Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

Abstract

תנגודת לאינסולין היא השפעה מופחתת של אינסולין על תאי המטרה שלו, שמקורה בדרך כלל בירידה באיתות קולטני האינסולין. תנגודת לאינסולין תורמת להתפתחות סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות אחרות הנובעות מהשמנת יתר בשכיחות גבוהה ברחבי העולם. לכן, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין היא רלוונטית מאוד. מספר מודלים שימשו לחקר עמידות לאינסולין הן in vivo והן in vitro; אדיפוציטים ראשוניים מייצגים אפשרות אטרקטיבית לחקור את מנגנוני התנגודת לאינסולין ולזהות מולקולות המנטרלות מצב זה ואת המטרות המולקולריות של תרופות רגישות לאינסולין. כאן, ביססנו מודל עמידות לאינסולין באמצעות אדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלים בגורם נמק גידולי α (TNF-α).

תאים מבשרי אדיפוציט (APCs), שבודדו מרקמת שומן תת-עורית של עכבר המעוכל בקולגנאז על ידי טכנולוגיית הפרדת תאים מגנטית, מתמיינים לאדיפוציטים ראשוניים. לאחר מכן נגרמת תנגודת לאינסולין על ידי טיפול ב-TNF-α, ציטוקין מעודד דלקת המפחית את הזרחון/הפעלה של טירוזין של חברי מפל איתות האינסולין. ירידה בזרחון של קולטן אינסולין (IR), מצע קולטן אינסולין (IRS-1) וחלבון קינאז B (AKT) מכומתים על ידי כתם מערבי. שיטה זו מספקת כלי מצוין לחקר המנגנונים המתווכים תנגודת לאינסולין ברקמת השומן.

Introduction

אינסולין הוא הורמון אנבולי המיוצר על ידי תאי β של איון הלבלב והרגולטור העיקרי של מטבוליזם של גלוקוז ושומנים. בין תפקידיו הרבים, אינסולין מווסת את ספיגת הגלוקוז, סינתזת גליקוגן, גלוקונאוגנזה, סינתזת חלבונים, ליפוגנזיסוליפוליזה 1. האות המולקולרי הראשוני לאחר אינטראקציה של אינסולין עם הקולטן שלו (IR) הוא הפעלת הפעילות הפנימית של חלבון טירוזין קינאז של IR2, וכתוצאה מכך אוטופוספורילציה3 שלו והפעלה לאחר מכן של משפחה של חלבונים הידועים בשם מצעי קולטן אינסולין (IRS), אשר נקשר חלבונים מתאמים המוביל להפעלת מפל של קינאזות חלבון4 . אינסולין מפעיל שני מסלולי איתות עיקריים: פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)-חלבון קינאז B (AKT) וחלבון קינאז המופעל על ידי ראס-מיטוגן (MAPK). הראשון מהווה נקודת הסתעפות או צומת4,5 עיקריים להפעלת גורמים רבים במורד הזרם המעורבים בתפקודים פיזיולוגיים מגוונים, כולל ויסות הומאוסטזיס דלק, ואילו האחרון מווסת את גדילת התאים והתמיינותם 4,6. פעולות אינסולין תלויות בסופו של דבר בסוג התא ובהקשר הפיזיולוגי7.

אחת הרקמות המטבוליות העיקריות המגיבות לאינסולין היא רקמת השומן. רקמת השומן הלבן היא סוג השומן הנפוץ ביותר בבני אדם ובמכרסמים, המופץ בתוך שומן תת עורי (בין העור לשרירים) ושומן ויסצרלי (סביב האיברים בחלל הבטן). בהתחשב בנפח הגדול שלהם, אדיפוציטים או תאי שומן הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמת השומן. תאי שומן אלה יכולים להיות חומים/בז' (תרמוגניים), ורודים (בבלוטת החלב) ולבנים 8,9. אדיפוציטים לבנים שומרים על עתודות האנרגיה העיקריות בגוף בצורה של טריגליצרידים, תהליך תלוי אינסולין. אינסולין מקדם הובלת גלוקוז וליפוגנזיס, בעוד שהוא מעכב ליפוליזה או פירוק שומנים 7,10. זה גם מקל על התמיינות של preadipocytes לתוך אדיפוציטים - תאים בוגרים אוגרים שומן11.

תנגודת לאינסולין מתרחשת כאשר רמת אינסולין נורמלית מייצרת תגובה ביולוגית מוחלשת, וכתוצאה מכך היפראינסולינמיה מפצה12. עמידות לאינסולין היא מצב הקשור לעודף משקל והשמנת יתר5, שבשילוב מוביל לסוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות מטבוליות אחרות13. היפראינסולינמיה מפצה תנגודת לאינסולין ברקמות היקפיות כדי לשמור על רמות גלוקוז תקינותבדם 14. עם זאת, אובדן או תשישות של תאי β בסופו של דבר, יחד עם עמידות מחמירה לאינסולין, מובילים לרמות גלוקוז גבוהות בדם התואמות לסוכרת סוג2 5. לכן, עמידות לאינסולין והיפראינסולינמיה יכולות לתרום להתפתחות מחלות מטבוליות הנגזרות מהשמנת יתר15. יתר על כן, השמנת יתר עלולה לגרום לדלקת מקומית כרונית בדרגה נמוכה המקדמת עמידות לאינסולין ברקמת השומן15,16,17. בנוסף, שינויים שמקורם בהשמנת יתר ברקמת השומן, כגון פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה מופחתת ואדיפוגנזה, מובילים לרמות נמוכות יותר בסרום האדיפונקטין (רגיש לאינסולין) ולהפרשת גורמים כגון מעכב מפעיל פלסמינוגן 1 (PAI-1), חומצות שומן חופשיות ואקסוזומים לזרם הדם, המחריפים את התנגודת לאינסולין17.

היבטים רבים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין עדיין אינם ידועים. מודלים In vitro ו-in vivo פותחו כדי לחקור את המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמות מטרה עיקריות, כולל רקמת שומן. היתרון של מודלים במבחנה הוא שלחוקרים יש שליטה רבה יותר על תנאי הסביבה והם יכולים להעריך עמידות לאינסולין בסוגי תאים ספציפיים. בפרט, לתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) יש את הפנוטיפ האינדיבידואלי של הרקמה התורמת, אשר עשוי לשקף פיזיולוגיה טוב יותר מאשר קווי תאי אדיפוציט. גורם עיקרי הגורם לתנגודת לאינסולין במבחנה הוא גורם נמק גידולי α (TNF-α). TNF-α הוא ציטוקין מעודד דלקת המופרש על ידי אדיפוציטים ומקרופאגים ברקמת השומן18. בעוד שהוא נדרש לשיפוץ והרחבה תקינים של רקמת השומן19, חשיפה ארוכת טווח ל-TNF-α גורמת לתנגודת לאינסולין ברקמת השומן in vivo ובאדיפוציטים במבחנה20. טיפול כרוני ב-TNF-α במספר סוגי תאים מוביל לזרחן סרין מוגבר הן של IR והן של IRS-1, ובכך מקדם ירידה בזרחון טירוזין21. זרחן מוגבר של IRS-1 על שאריות סרין מעכב את פעילות IR טירוזין קינאז ועשוי להיות אחד המנגנונים העיקריים שבאמצעותם טיפול כרוני ב- TNF-α פוגע בפעולת האינסולין22,23. TNF-α מפעיל מסלולים המערבים מעכב סרין/תראונין קינאז של גורם גרעיני ĸB קינאז β (IKKβ) ו-c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK משרה תוכנית שעתוק פרו-דלקתית מורכבת אך גם זרחן ישיר IRS-16.

הבנת הפתוגנזה של תנגודת לאינסולין הפכה חשובה יותר ויותר כדי להנחות את הפיתוח של טיפולים עתידיים נגד סוכרת סוג 2. נגמ"שים הוכיחו את עצמם כמודל מצוין לחקר הביולוגיה של תאי השומן, כולל הרגישות והעמידות לאינסולין, ולזיהוי התכונות הפנימיות של אדיפוציטים ללא תלות בסביבה המערכתית. נגמ"שים ניתן להשיג בקלות ממחסני שומן שונים, ובתנאים המתאימים, להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. בשיטה זו ניתן להעריך השפעות ישירות על התנגודות/רגישות לאינסולין באדיפוציטים.

Protocol

כל ניסויי המכרסמים אושרו על ידי הוועדה לביואתיקה של המכון לנוירוביולוגיה של UNAM, פרוטוקול מספר 075.

1. בידוד של תאים מבשרי אדיפוציט עכבר

  1. הרדימו עכברי C57BL/6 זכרים בני 8-10 שבועות (למשל, על ידי שאיפתCO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן) (ארבעה בעלי חיים בכל בידוד). לחטא את העכברים על ידי שפשוף עם 70% אתנול ולקבל את רקמת השומן מיד לאחר ההקרבה.
    הערה: לאחר המתת חסד של מכרסמים, בודד את רקמת השומן מיד ובצע את כל השלבים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית. עכברים מוחזקים תחת מחזורי אור/חושך של 12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.
  2. נתחו את רקמת השומן התת עורית המפשעתית מכל עכבר. הסר רק את רקמת השומן, הימנע מהסרת שריר, עור או כל רקמה אחרת, ואסוף אותה בצינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של תמיסת קולגנאז מסוג 1 (1.5 מ"ג / מ"ל) על קרח. יש להמיס קולגנאז מסוג 1 באלבומין בסרום בקר (BSA) בעל גלוקוז גבוה-1% בסרום בקר (BSA) של Dulbecco ולסנן דרך מסנני מזרקים בגודל 0.2 מיקרומטר.
  3. חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות עם מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים את הדגימות על ידי דגירה עם תמיסת collagenase מסוג 1 ב 37 ° C בשייקר אורביטלי (150 סל"ד) במשך 30 דקות (מניחים את הצינור המכיל שומן ו collagenase במצב אופקי עבור משטח רעד גדול יותר). בדקו את העיכול כל 10 דקות כדי לוודא שהוא פועל (נראה לעין פירוק רקמות) וכדי למנוע עיכול יתר (ראו איור משלים S1).
  4. סנן באמצעות מזרק רשת 200 מיקרומטר (בעבר autoclaved) כדי לחסל רקמות לא מעוכל עם collagenase. העבירו את המסנן מעבר לקצה הצינור כדי לנקז כמה שיותר תאים לתמיסה. הוסף 15 מ"ל של DMEM-1% BSA קר כדי לעצור את העיכול וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  5. לשאוף את השכבה העליונה המכילה אדיפוציטים בוגרים ואת רוב השכבה הנוזלית; הימנע מלגעת או להפריע לכדור. הוסף 20 מ"ל של סרום מלח חוצץ פוספט קר (PBS)-2% סרום בקר עוברי (FBS) והשהה מחדש את הכדורית. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  6. הסר את supernatant, שואף תחילה את השכבה העליונה כדי לחסל את האדיפוציטים והשומן הנותרים. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של אשלגן אמוניום כלורי (ACK) (לליז תאי דם אדומים) ולדגור על קרח למשך 5 דקות. הוסף 10 מ"ל של PBS-2% FBS, ערבוב וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של תמיסת אנטי-Fc (חולדה מטוהרת נגד עכבר CD16/CD32 מדוללת ב-PBS-2% FBS [1:150]) כדי להפחית את הקשירה בתיווך קולטן Fc על ידי נוגדנים בעלי עניין. דוגרים על קרח במשך 5 דקות. העבר את מתלה התא לצינור 5 מ"ל שמתאים למתלים המצוננים מראש של מפריד תאים מגנטי וצנטריפוגה ב 400 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
  8. לסלק את supernatant, להוסיף 200 μL של תערובת של CD31 (PECAM-1) נוגדן חד שבטי (390)-ביוטין (1:100) ונוגדן חד שבטי CD45 (30-F11)-ביוטין (1:100), לערבב היטב, לדגור על קרח במשך 15 דקות (להכין דילול נוגדנים בתמיסת אנטי Fc; ראה טבלה 1). הוסף 400 μL של PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: CD31 ו- CD45 הם סמנים של תאי אנדותל ותאים המטופויטיים, בהתאמה.
  9. שאפו את הסופרנאטנט ודגרו ב-100 מיקרו-ליטר מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין (1:5) במשך 15 דקות על קרח (הכינו דילול נוגדנים בתמיסת אנטי-Fc, ראו טבלה 1). הוסף 400 μL של PBS-2% FBS וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  10. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של PBS-2% FBS. הסר צברי תאים או חלקיקים גדולים מהמתלים של תא בודד באמצעות מסנן קדם-הפרדה (70 מיקרומטר). ראשית, הפעל את המסנן עם 100 μL של PBS-2% FBS, להעביר את השעיית התא דרך המסנן (לאסוף בצינור נקי), ולבסוף לשטוף את המסנן עם 100 μL של PBS-2% FBS.
  11. בצע הפרדה מגנטית של תאים באמצעות אסטרטגיית הפרדה שלילית עם מפריד תאים מגנטי.
    1. הניחו את הדגימה במיקום A של מדף הקירור (ודאו שהמדף מקורר מראש) ובשתי שפופרות ריקות במיקום B ו-C כדי לשחזר את התאים שאינם מסומנים ומסומנים, בהתאמה.
    2. טען את מאגר הכביסה ואת מאגר ההפעלה לבקבוקים המתאימים לפני הפעלת הציוד. תכנת את הציוד לביצוע ההפרדה המגנטית של תאים באמצעות פרוטוקול DEPLETE .
      הערה: פרוטוקול זה מיועד לדלדול במצב רגיל להסרת תאים עם ביטוי אנטיגן רגיל (במקרה זה, תאים המסומנים עם anti-CD31 ו- anti-CD45), אם ההתאוששות היא בעדיפות הגבוהה ביותר.
    3. במקטע ההפרדה , בחר את מספר הדגימות שיש להפריד ובחר בפרוטוקול DEPLETE . לחצו על 'הפעל' והתחילו את ההפרדה. בסוף התוכנית, לשחזר את התאים unlabeled צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  12. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב- 500 מיקרוליטר של מדיום צמיחה (טבלה 1).
  13. זרעו את הנגמ"שים בבאר אחת מתוך צלחת בת 12 בארות שצופתה בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5% (מתקבלים כ-50,000-75,000 תאים). הוסף 400 μL של 2.5% מטריצת קרום מרתף כדי לכסות את כל פני השטח של כל באר. מיד לאחר הסרת התמיסה העודפת והשארת שכבה קטנה בלבד, הניחו לצלחת להתייבש (ללא מכסה) בתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית למשך שעה אחת לפחות. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 . שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
  14. במפגש של 80%, יש להסיר את המדיום לחלוטין ולשטוף עם 350 μL של PBS-2% FBS. קצור את התאים עם 350 μL של 0.05% trypsin-EDTA במשך 2 דקות ב 37 ° C. הוסף 2 מ"ל של מדיום צמיחה ולאסוף את התאים בצינור חרוטי חדש 50 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות.
  15. מעבירים את הנגמ"שים ללוחות של 12 בארות (10,000-20,000 תאים לבאר) שצופו בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%. יש לדגור ב-37°C עם 5% CO2. שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.
    הערה: ניתן לעבור בנגמ"שים פעם אחת. לאחר מכן, הם מאבדים את יכולתם להתרבות ולהבדיל. ראה את זרימת העבודה עבור תהליך בידוד הנגמ"שים באיור משלים S2.

2. התמיינות אדיפוציט ואינדוקציה של עמידות לאינסולין

הערה: לשמור על תאים בטמפרטורה של 37°C ב-5%CO2 ולבצע שלבים הכוללים שינוי מדיום וטיפולים עם TNF-α ואינסולין בתוך מכסה מנוע סטרילי.

  1. במפגש של 80%, התחל את תהליך הבידול; יש לשאוף מכל מצע גידול ולהחליף אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות (טבלה 1) המכיל 3.3 ננומטר חלבון מורפוגנטי עצם (BMP4) בכל באר.
  2. לאחר 48 שעות, החלף את המדיום בתווך הבידול (500 מיקרוליטר לבאר) ובקוקטייל הבידול (טבלה 1).
  3. הסר את המדיום 72 שעות מאוחר יותר והוסף 100 ננומטר של אינסולין ב 500 μL של מדיום התמיינות טרי.
    הערה: תאים מתחילים להראות מראה עגול עם טיפות שומנים קטנות בפנים.
  4. שאפו מכל אמצעי בידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של FBS בינוני-2% פשוט (טבלה 1) 48 שעות מאוחר יותר. יש לגרום לתנגודת לאינסולין עם 4 נ"ג/מ"ל של TNF-α. כלול בארות בקרה ללא טיפול TNF-α.
  5. לאחר 24 שעות של דגירה, הוסף 4 ננוגרם/מ"ל TNF-α ב-FBS פשוט בינוני-0% (טבלה 1). שמור על בארות בקרה ללא טיפול TNF-α.
  6. הפעל את מסלול איתות האינסולין 24 שעות מאוחר יותר על ידי הוספת אינסולין 100 ננומטר ודגור במשך 15 דקות ב 37 ° C באטמוספירה 5% CO2 . הסר את המדיום ולשטוף עם 500 μL של PBS. כלול בארות בקרה ללא טיפול באינסולין.

3. הערכת מסלול איתות אינסולין על ידי כתם מערבי

  1. מיצוי וכימות חלבונים
    1. שטפו כל באר של תאים עם 500 מיקרוליטר של PBS ושמרו על קרח כדי לשכך את התאים ב-50 מיקרוליטר של חיץ RIPA (טבלה 1) המכיל קוקטייל מעכב פרוטאז 1% שנוסף ממש לפני בידוד הדגימה. מגרדים את כל פני השטח של הבאר עם קצה ומעבירים את הליזט לצינור מיקרוצנטריפוגה 0.6 מ"ל (לשמור על קרח).
    2. יש לדגור במשך שעה אחת ב-4°C בשייקר מסתובב, לערבב באמצעות מערבולות ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C ולשחזר את הסופרנאטנט (לשמור על קרח).
    3. קבע את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד (אין לדלל את הדגימה כדי לכמת).
    4. קח את הנפח הדרוש המתאים ל 40-60 מיקרוגרם ו denature עם חיץ Laemmli 6x (טבלה 1) על ידי דגירה ב 97 ° C במשך 15 דקות תוך כדי רעד ב 550 סל"ד. מקפיאים עד לשימוש.
  2. אלקטרופורזה ג'ל SDS-polyacrylamide
    1. ביצוע אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) עם ג'ל פוליאקרילאמיד 7.5% בעובי 1.5 מ"מ. הכניסו את הג'ל למיכל ומלאו בחיץ ריצה (טבלה 1).
    2. הוסף 3 μL של תקן חלבון prestained לבאר הראשונה של הג'ל ולטעון כל דגימה לתוך הבארות הבאות.
    3. הפעל את הג'ל ב 80 V במשך כ -15 דקות כדי להבטיח את הדגימה נכנסת מטריצת ג'ל רכז פוליאקרילאמיד. לאחר מכן, הגדל את המתח ל 90 V למשך 2.5 שעות או עד שניתן לראות את סמן המשקל המולקולרי של 37 kDa בקצה התחתון של הג'ל.
    4. מעבירים את החלבונים מהג'ל לקרום ניטרוצלולוז בתא חצי יבש למשך 35 דקות במתח של 25 וולט. לפני כן, טבלו את הג'ל, הקרום והמסננים במאגר העברה (טבלה 1) למשך מספר דקות.
  3. כתם מערבי
    1. לאחר ההעברה, שטפו את הממברנה במי מלח חוצצים (TBS) המכילים 0.1% Tween 20 (TBS-T 0.1%) (טבלה 1) למשך 3 דקות עם טלטול ב-30 סל"ד.
    2. חסום את הממברנה בתמיסת חסימה (טבלה 1) ב- 4 ° C למשך שעה אחת בסיבוב קבוע.
    3. חתכו את הממברנה לשלושה חלקים על פי סמן המשקל המולקולרי כדי לדגור לילה עם נוגדנים ראשוניים שונים (מדוללים בתמיסה חוסמת) ב 4 מעלות צלזיוס בסיבוב קבוע: נוגדן פוספו-IRS1 (Tyr608) (1:1,000), רצועה צפויה ב 180 kDa; נוגדן לקולטן פוספו-אינסולין β (Tyr1150/1151) (1:1,000), רצועה צפויה ב-95 kDa; נוגדן פוספו-אקט (Ser473) (1:1,000), רצועה צפויה ב-60 kDa.
    4. שטפו את הממברנות 5x במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T 0.1%.
    5. דוגרים על הממברנות עם הנוגדן המשני המקביל המצומד לפרוקסידז (מדולל בתמיסת חסימה) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר בסיבוב קבוע: peroxidase affiniPure חמור נגד ארנב IgG (H+L) (1:5,000).
    6. שטפו את הממברנות 5x במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T 0.1%.
    7. זהה את החלבונים באמצעות מערכת זיהוי chemiluminescence. הכינו את המצע בהתאם להוראות היצרן.
    8. מניחים את הכתם בשקית ניילון ומוסיפים 200 μL של מצע chemiluminescent כדי לכסות לחלוטין את הממברנה. יש לנקז את עודפי המצע ולהסיר בועות אוויר.
    9. חשוף כל כתם במשך 30-60 שניות במערכת הדמיה בעלת ביצועים גבוהים התואמת לכימילומינסנציה.
    10. הפשיט את הממברנות (שלבים 10-13 של החלק המערבי של הכתם) כדי לשבור את אינטראקציות נוגדן-אנטיגן ובכך לאפשר ניפוח מחדש של קרום הניטרוצלולוז. לשחזר את הממברנות ולשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBS-T 1% ב 50 סל"ד.
    11. דגירה במשך 7 דקות עם 10 מ"ל של 0.2 מ 'NaOH ב 50 סל"ד.
    12. יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד במי ברז ב-50 סל"ד.
    13. שטפו במשך 10 דקות עם TBS-T 1% ב-50 סל"ד.
    14. חזור על שלבים 2-9 של קטע הכתם המערבי כדי לדגור על הממברנה עם אנטי בטא טובולין (55 kDa) כבקרת העמסה באמצעות דילול 1:1,000.
    15. בצע ניתוח דנסיטומטרי25 עבור כל חלבון באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

תוצאות

במהלך השנים האחרונות, השכיחות המוגברת של השמנת יתר וסוכרת סוג 2 הובילה לחיפוש אינטנסיבי אחר המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמת השומן. בעזרת הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן להתמיין בין APCs לאדיפוציטים בוגרים כדי להעריך עמידות ורגישות לאינסולין. ברגע שה-APCs מגיעים למפגש, לוקח להם 10 ימים לה?...

Discussion

מאמר זה מספק שיטה לחקר עמידות לאינסולין המשתמשת באדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלת ב-TNF-α. למודל זה יש יתרון בכך שניתן לגדל בתרבית אדיפוציטים ראשוניים בתנאים מוגדרים לפרקי זמן ארוכים עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים26. משך הבדיקה הוא 15-20 ימים, אם כי שינויים באחוז האדיפו?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מודים לדניאל מונדרגון, אנטוניו פראדו, פרננדו לופז-בררה, מרטין גרסיה-סרבין, אלחנדרה קסטילה ומריה אנטונייטה קרבאג'ו על עזרתם הטכנית, ולג'סיקה גונזלס נוריס על העריכה הביקורתית של כתב היד. פרוטוקול זה נתמך על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (ל- Y.M).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer LONZA10-548E
Anti-Biotin Microbeads Miltenyi130-090-485
Anti-CD31eBioscience13-0311-85
AutoMACS Pro SeparatorMiltenyi
Basement membrane matrix (matrigel)Corning354234
bFGFSigmaF0291Growth factor
BSAEquitech-Bio, Inc.BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin eBioscience13-0451-85
Collagenase, Type 1Worthington BiochemLS004197
DexamethasoneSigmaD1756
DMEMGIBCO12800017
DMEM low glucoseGIBCO31600-034
EGFPeprotech315-09Growth factor
FBSGIBCO26140-079
ITS mixSigmaI3146
L-ascorbic acid 2-phosphateSigmaA8960
LIFMilliporeESG1107Growth factor
Linoleic acid-albuminSigmaL9530
MCDB 201 mediumSigmaM6770
NormocinInvivoGenant-nr-2
PDGF-BB Peprotech315-18Growth factor
Peniciline-StreptomycineBioWestL0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm)Miltenyi130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 BD Pharmingen553142
Trypsin-EDTA GIBCO25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]SigmaI5879Differentiation cocktail
BMP4R&D Systems5020-BP-010Differentiation cocktail
DexamethasoneSigmaD1756Differentiation cocktail
InsulinSigmaI9278
RosiglitazoneCayman71742Differentiation cocktail
TNFαR&D Systems210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibodyAbcamab6046
Bromophenol blueBioRad161-0404Laemmli buffer
EDTASigmaE5134RIPA buffer
EGTASigmaE4378RIPA buffer
FluorChem E systemProteinSimple
GlycerolSigmaG6279Laemmli buffer
GlycineSigmaG7126Running and Transfer buffer
IgepalSigmaI3021RIPA buffer
2- mercaptoethanolSigmaM3148Laemmli buffer
MethanolJT Baker907007Transfer buffer
NaClJT Baker3624-05TBS-T
NaFSigma77F-0379RIPA buffer
NaOH JT Baker3722-19
Na4P2O7Sigma114F-0762RIPA buffer
Na3VO4SigmaS6508RIPA buffer
Nitrocellulose membrane BioRad1620112
Nonfat dry milkBioRad1706404Blocking solution
Prestained protein standard BioRad1610395
Protease inhibitor cocktail SigmaP8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β Cell signaling3024
Phospho-Akt (Ser473) AntibodyCell signaling9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibodyMillipore9432
Saccharose JT Baker407205RIPA buffer
SDSBioRad1610302Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
Tris-basePromegaH5135Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HClJT Baker4103-02RIPA buffer - TBS
Tween 20SigmaP1379TBS-T

References

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Insulin Resistance. StatPearls Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021)
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

192TNF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved