ayırma bölümünde, ayrılacak örnek sayısını seçin ve DEPLETE protokolünü seçin. Çalıştır'a basın ve ayırmayı başlatın. Programın sonunda, etiketlenmemiş hücreleri geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin.
  12. Süpernatantı çıkarın ve peleti 500 μL büyüme ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).
  13. APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna tohumlayın (yaklaşık 50.000-75.000 hücre elde edilir). Her bir kuyucuğun tüm yüzeyini kaplamak için 400 μL% 2,5 bazal membran matrisi ekleyin. Fazla çözeltiyi çıkardıktan ve sadece küçük bir tabaka bıraktıktan hemen sonra, plakanın laminer akış davlumbazının içinde en az 1 saat kurumasını (kapaksız) bırakın. 37 °C'de %5 CO2 atmosferinde inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
  14. % 80 birleşimde, ortamı tamamen çıkarın ve 350 μL PBS-2% FBS ile yıkayın. Hücreleri 350 μL% 0.05 tripsin-EDTA ile 37 ° C'de 2 dakika boyunca toplayın. 2 mL büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri yeni bir 50 mL konik tüpte toplayın, ardından 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj yapın.
  15. APC'leri daha önce %2,5 bazal membran matrisi ile kaplanmış 12 delikli plakalara (kuyu başına 10.000-20.000 hücre) geçirin. 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin. Hücreler% 80 birleşime ulaşana kadar ortamı her 48 saatte bir değiştirin.
    NOT: APC'ler bir kez geçirilebilir. Daha sonra, çoğalma ve farklılaşma yeteneklerini kaybederler. Ek Şekil S2'deki APC'lerin yalıtım işlemine ilişkin iş akışına bakın.

2. Adiposit farklılaşması ve insülin direncinin indüklenmesi

NOT: Hücreleri% 5 CO2'de 37 ° C'de tutun ve steril bir başlık içinde TNF-α ve insülin ile ortam değişikliği ve tedavileri içeren adımları uygulayın.

  1. % 80 birleşimde, farklılaşma sürecine başlayın; Herhangi bir büyüme ortamını aspire edin ve her bir kuyucukta 3.3 nM kemik morfogenetik protein (BMP4) içeren 500 μL farklılaşma ortamı (Tablo 1) ile değiştirin.
  2. 48 saat sonra, ortamı diferansiyasyon ortamı (kuyucuk başına 500 μL) ve farklılaştırma kokteyli (Tablo 1) ile değiştirin.
  3. Ortamı 72 saat sonra çıkarın ve 500 μL taze farklılaşma ortamına 100 nM insülin ekleyin.
    NOT: Hücreler, içinde küçük lipit damlacıkları bulunan yuvarlak bir görünüm göstermeye başlar.
  4. Herhangi bir farklılaşma ortamını aspire edin ve 48 saat sonra 500 μL basit orta-% 2 FBS (Tablo 1) ile değiştirin. 4 ng/mL TNF-α ile insülin direncini indükler. TNF-α tedavisi olmayan kontrol kuyularını dahil edin.
  5. 24 saatlik inkübasyondan sonra, basit orta-% 0 FBS'ye 4 ng / mL TNF-α ekleyin (Tablo 1). TNF-α tedavisi olmadan kontrol kuyularını koruyun.
  6. İnsülin sinyal yolunu 24 saat sonra 100 nM insülin ekleyerek aktive edin ve% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 500 μL PBS ile yıkayın. İnsülin tedavisi olmadan kontrol kuyularını dahil edin.

3. İnsülin sinyal yolunun western blot ile değerlendirilmesi

  1. Protein ekstraksiyonu ve miktarının belirlenmesi
    1. Her bir hücre kuyucuğunu 500 μL PBS ile yıkayın ve numune izolasyonundan hemen önce eklenen% 1 proteaz inhibitörü kokteyli içeren 50 μL RIPA tamponunda (Tablo 1) hücreleri lize etmek için buz üzerinde tutun. Kuyunun tüm yüzeyini bir uçla kazıyın ve lizatı 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın (buzda tutun).
    2. Dönen bir çalkalayıcıda 4 ° C'de 1 saat inkübe edin, vorteks ile karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca 8.000 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı geri kazanın (buzda tutun).
    3. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (ölçmek için numuneyi seyreltmeyin).
    4. 40-60 μg'ye karşılık gelen gerekli hacmi alın ve 550 rpm'de çalkalarken 15 dakika boyunca 97 ° C'de inkübe ederek 6x Laemmli tamponu (Tablo 1) ile denatüre edin. Kullanana kadar dondurun.
  2. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi
    1. SDS-poliakrilamid jel elektroforezini (SDS-PAGE) 1,5 mm kalınlığında% 7,5 poliakrilamid jel ile gerçekleştirin. Jeli tankın içine yerleştirin ve çalışan tamponla doldurun (Tablo 1).
    2. Jelin ilk kuyucuğuna 3 μL önceden boyanmış protein standardı ekleyin ve her bir numuneyi sonraki kuyucuklara yükleyin.
    3. Numunenin poliakrilamid konsantratör jel matrisine girdiğinden emin olmak için jeli yaklaşık 15 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırın. Bundan sonra, voltajı 2,5 saat boyunca 90 V'a veya jelin alt kenarında 37 kDa moleküler ağırlık işaretleyicisi görülene kadar artırın.
    4. Proteinleri jelden yarı kuru bir odada bir nitroselüloz membranına 25 V'ta 35 dakika boyunca aktarın. önceden, jeli, zarı ve filtreleri birkaç dakika boyunca transfer tamponuna (Tablo 1) batırın.
  3. Batı lekesi
    1. Transferden sonra, membranı% 0.1 Tween 20 (TBS-T% 0.1) (Tablo 1) içeren Tris tamponlu salin (TBS) ile 30 rpm'de çalkalayarak 3 dakika boyunca yıkayın.
    2. Membranı bloke edici çözelti ile bloke edin (Tablo 1) 4 °C'de 1 saat boyunca sabit rotasyonda.
    3. Sabit rotasyonda 4 °C'de farklı birincil antikorlarla (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş) gece boyunca inkübe etmek için membranı moleküler ağırlık belirtecine göre üç parçaya bölün: Fosfo-IRS1 (Tyr608) antikoru (1:1.000), 180 kDa'da beklenen bant; Fosfo-İnsülin reseptörü β (Tyr1150/1151) antikoru (1:1.000), 95 kDa'da beklenen bant; Fosfo-Akt (Ser473) antikoru (1:1.000), 60 kDa'da beklenen bant.
    4. Membranları her biri 5 dakika boyunca 5x TBS-T% 0.1 ile yıkayın.
    5. Membranları, karşılık gelen peroksidaz kuplajlı ikincil antikor (bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş) ile oda sıcaklığında sabit rotasyonda 2 saat boyunca inkübe edin: peroksidaz affiniSaf eşek anti-tavşan IgG (H + L) (1:5.000).
    6. Membranları her biri 5 dakika boyunca 5x TBS-T% 0.1 ile yıkayın.
    7. Kemilüminesans algılama sistemini kullanarak proteinleri tespit edin. Substratı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.
    8. Lekeyi plastik bir torbaya yerleştirin ve membranı tamamen örtmek için 200 μL kemilüminesan substrat ekleyin. Fazla substratı boşaltın ve hava kabarcıklarını çıkarın.
    9. Kemilüminesans ile uyumlu yüksek performanslı bir görüntüleme sisteminde her bir lekeyi 30-60 s boyunca maruz bırakın.
    10. Antikor-antijen etkileşimlerini kırmak için membranları (batı leke bölümünün 10-13. adımları) sıyırın ve böylece nitroselüloz membranların yeniden lekelenmesine izin verin. Membranları geri kazanın ve 50 rpm'de TBS-T% 1 TBS-T ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    11. 50 rpm'de 10 mL 0,2 M NaOH ile 7 dakika inkübe edin.
    12. Her biri 50 rpm'de musluk suyuyla 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
    13. 50 rpm'de %1 TBS-T ile 10 dakika yıkayın.
    14. 1:1.000 seyreltme kullanarak membranı bir yükleme kontrolü olarak anti-beta tübülin (55 kDa) ile inkübe etmek için batı leke bölümünün 2-9 arasındaki adımlarını tekrarlayın.
    15. ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/) kullanarak her protein için25 densitometrik analiz gerçekleştirin.

Sonuçlar

Son birkaç yılda, obezite ve T2D prevalansının artması, yağ dokusunda insülin direncine aracılık eden mekanizmalar için yoğun bir araştırmaya yol açmıştır. Burada açıklanan protokolle, APC'ler insülin direncini ve duyarlılığını değerlendirmek için olgun adipositlere ayrılabilir. APC'ler birleşime ulaştıklarında, olgun adipositlere farklılaşmalarını ve TNF-α aracılı insülin direnci indüksiyonlarını tamamlamak 10 gün sürer (Şekil 1).

Tartışmalar

Bu yazıda, TNF-α ile tedavi edilen kültürde primer adipositleri kullanan insülin direncini incelemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu model, birincil adipositlerin, hücresel çevresel faktörlerin sıkı bir kontrolü ile tanımlanmış koşullar altında uzun süre kültürlenebilmesi avantajına sahiptir26. Tahlil süresi 15-20 gündür, ancak deneyler arasında farklılaşmış adipositlerin yüzdesinde değişiklikler meydana gelebilir. Primer adipositler, kültürde sürekli olarak ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla ve María Antonieta Carbajo'ya teknik yardımları için ve Jessica Gonzalez Norris'e makaleyi eleştirel bir şekilde düzenledikleri için teşekkür ederiz. Bu protokol Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer LONZA10-548E
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Growth factor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin eBioscience13-0451-85
Collagenase, Type 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM low glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Growth factor
FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
L-ascorbic acid 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Growth factor
Linoleic acid-albuminSigmaL9530
MCDB 201 mediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Growth factor
Peniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)Miltenyi130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Differentiation cocktail
BMP4R&D Systems5020-BP-010Differentiation cocktail
DexamethasoneSigmaD1756Differentiation cocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Differentiation cocktail
TNFαR&D Systems210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibodyAbcamab6046
Bromophenol blueBioRad161-0404Laemmli buffer
EDTASigmaE5134RIPA buffer
EGTASigmaE4378RIPA buffer
FluorChem E systemProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli buffer
GlycineSigmaG7126Running and Transfer buffer
IgepalSigmaI3021RIPA buffer
2- mercaptoethanolSigmaM3148Laemmli buffer
MethanolJT Baker907007Transfer buffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA buffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA buffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA buffer
Nitrocellulose membrane BioRad1620112
Nonfat dry milkBioRad1706404Blocking solution
Prestained protein standard BioRad1610395
Protease inhibitor cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β Cell signaling3024
Phospho-Akt (Ser473) AntibodyCell signaling9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibodyMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA buffer
SDSBioRad1610302Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA buffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

Referanslar

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 192preadiposit izolasyonuderi alt yains lin etkisiTNF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır