使用3D体积视图图像检测和定量隧道纳米管

摘要

隧道纳米管（TNTs）主要是连接相邻细胞的开放式F-actin膜纳米管，促进细胞间通讯。TNT与其他细胞突起的显着特征是细胞之间纳米管的悬停性质。在这里，我们通过构建共聚焦z堆栈图像的3D体积视图来表征TNT。

摘要

最近的发现表明，细胞通过纳米级肌动蛋白膜导管（即"隧道纳米管"（TNT） ）进行 直接，远程，细胞间转移。TNT被定义为开放式脂质双层包围的膜延伸，其介导直径范围在50nm至1μm之间的相邻细胞之间的连续性。 TNT最初在神经元细胞中得到证实，但连续的研究表明TNT存在于几种细胞类型和疾病中，例如神经退行性疾病，病毒感染和癌症。一些研究将相邻细胞之间的封闭式电偶联膜纳米结构称为TNT或TNT样结构。

根据终点膜连续性阐明超微结构在技术上具有挑战性。此外，由于缺乏特异性标记物，在使用常规方法表征TNT方面，细胞-细胞通讯的研究具有挑战性。TNT主要定义为基于F-肌动蛋白的开放式膜突起。然而，一个主要的局限性是F-肌动蛋白存在于所有类型的突起中，这使得区分TNT与其他突起变得具有挑战性。基于F-肌动蛋白的TNT的显着特征之一是这些结构在两个细胞之间徘徊而不接触基质。因此，根据它们在细胞之间的徘徊，可以方便地将不同的F-肌动蛋白染色的TNT与其他突起（例如丝状伪足和神经突）区分开来。

我们最近表明，通过肌动蛋白依赖性内吞作用内聚蛋白的内化低聚淀粉样蛋白-_{β 1-42}（oAβ）刺激活化的p21激活激酶-1（PAK1），其介导SH-SY5Y神经元细胞之间含F-肌动蛋白的TNTs与磷酸化PAK1共表达的形成。该协议概述了一种 3D 体积分析方法，以从捕获的 oAβ 处理的神经元细胞中 F-肌动蛋白和磷酸化-PAK1 免疫染色膜突起的 z 堆栈图像中鉴定和表征 TNT。此外，TNTs与基于F-肌动蛋白和β-III微管蛋白免疫染色膜导管的发育神经突和神经元生长物区分开来。

引言

隧道纳米管（TNT）是基于F-肌动蛋白的，主要是开放式膜导管，在货物和细胞器的细胞间转移中起着至关重要^{的作用1。}TNT的独特之处在于它们在不与基质接触的情况下连接相邻的细胞;它们的长度超过 10-300 μm，直径在 50 nm 到 1 μm^{之间变化 2，3}。TNT是瞬态结构，其寿命持续几分钟到几小时。TNTs首先在PC12^{神经元细胞中}得到证实1;后来，大量研究表明它们存在于几种体外和体内细胞类型中 ^4，5.一些研究揭示了TNT在各种疾病模型中的病理意义，例如神经退行性疾病，癌症和病毒感染⁶，^7，8。

TNT的结构异质性已被各种^{细胞系统中的}几项研究证明9。差异基于细胞骨架组成、形成机制和转移的货物类型¹⁰。首先，徘徊在两个相邻细胞之间并转移细胞器的开放式F-肌动蛋白阳性膜连续性被认为由^TNTs组成11。然而，在TNTs的形成中观察到的缺乏明确性或多样性增加了开发TNT特异性标志物的难度。因此，很难通过常规检测方法识别TNT结构，也难以区分膜纳米管的开端和闭端突起¹²。然而，TNTs作为两个细胞之间的F-肌动蛋白膜突起徘徊的特征相对容易，使用常规成像技术进行识别也更可行。其他基于肌动蛋白的细胞突起，如丝状伪足和背丝状伪足，不能在两个远处细胞之间徘徊，特别是当细胞固定时。值得注意的是，封闭式、电耦合、发育中的神经突通常被称为TNT样结构¹³。

众所周知，F-肌动蛋白在TNT形成中起重要作用，多项研究表明，F-肌动蛋白抑制剂细胞松弛素D抑制TNTs的形成^14，15。相比之下，微管抑制剂对TNT形成没有任何影响¹⁶。在过去的20年中，已经有几份关于TNT在病理学和肿瘤耐药性和治疗的传播中发挥的重要作用的报告¹⁷。因此，对更好的TNT表征技术的需求永无止境。

缺乏TNT的特异性标志物以及形态和细胞骨架组成的多样性使得难以开发独特的表征方法。一些研究使用了自动图像检测和TNT量化技术^18，19。然而，与用于检测和定量TNT的自动图像分析相比，目前的3D体积手动分析方法有几个优点。 通常，训练有素的人眼比自动图像检测方法更容易发现这些悬浮的纳米结构。此外，在缺乏算法专业知识的实验室中，自动检测方法可能难以实施。本方法因其精密度和重现性而被研究人员广泛采用。

在最近的一项研究中，我们发现oAβ通过PAK1介导的肌动蛋白依赖性内吞机制 促进 神经元细胞中TNT的生物发生¹²。oAβ诱导的TNTs也表达活化的PAK1（或磷酸化PAK1）。我们开发了一种3D体积视图图像重建方法来区分oAβ诱导的，F-肌动蛋白和磷酸化PAK1免疫染色的TNT。 β-III微管蛋白阳性，发育中的神经突通常类似于TNT样悬浮结构²⁰。因此，我们进一步区分了基于F-肌动蛋白的TNTs与β-III微管蛋白阳性神经突起和其他TNT样突起。3D体积视图图像已被用于根据TNT悬停在基质上并在两个相邻细胞之间保持连接的特征来识别TNT。本文描述了使用共聚焦z-stack图像识别和检测含肌动蛋白的膜导管或TNT，最后从3D体积视图重建图像中手动定量识别的结构。所提出的方法无法区分开放式适当的TNT和封闭式TNT样结构;该方法有助于在平坦基质上的 体外 2D细胞培养物中鉴定TNT。然而，该方法易于实施和复制，可广泛用于仅基于肌动蛋白的TNT的精确定量，并将其与神经突和β-微管蛋白阳性TNT样结构区分开来。

研究方案

注意:在DMEM / F-12培养基中培养的SH-SY5Y细胞用10μM视黄酸分化7天，并在37°C（5%CO 2）下用1μM oAβ低聚物处理₂小时。处理后，用Karnovsky的固定溶液固定细胞，并用磷酸化PAK1（Thr423）/ PAK2（Thr402）抗体和F-肌动蛋白结合鬼笔环肽进行双重免疫染色。后来，使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄共聚焦z-stack图像。TNTs通过手动计数进行定量，并通过构建3D体积视图图像并从它们悬停在两个细胞之间而不接触基质的特征来识别结构，从而与其他神经突/细胞突起区分开来（图1）。

1. 细胞培养与分化

1. 用 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素-新霉素混合物 （PSN） 在 DMEM/F12（Ham's） 培养基中 1:1 培养 SH-SY5Y 神经元细胞。将细胞接种在35 mm成像培养皿中，用14 mm孔组成，该孔由连接到底部的培养皿中心的#1.5盖玻片组成。以12，000个细胞/ cm² 的浓度将细胞接种在成像培养皿上，并以60%-70%的汇合度进行实验。
2. 用 10 μM 维甲酸 （RA） 与 100 mM 储备溶液（15 mL 二甲基亚砜 [DMSO] 中的 5 mg RA）部分区分细胞。然后，将细胞在37°C（5%CO 2）下孵育7天，每₂天更换一次培养基进行分化。
   注意:注意保持细胞（未分化和部分分化的细胞）的汇合度（60%-70%）。细胞密度可以影响细胞之间TNT的形成。

2.淀粉样蛋白-_{β 1-42} （oAβ）低聚物的制备以治疗神经元细胞

1. 将 Aβ _1-42 （₁ mg） 溶解在 200 μL 的 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，并将溶液分成 20 等分试样，每份含有 0.05 mg 肽。冻干并将等分试样储存在-20°C以备后用。
2. 通过将 2.2 μL DMSO 添加到 0.05 mg 冻干肽中，制备 DMSO 中冻干 Aβ _1-42 的储备溶液 （5 mM）。为了小心溶解肽，涡旋溶液并在水浴超声仪中超声处理2分钟。
3. 将储备溶液在DMEM，pH 7.4中稀释至100μM的浓度，并涡旋将肽转化为单体，然后在4°C下孵育24小时以获得Aβ _1-42（oAβ）¹²，^21，22的低聚物。
4. 在实验之前通过透射电子显微镜成像表征oAβ如先前报道的^21，22 。
5. 用1μM oAβ处理部分分化的SH-SY5Y细胞。在治疗前取出培养基，并加入新鲜的不含FBS的DMEM。更换培养基后，将先前制备的oAβ（100μM）加入培养基中至终浓度为1μM.将细胞与1μM oAβ在37°C（5%CO 2）下孵育₂小时。包括未处理细胞形式的阴性对照。

3. F-肌动蛋白和活化-PAK1的免疫染色用于TNT的表征

1. 使用磷酸化 PAK1 （Thr423）/PAK2 （Thr402） 抗体和 F-肌动蛋白结合的钝毒素鬼笔环肽进行差异免疫染色。
2. 在固定前用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤对照和oAβ处理的细胞2 x 2分钟。使用溶解在 pH 7.2 M 磷酸盐缓冲液中的 2% 福尔马林固定剂和 2.5% 戊二醛制备 Karnovsky 固定剂溶液。然后，通过添加Karnovsky的固定溶液（刚好足以覆盖细胞）在室温下固定成像皿中的细胞45分钟。
3. 使用孵育缓冲液洗涤固定细胞2 x 2分钟。通过将 0.1 g 皂苷溶解在 5 mL FBS 中来制备孵育缓冲液 （20x），并通过加入 95 mL 的 1x PBS 稀释至 1x。
4. 固定后，在孵育缓冲液中以1:250的稀释度加入第一个抗phopho-PAK1的抗体，并在4°C下在黑暗潮湿的室中孵育过夜。
5. 第二天，孵育24小时后，用孵育缓冲液洗涤细胞2 x 2分钟;然后，加入与Alexa Fluor 488（1:1，000稀释度）和鬼笔环肽555（1:1，000稀释度）偶联的二抗。将细胞在室温下在黑暗潮湿的室中孵育1.5小时。
6. 孵育后，用孵育缓冲液洗涤细胞2 x 2分钟。通过在 1:2，000 稀释液中加入 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对细胞核进行染色，并在室温下在黑暗中孵育 5 分钟至 10 分钟。
7. 使用25毫克DABCO在90%甘油和10%1x PBS中制备DABCO封片剂。为了正确溶解，使用分光光度级将pH调节至8.6，稀释HCl（用水稀释1:20），并将溶液保持在摇杆上进行混合。
8. 作为抗漂白剂，将DABCO封片剂直接添加到底部包含盖玻片的成像皿上。等待至少1-2小时，然后直接进行共聚焦成像。
   注意:固定盖玻片不需要粘合剂。

4.F-肌动蛋白和β-III微管蛋白免疫染色以区分TNT与神经突

1. 使用 β-III 微管蛋白抗体和 F-肌动蛋白结合的鬼鬼笔环肽进行差异免疫染色。
2. 在加入Karnovsky的固定剂溶液之前，用1x PBS洗涤oAβ处理的细胞2倍。将细胞在室温下孵育45分钟，并用孵育缓冲液洗涤细胞2 x 2分钟。
3. 固定后，在孵育缓冲液中以1:250的稀释度加入抗β-III微管蛋白（TUBb3）的抗体，并在黑暗潮湿的室中以4°C孵育过夜。
4. 第二天，用孵育缓冲液（2 x 2分钟）洗涤细胞，并将偶联的二抗与Alexa Fluor 488（1:1，000稀释）和鬼笔环肽555（1:1，000稀释）一起添加到同一培养皿中。然后，将细胞在室温下在黑暗潮湿的室中孵育1.5小时。
5. 用孵育缓冲液洗涤细胞2x，并在室温下在黑暗中以1:2，000稀释液加入核染色DAPI5-10分钟。
6. 如上所述，在封片剂中加入抗漂白剂DABCO并等待2小时后进行成像。

5. 共聚焦显微镜成像

1. 要识别TNT，请使用共聚焦激光扫描显微镜捕获免疫染色细胞的z-stack图像。使用带有DAPI、异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基罗丹明（TRITC）滤光片组的40x/1.40油DIC物镜拍摄图像。
2. 首先，通过在共聚焦软件的窗口轨道 1、轨道 2 和轨道 3 中依次单击所需的激光器来选择通道。单击轨道 1 窗口下方的选项 T-PMT 以拍摄具有荧光通道的微分干涉对比 （DIC） 图像。
   注意:DIC图像由标记为 T-PMT的不同检测器捕获。
3. 选择软件的 采集 选项卡，单击 Z-stack 选项卡，然后等待窗口打开。然后，单击 实时扫描 以聚焦培养皿底部的细胞。选择该聚焦图像作为第一个堆栈。然后，向上聚焦以查看单元格的最顶层，并选择它作为最后一个堆栈。停止实时扫描并单击 最佳 选项卡旁边的数字以固定堆栈的 步长 。步长根据单元格的厚度确定切片数和间隔。
   注意:将根据奈奎斯特采样选择步长，以获取足够的切片并确保两个堆栈之间没有间隙。奈奎斯特采样是根据物镜和光的波长确定的²³.
4. 使用 405 nm、488 nm 和 561 nm 激光器拍摄 DAPI、FITC 和 TRITC 三个通道的连续图像，并以 1.02 μs 的像素停留时间进行捕获。 使用荧光通道捕获DIC通道中的图像以观察细胞边界。
5. 捕获一堆尺寸为 x:224.92 μm 和 y:224.92 μm 的图像，每个像素为 220 nm ² 尺寸，z 缩放为 415 nm。
6. 拍摄从细胞底部到顶部捕获多个 z 堆栈（15-22 个堆栈）的图像。从培养皿的随机场中获取至少10张图像，以获得总共~200-300个细胞。
7. 离线分析捕获的图像，通过3D体积视图分析识别TNT

6. 分析共聚焦z-stack图像以识别和量化TNT

1. 打开斐济软件中以.czi数据格式保存的共聚焦图像进行分析。
2. 选择 "超级堆栈 "选项以查看图像的每个 z 堆栈和通道。查找 z 堆栈和通道的超堆栈，它们在单个窗口中打开，如图 2 所示。滚动通道（由红色和绿色箭头指示）和 z 堆栈（由蓝色箭头指示）滚动条以选择感兴趣的特定通道的确切堆栈。
   注意:在固定单元中，由于悬停的TNT或膜导管保持在表面上方，因此在z堆栈的下部看不到结构。然而，在固定细胞中，神经突位于表面上，在z堆栈的下部可检测到（z = 0至2）。有关识别步骤，请参见 图 2 。
3. 如图 2 所示，首先通过滚动通道栏选择 F 肌动蛋白染色的通道（由红色箭头指示）。然后，手动滚动 z 堆栈（由蓝色箭头指示）以逐个查看每个堆栈。识别似乎连接细胞的F-肌动蛋白染色结构，在z堆栈的下部可见，并且靠近成像盘表面（z = 2）作为神经突（由白色箭头表示）。
   注意:大多数神经突很容易识别，因为它们显示为延伸的突起（由粉红色箭头表示）。
4. 通过将z堆栈向顶部滚动（从图2中的z = 4;用黄色箭头表示）来识别TNT，即F-肌动蛋白阳性，悬停的细胞间导管。寻找 z 堆栈下部附近朝向表面的神经突，并观察到它们随着 z 堆栈向顶部滚动而开始消失（图 2 中的 z = 6;神经突不清晰可见）。
5. 通过分析来自z堆栈的导管的悬停性质，鉴定磷酸化PAK1阳性TNT与F-肌动蛋白阳性TNT类似。由于磷酸化 PAK1 染色比 F-肌动蛋白染色弱，因此在 z = 4 （隐约可见）和 z = 6 （突出）处寻找磷酸 PAK1 染色的 TNT。
6. 此外，观察DIC图像以验证F-肌动蛋白和磷酸化PAK1染色的TNT结构是细胞之间的膜导管（图3）。此外，合并F-肌动蛋白（红色）和磷酸化PAK1（绿色）通道以验证鉴定的TNT是F-肌动蛋白和磷酸化PAK1共染色结构（图3）。
7. 要量化 TNT，请手动计算细胞总数和识别的 TNT，并将数字表示为百分比。
8. 为了将 F 肌动蛋白阳性 TNT 和 β-III 微管蛋白 （TUBb3） 阳性、TNT 样悬停导管与 z 堆栈图像区分开来，合并 F-肌动蛋白（红色）和 TUBb3（绿色）通道（图 4）。然后，分析合并图像的 z 堆栈。
   1. 寻找仅在 F 肌动蛋白染色的 TNT，这些 TNT 在 z = 3 时隐约可见，在 z = 6 和 z = 9 时突出（黄色箭头）。同样，在 z = 6 和 z = 9（青色箭头）处识别 F-肌动蛋白和 β-III 微管蛋白 （TUBb3） 双阳性、TNT 样悬停导管。从 z 堆栈的下部识别其他 F 肌动蛋白和 β-III 微管蛋白染色的非悬停突起（白色箭头）。
9. 使用斐济的线工具测量TNT的直径。通过单击分析|来验证测量比例设置"缩放"，以便从 .czi 图像自动设置"以像素为单位的距离"。在xy平面上测量TNT的直径。
   注意:大多数直径在 1 像素到 4 像素之间（即 220-880 nm）;每个像素为 220 nm。有关分析z-stack共聚焦图像的协议摘要，请参见 图5 。

7.3D 重建z-stack图像以表征TNT

1. 使用斐济的 卷查看器 插件，该插件允许 3D 重新切片和启用阈值的 3D 可视化（图 6）。
2. 将 z 堆栈图像拆分为单独的通道。然后，裁剪单通道（F-肌动蛋白通道）z-stack图像，以使用 3D重建视图 一次突出显示一个或两个TNT或神经突。启用 卷视图 插件以可视化 xy、yz 和 xz 视图。
3. 在xy平面上固定单个TNT或神经突（ 图6A中的白色箭头表示神经突; 图6B中的黄色箭头表示TNT）并标记xz（红色）和yz（绿色）轴横截面。观察 xz 和 yz 平面中 xz 平面底部的神经突（白色箭头，图 6A）和上部 z 堆栈中的 TNT（黄色箭头， 图 6B）。
4. 选择单个TNT或神经突以在xz平面中重建3D体积视图（图6C，D）。在 3D 重建中，观察 z 平面底部的神经突（白色箭头，图 6C）和 TNT 显示为连接两个细胞的悬停结构，而不接触底部 z 平面（黄色箭头， 图 6D）。

结果

在这里，我们通过从共聚焦z-stack图像构建3D体积视图来鉴定和表征SH-SY5Y神经元细胞中oAβ诱导的TNT（图1）。用F-肌动蛋白和磷酸化PAK1对细胞进行双重免疫染色。分析免疫染色细胞的共聚焦z-stack图像以鉴定TNT（图2）。此外，分析DIC图像以验证F-肌动蛋白和磷酸化PAK1染色的TNT结构是细胞之间的膜导管（图3）。此外，用F-肌动蛋白和β...

讨论

在过去的20年中，一些研究人员一直在试图理解和表征TNT的结构¹⁸。缺乏特异性标志物阻碍了进展，并且对可用于识别，表征和定量TNT的方便，标准化方法的需求不断增加。 TNT被定义为徘徊在两个细胞之间的基于F-肌动蛋白的膜导管。研究表明，β-微管蛋白阳性，封闭式，发育中的神经突在两个远处细胞之间徘徊，类似于TNT样结构^12，13...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation