JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן בעיקר ננו-צינוריות ממברנת F-actin פתוחות המחברות בין תאים שכנים, ומקלות על תקשורת בין-תאית. המאפיין הבולט המבדיל בין TNTs לבין בליטות תאים אחרות הוא האופי המרחף של הננו-צינוריות בין התאים. כאן, אנו מאפיינים TNTs על ידי בניית תצוגת נפח תלת-ממדית של תמונות z-stack קונפוקליות.

Abstract

תגליות אחרונות גילו כי תאים מבצעים העברה בין-תאית ישירה, ארוכת טווח, באמצעות צינורות אקטין-ממברנה בקנה מידה ננומטרי, כלומר "מנהור ננו-צינוריות" (TNTs). TNTs מוגדרים כהרחבות ממברנה דו-שכבתיות פתוחות ומקיפות שומנים, המתווכות המשכיות בין תאים שכנים בקטרים הנעים בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר. TNTs הודגמו בתחילה בתאי עצב, אך מחקרים עוקבים חשפו את קיומם של TNTs במספר סוגי תאים ומחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, זיהומים ויראליים וסרטן. מספר מחקרים התייחסו לננו-מבנים של ממברנות מצומדות חשמלית בין תאים שכנים כאל מבנים דמויי TNT או TNT.

ההבהרה של אולטרה-מבנה במונחים של המשכיות הממברנה בנקודת הקצה היא מאתגרת מבחינה טכנית. בנוסף, מחקרים על תקשורת בין תאים מאתגרים מבחינת אפיון TNTs בשיטות קונבנציונליות בשל היעדר סמנים ספציפיים. TNTs מוגדרים בעיקר כבליטות ממברנה פתוחות מבוססות F-actin. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת היא ש-F-אקטין קיים בכל סוגי הבליטות, מה שמקשה על הבחנה בין TNTs לבליטות אחרות. אחד המאפיינים הבולטים של TNTs מבוססי F-actin הוא שמבנים אלה מרחפים בין שני תאים מבלי לגעת בתת-הסטרטום. לכן, ניתן להבחין בנוחות בין TNTs מוכתמים ב-F-actin לבין בליטות אחרות כגון פילופודיה ונויריטים בהתבסס על ריחופין בין תאים.

לאחרונה הראינו כי הפנמה של עמילואיד-β אוליגומרי 1-42 (oAβ) באמצעות אנדוציטוזה תלוית אקטין מעוררת קינאז-1 מופעל p21 (PAK1), אשר מתווך את היווצרותם של TNTs המכילים F-אקטין יחד עם phospho-PAK1 בין תאי עצבSH-SY5Y. פרוטוקול זה מתווה שיטת ניתוח נפח תלת-ממדית לזיהוי ואפיון TNTs מתמונות z-stack שנלכדו של בליטות ממברנה מוכתמות ב-F-actin ו-phospho-PAK1-immunostained בתאי עצב שטופלו ב-oAβ. יתר על כן, TNTs נבדלים מפיתוח נויריטים וצמיחה עצבית המבוססת על צינורות ממברנה עם F-אקטין ו-β-III טובולין-אימונוסטי.

Introduction

ננו-צינוריות מנהור (TNTs) הן צינורות ממברנה פתוחים מבוססי F-actin, וממלאים תפקיד חיוני בהעברה בין-תאית של מטען ואברונים1. המאפיין הייחודי של TNTs הוא שהם מחברים תאים שכנים ללא כל מגע עם הסובסטרטום; אורכם מעל 10-300 מיקרומטר וקוטרם נע בין 50 ננומטר ל-1 מיקרומטר 2,3. TNTs הם מבנים חולפים, ואורך חייהם נמשך בין מספר דקות למספר שעות. TNTs הודגמו לראשונה בתאי עצב PC121; מאוחר יותר, מחקרים רבים הראו את קיומם במספר סוגי תאים במבחנה וב- in vivo 4,5. מספר מחקרים חשפו את המשמעות הפתולוגית של TNTs במודלים שונים של מחלות, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, סרטן וזיהומים נגיפיים 6,7,8.

ההטרוגניות המבנית של TNTs הודגמה על ידי מספר מחקרים במערכות תאיות שונות9. ההבדלים מבוססים על הרכב השלד, מנגנון היווצרותו וסוגי המטעניםשהועברו 10. בראש ובראשונה, המשכיות הממברנה הפתוחה, החיובית ל-F-actin, המרחפת בין שני תאים שכנים ומעבירה אברונים, נחשבת למורכבת מ-TNTs11. עם זאת, חוסר הבהירות או המגוון שנצפה בהיווצרות TNTs מוסיף לקושי בפיתוח סמנים ספציפיים ל- TNT. לפיכך, קשה לזהות מבני TNT בשיטות גילוי קונבנציונליות ולהבחין בננו-צינוריות ממברנה במונחים של בליטות פתוחות וסגורות12. עם זאת, המאפיין של TNTs לרחף כמו בליטות ממברנת F-actin בין שני תאים הוא יחסית קל יותר וניתן יותר לזיהוי באמצעות טכניקות הדמיה קונבנציונליות. בליטות תאיות אחרות המבוססות על אקטין, כגון פילופודיה ופילופודיה גבית, אינן יכולות לרחף בין שני תאים מרוחקים, במיוחד כאשר התאים מקובעים. יש לציין כי נויריטים קרובים, מצומדים חשמלית ומתפתחים מכונים לעתים קרובות מבנים דמויי TNT13.

ידוע כי F-אקטין ממלא תפקיד חשוב בהיווצרות TNT, ומספר מחקרים הראו כי מעכב F-אקטין ציטוכלזין D מעכב את היווצרותם של TNTs14,15. לעומת זאת, למעכבי מיקרוטובולים אין כל השפעה על היווצרות TNT16. בשני העשורים האחרונים ראינו מספר דיווחים על התפקיד המשמעותי ש- TNTs ממלאים בהתפשטות הפתולוגיה והעמידות לגידולים וטיפול17. לכן, יש דרישה בלתי נגמרת לטכניקות טובות יותר לאפיון TNT.

היעדר סמנים ספציפיים של TNTs והגיוון במורפולוגיה ובהרכב הציטוסקטלי מקשים על פיתוח שיטת אפיון ייחודית. מחקרים מסוימים השתמשו בזיהוי תמונה אוטומטי ובטכניקות כימות TNT18,19. עם זאת, ישנם מספר יתרונות של שיטת הניתוח הידנית הנוכחית בנפח תלת-ממדי על פני ניתוח תמונה אוטומטי לזיהוי וכימות של TNTs. לעתים קרובות, עיניים אנושיות מאומנות יכולות לזהות את הננו-מבנים המרחפים האלה בקלות רבה יותר מאשר שיטת זיהוי תמונה אוטומטית. יתר על כן, שיטות זיהוי אוטומטיות עשויות להיות קשות ליישום במעבדות חסרות מומחיות באלגוריתם. השיטה הנוכחית יכולה להיות מאומצת באופן נרחב על ידי חוקרים בשל הדיוק והשכפול שלה.

במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי oAβ מקדם את הביוגנזה של TNTs בתאי עצב באמצעות מנגנון אנדוציטוזה בתיווך PAK1, תלוי אקטין,12. TNTs הנגרמים על-ידי oAβ מבטאים גם PAK1 מופעל (או phospho-PAK1). פיתחנו שיטת שחזור תמונה בתצוגת נפח תלת-ממדית כדי להבחין בין TNTs המושרים על-ידי oAβ, F-actin- ו-phospho-PAK1-immunostained. β-III טובולין חיובי, נוירויטים מתפתחים לעתים קרובות דומים למבנים מרחפים דמויי TNT20. לפיכך, הבחנו עוד יותר בין TNTs מבוססי F-actin לבין נויריטים חיוביים לטובולין β-III ובליטות דמויות TNT אחרות. תמונות תצוגת נפח תלת-ממדיות שימשו לזיהוי TNTs על בסיס המאפיינים שלהם של ריחוף מעל המצע ושמירה על קשר בין שני תאים שכנים. מאמר זה מתאר זיהוי וזיהוי של צינורות ממברנה המכילים אקטין או TNTs באמצעות תמונות z-stack קונפוקליות, ולבסוף, כימות ידני של המבנים שזוהו מתמונות שחזור של תצוגת נפח תלת-ממדית. השיטה המוצגת אינה יכולה להבחין בין TNTs פתוחים תקינים לבין מבנים דמויי TNT קרובים; שיטה זו מסייעת לזהות TNTs בתרבית תאים דו-ממדית במבחנה על מצע שטוח. עם זאת, השיטה קלה ליישום ולהתרבות וניתן להשתמש בה באופן נרחב לכימות מדויק של TNTs מבוססי אקטין בלבד ולהבדילם מנויריטים ומבנים דמויי TNT חיוביים β-טובולין.

Protocol

הערה: תאי SH-SY5Y שגודלו בתרבית במדיית DMEM/F-12 התמינו בחומצה רטינואית של 10 μM במשך 7 ימים וטופלו באוליגומרים של 1 μM oAβ במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2). לאחר הטיפול, התאים תוקנו עם התמיסה המקובעת של קרנובסקי והוכתמו פעמיים בנוגדן פוספו-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלואידין קושר F-אקטין. מאוחר יותר, תמונות z-stack קונפוקליות צולמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. ה-TNTs כומתו על-ידי ספירה ידנית והובלטו בין נוריטים/בליטות תאים אחרות על-ידי בניית תמונות של תצוגת נפח תלת-ממדית וזיהוי המבנים מהמאפיין שלהם של ריחוף בין שני תאים מבלי לגעת בסובסטרטום (איור 1).

1. תרבית תאים והתמיינות

  1. תרבית את תאי העצב SH-SY5Y במדיה DMEM/F12 (Ham's) ביחס של 1:1 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% תערובת פניצילין-סטרפטומיצין-נאומיצין (PSN). זרעו את התאים בצלחת הדמיה בקוטר 35 מ"מ עם באר של 14 מ"מ המורכבת מכיסוי #1.5 במרכז המנה המחוברת לתחתית. זרעו את התאים על צלחת ההדמיה בריכוז של 12,000 תאים לס"מ2 ובצעו את הניסויים בטמפרטורה של 60%-70%.
  2. התמיינות חלקית של התאים באמצעות חומצה רטינואית (RA) של 10 μM מתמיסת מלאי של 100 mM (5 מ"ג של RA ב-15 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד [DMSO]). לאחר מכן, דגירה של התאים במשך 7 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (5% CO2) להתמיינות עם שינוי מדיה כל יומיים.
    הערה: היזהר לגבי שמירה על המפגש (60%-70%) של התאים (הן תאים לא מובחנים והן תאים ממוינים חלקית). צפיפות התאים יכולה להשפיע על היווצרות TNTs בין התאים.

2. הכנת אוליגומרים של עמילואיד-β1-42 (oAβ) לטיפול בתאים עצביים

  1. ממיסים את Aβ 1-42 (1 מ"ג) ב-200 μL של 1,1,1,3,3,3-הקספלואורו-2-פרופנול ומחלקים את התמיסה ל-20 אליקוטים, שכל אחד מהם מכיל 0.05 מ"ג פפטידים. ליופיליזציה ואחסון האליקוטים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  2. הכן את תמיסת המלאי (5 mM) של Aβ 1-42 הליופילית ב- DMSO על ידי הוספת 2.2 μL של DMSO ל- 0.05 מ"ג של פפטיד lyophilized. כדי להמיס בזהירות את הפפטידים, מערבבים את התמיסה וסוניקטיים במשך 2 דקות בסוניק אמבט מים.
  3. לדלל את תמיסת המלאי לריכוז של 100 μM ב-DMEM, pH 7.4 ומערבולת כדי להמיר את הפפטידים למונומרים, ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להשיג אוליגומרים של Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22.
  4. אפיון oAβ לפני הניסויים כפי שדווח בעבר21,22 על ידי הדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים.
  5. טפל בתאי SH-SY5Y הממוינים חלקית באמצעות 1 μM oAβ. הסר את המדיום לפני הטיפולים, והוסף DMEM טרי ללא FBS. לאחר שינוי המדיום, הוסף oAβ (100 μM) שהוכן קודם לכן למדיום לריכוז סופי של 1 μM. דגירה על התאים עם 1 μM oAβ במשך 2 שעות ב 37 °C (5% CO2). כלול שליטה שלילית בצורה של תאים לא מטופלים.

3. חיסון של F-אקטין ומופעל-PAK1 לאפיון TNTs

  1. בצע אימונוסטינינג דיפרנציאלי באמצעות נוגדן phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) ופלוטוקסין פאלוידין קושר F-אקטין.
  2. שטפו את תאי הביקורת והתאים שטופלו ב-oAβ עם תמיסת מלח (PBS) אחת עם אגירת פוספט למשך 2 x 2 דקות לפני הקיבוע. הכן את התמיסה המקובעת של קרנובסקי באמצעות 2% פורמלין מקובע ו-2.5% גלוטרלדהיד מומס במאגר פוספט 0.1 M, pH 7.2. לאחר מכן, תקן את התאים בצלחת ההדמיה על ידי הוספת התמיסה המקובעת של קרנובסקי (מספיק כדי לכסות את התאים) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לשטוף את התאים הקבועים 2 x 2 דקות באמצעות מאגר הדגירה. הכינו את מאגר הדגירה (20x) על ידי המסת 0.1 גרם של סאפונין ב-5 מ"ל של FBS ודללו ל-1x על ידי הוספת 95 מ"ל של PBS אחד.
  4. לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן הראשון נגד phopho-PAK1 בדילול של 1:250 במאגר הדגירה ודוגרים לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לח כהה.
  5. למחרת, לאחר 24 שעות של דגירה, לשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם מאגר הדגירה; לאחר מכן, הוסף נוגדן משני המצומד לאלקסה פלואור 488 (דילול 1:1,000) ופאלוידין 555 (דילול 1:1,000). לדגור על התאים בתא הלח החשוך למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם מאגר הדגירה. הכתימו את הגרעין על ידי הוספת 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בדילול של 1:2,000 ודגרה למשך 5 דקות עד 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  7. הכן את מדיום ההרכבה של DABCO באמצעות 25 מ"ג של DABCO ב-90% גליצרול ו-10% PBS אחד. כדי להתמוסס כראוי, התאם את ה- pH ל- 8.6 באמצעות כיתה ספקטרופוטומטרית, דילל HCl (מדולל 1:20 עם מים) ושמור את התמיסה על נדנדה לערבוב.
  8. כחומר נגד הלבנה, הוסיפו את מדיום ההרכבה של DABCO ישירות על צלחת ההדמיה המכילה את הכיסוי בתחתית. המתן לפחות 1-2 שעות והמשך ישירות לביצוע הדמיה קונפוקלית.
    הערה: אין צורך בדבקים כדי לתקן את הכיסויים.

4. אימונוסטינינג של F-אקטין וטובולין β-III כדי להבחין בין TNTs לנוירויטים

  1. בצע אימונוסטינינג דיפרנציאלי עם נוגדן טובולין β-III ופלוטוקסין פלוידין קושר F-אקטין.
  2. יש לשטוף את התאים המטופלים ב-oAβ פי 2 עם PBS אחד לפני הוספת הפתרון המקבע של קרנובסקי. לדגור את התאים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף את התאים 2 x 2 דקות עם חיץ הדגירה.
  3. לאחר הקיבוע, מוסיפים את הנוגדן כנגד טובולין β-III (TUBb3) בדילול של 1:250 במאגר הדגירה ודוגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתא הלח החשוך.
  4. למחרת, שטפו את התאים עם חיץ הדגירה (2 x 2 דקות), והוסיפו נוגדן משני מצומד לאלקסה פלואור 488 (דילול 1:1,000) ופאלוידין 555 (דילול 1:1,000) יחד לאותה מנה. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר בתא הלח והחשוך.
  5. שטפו את התאים פי 2 עם מאגר הדגירה, והוסיפו DAPI מכתים גרעינית בדילול של 1:2,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
  6. יש להוסיף חומר מונע הלבנה DABCO במדיום הרכבה כאמור לעיל ולהמתין שעתיים לפני ההדמיה.

5. הדמיה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. כדי לזהות TNTs, צלם תמונות z-stack של תאים מדוכאי חיסון באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. צלם את התמונות באמצעות המטרה 40x/1.40 Oil DIC עם DAPI, איזותיוציאנט פלואורסצין (FITC) וטטרה-מתילרודמין (TRITC).
  2. ראשית, בחר את הערוצים על ידי לחיצה על הלייזרים הנדרשים ברצף בחלונות מסלול 1, מסלול 2 ומסלול 3 בתוכנת הקונפוקל. לחץ על האפשרות T-PMT מתחת לחלון Track 1 כדי לצלם את תמונות ניגודיות ההפרעה הדיפרנציאלית (DIC) עם ערוצי פלואורסצנציה.
    הערה: תמונות DIC נלכדות על ידי גלאי אחר שכותרתו T-PMT.
  3. בחר את כרטיסיית הרכישה של התוכנה, לחץ על הכרטיסייה Z-stack והמתן לפתיחת חלון. לאחר מכן, לחץ על סריקה חיה כדי למקד את התאים בתחתית המנה. בחרו בתמונה ממוקדת זו כאוסף התמונות הראשון. לאחר מכן, התמקד למעלה כדי לראות את החלק העליון ביותר של התא ובחר אותו כערימה האחרונה. הפסק את הסריקה החיה ולחץ על המספר שליד הכרטיסייה האופטימלית כדי לתקן את גודל הצעד של הערימות. גודל הצעד קובע את מספר הפרוסות ואת המרווחים בהתבסס על עובי התאים.
    הערה: גודל הצעד ייבחר על סמך דגימת Nyquist כדי לקחת מספיק פרוסות ולוודא שאין רווחים בין שתי הערימות. דגימת ניקוויסט נקבעת על בסיס המטרה ואורכי הגל של האורות23.
  4. צלם תמונות עוקבות של שלושה ערוצים של DAPI, FITC ו- TRITC עם לייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר ולכוד עם זמן שהייה של פיקסלים של 1.02 μs. צלם תמונות בערוץ DIC עם ערוצים פלואורסצנטיים כדי לבחון את גבול התא.
  5. צלם ערימה של תמונות במידות x: 224.92 μm ו- y: 224.92 μm, כאשר כל פיקסל בגודל 220 ננומטר 2 וקנה מידה z של 415 ננומטר.
  6. צלם תמונות הלוכדות מספר ערימות z (15-22 ערימות) מהחלק התחתון לחלק העליון של התאים. רכשו לפחות 10 תמונות מהשדה האקראי של צלחת התרבית כדי לקבל סך של ~200-300 תאים.
  7. נתח את התמונות שצולמו במצב לא מקוון כדי לזהות את ה- TNTs על-ידי ניתוח תצוגת אמצעי אחסון תלת-ממדית

6. ניתוח של תמונות z-stack קונפוקליות לזיהוי וכימות TNTs

  1. פתח את התמונות הקונפוקליות שנשמרו בתבנית נתונים .czi בתוכנת פיג'י לניתוח.
  2. בחרו באפשרות Hyperstack כדי לראות כל z-stack וכל ערוץ של התמונה. חפשו את ערימות העל של ערימות z וערוצים, שנפתחות בחלון אחד כפי שמוצג באיור 2. גלול בפסי הגלילה של הערוץ (מסומנים בחצים אדומים וירוקים) וב- z-stack (מסומן על-ידי חצים כחולים) כדי לבחור את הערימה המדויקת של ערוץ מסוים שמעניין אותך.
    הערה: בתאים קבועים, כאשר צינורות ה-TNT או הממברנה המרחפים נשארים מעל פני השטח, המבנים אינם נראים בחלקים התחתונים של ערימות z. עם זאת, בתאים קבועים, נויריטים שוכבים על פני השטח וניתנים לזיהוי בחלקים התחתונים של ערימות z (z = 0 עד 2). ראו איור 2 לשלבי הזיהוי.
  3. כפי שמוצג באיור 2, בחרו תחילה את הערוץ המוכתם ב-F-actin (מסומן בחצים אדומים) על-ידי גלילת סרגל הערוצים. לאחר מכן, גלול ידנית את ערימות z (מסומנות על-ידי חצים כחולים) כדי לראות כל ערימה בזו אחר זו. זהה את המבנים המוכתמים ב-F-actin שנראים כמחברים בין תאים, נראים בחלקים התחתונים של ערימות z, והם קרובים לפני השטח של צלחת ההדמיה (z = 2) כנוירויטים (מסומנים על ידי חיצים לבנים).
    הערה: רוב הנויריטים קלים לזיהוי מכיוון שהם מופיעים כבליטות מורחבות (מסומנות על ידי חיצים ורודים).
  4. זהה את ה-TNTs, צינורות F-actin-positive, המרחפים מתא לתא, על-ידי גלילת ערימות ה-z לכיוון החלק העליון ( מ-z = 4 באיור 2; מסומן על-ידי חצים צהובים). חפשו נויריטים ליד החלקים התחתונים של ערימות z לכיוון פני השטח ושימו לב שהם מתחילים להיעלם עם גלילה של ערימות z לכיוון החלק העליון ( ב-z = 6 באיור 2; נוריטים אינם נראים בבירור).
  5. זהה TNTs חיוביים ל-phospho-PAK1 באופן דומה ל-TNTs חיוביים ל-F-actin על-ידי ניתוח האופי המרחף של הצינורות מערימות z. מכיוון שצביעת phospho-PAK1 חלשה יותר מכתמי F-actin, חפשו TNTs מוכתמים ב-phopho-PAK1 ב-z = 4 (נראה קלוש) וב-z = 6 (בולט).
  6. יתר על כן, התבוננו בתמונות DIC כדי לוודא שמבני TNT המוכתמים ב-F-actin וב-phospho-PAK1 הם צינורות ממברנה בין תאים (איור 3). בנוסף, מזגו ערוצי F-אקטין (אדום) ו-phospho-PAK1 (ירוק) כדי לוודא שה-TNTs שזוהו הם מבנים מוכתמים במשותף של F-actin ו-phospho-PAK1 (איור 3).
  7. כדי לכמת את ה- TNTs, ספור את מספרי התאים הכוללים ואת מספרי ה- TNTs שזוהו באופן ידני וייצג את המספרים כאחוזים.
  8. כדי להבחין בין TNTs חיוביים ל-F-אקטין לבין טובולין β-III (TUBb3)-חיובי, דמויי-TNT, מתמונות z-stack, מזגו ערוצי F-actin (אדום) ו-TUBb3 (ירוק) (איור 4). לאחר מכן, נתחו את ערימות ה-z של התמונות הממוזגות.
    1. חפשו אך ורק TNTs מוכתמים ב-F-אקטין שנראים קלושים ב-z = 3 ובולטים ב-z = 6 ו-z = 9 (חצים צהובים). באופן דומה, זהה F-actin ו- β-III טובולין (TUBb3) צינורות מרחפים חיוביים כפולים, דמויי TNT ב- z = 6 ו- z = 9 (חיצי ציאן). זהה בליטות אחרות של F-actin- ו- β-III מוכתמות בטובולין, שאינן מרחפות מהחלקים התחתונים של ערימות z (חיצים לבנים).
  9. מדוד את הקוטר של TNTs באמצעות כלי הקו בפיג'י. אמת את קנה המידה על-ידי לחיצה על נתח | קבעו שינוי גודל כך ש"מרחק בפיקסלים" יוגדר אוטומטית מתמונות ה- .czi. מדוד את הקטרים של ה- TNTs במישור xy.
    הערה: רוב הקטרים הם בין פיקסל אחד ל-4 פיקסלים (כלומר, 220-880 ננומטר); כל פיקסל הוא 220 ננומטר. ראו איור 5 לסיכום הפרוטוקול לניתוח תמונות קונפוקליות של z-stack.

7.3D שחזור של תמונות z-stack לאפיון TNTs

  1. השתמש בתוסף מציג אמצעי האחסון בפיג'י, המאפשר שחזור תלת-ממדי והדמיה תלת-ממדית התומכת בסף (איור 6).
  2. פצלו את תמונות z-stack לערוצים בודדים. לאחר מכן, חתוך את תמונות z-stack של ערוץ יחיד (ערוץ F-actin) כדי להשתמש בתצוגת שחזור תלת-ממדית כדי להדגיש TNTs או נויריטים אחד או שניים בכל פעם. הפעל את תוסף תצוגת עוצמת הקול כדי להציג באופן חזותי תצוגות xy, yz ו- xz.
  3. הצמידו TNT או נויריט יחיד במישור xy (חיצים לבנים מייצגים נויריטים באיור 6A; חיצים צהובים מייצגים TNTs באיור 6B) וסימנו חתכי צירי xz (אדום) ו-yz (ירוק). שימו לב לנויריטים בתחתית מישור xz במישורי xz ו-yz (חצים לבנים, איור 6A) וב-TNTs בערימות z העליונות (חצים צהובים, איור 6B).
  4. בחר את ה-TNT או הנויריט הבודדים כדי לשחזר את תצוגת הנפח התלת-ממדית במישור xz (איור 6C, D). בשחזור התלת-ממדי, ראו את הנויריטים בתחתית מישור ה-z (חיצים לבנים, איור 6C) ואת ה-TNTs המופיעים כמבנים מרחפים המחברים בין שני תאים מבלי לגעת במישור ה-z התחתון (חצים צהובים, איור 6D).

תוצאות

כאן, אנו מזהים ומאפיינים TNTs המושרים על-ידי oAβ בתאי עצב SH-SY5Y על-ידי בניית תצוגות נפח תלת-ממדיות מתמונות z-stack קונפוקליות (איור 1). התאים קיבלו כתם חיסוני כפול עם F-אקטין ופוספו-PAK1. תמונות z-stack קונפוקליות של תאים מדוכאי חיסון נותחו כדי לזהות TNTs (איור 2). יתר על כן, תמ?...

Discussion

מספר חוקרים בשני העשורים האחרונים ניסו להבין ולאפיין את המבנה של TNTs18. היעדר סמנים ספציפיים מעכב את ההתקדמות, ויש דרישה גוברת לשיטה נוחה וסטנדרטית שניתן להשתמש בה כדי לזהות, לאפיין ולכמת TNTs. TNTs מוגדרים כצינורות ממברנה מבוססי F-actin המרחפים בין שני תאים. מחקרים הראו כי נויריטים β-?...

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

Acknowledgements

D.K.V ו- A.R מודים לאקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל על מלגת TMA Pai. אנו מודים למועצת המחקר המדעית וההנדסית של הודו עבור SERB-SRG (#SRG/2021/001315), כמו גם למועצה ההודית למחקר רפואי של הודו (#5/4-5/אד-הוק/נוירו/216/2020-NCD-I) ולקרן התוך-מורלית של האקדמיה להשכלה גבוהה של מניפל, מניפל, הודו. אנו מודים למתקן הקונפוקלי של JNCASR (מרכז ג'ווהרלל נהרו למחקר מדעי מתקדם, הודו) ול- B. Suma על המיקרוסקופיה הקונפוקלית ב- JNCASR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slipCellvisD35-14-1.5-NImaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mgAnaSpec#64129Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)InvitrogenA11070Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety CabinetThermo Scientific (MSC Advantage)51025411Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 IncubatorThermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)51026556For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning MicroscopeZEISS (Carl Zeiss)LSM 880Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]Merck8034560100Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)SigmaD9542-1MGNeuclear stainer
DMEM mediaGibco11965092Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
 DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)Gibco12500062Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture gradeCryopurCP-100Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular gradeHimediaMB058Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine SerumGibco16000044 Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)Sigma AldrichHT5014-120MLComponent in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)SigmaG5882Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solutionTCIH024Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)National Institute of Health (NIH)Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
LyophilizerChrist, Alpha2.4 LDplus0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin MixtureThermo fisher Scientific15640055Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555Abcamab176756F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]CST#2601Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)Cloud clonePAE711Hu01Primary antibody
Retinoic acidSigma-AldrichR2625-50MGDifferentiating reagent
SaponinMerck8047-15-2Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)Ultrasonic Cleaner3.0 L/3.2Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy softwareZEISS (Carl Zeiss)Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation

References

  1. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  2. Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
  3. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
  4. Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
  5. Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
  6. Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
  7. Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
  8. Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
  9. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
  10. Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
  11. Zurzolo, C. Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity. Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).
  12. Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
  13. Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
  14. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  15. Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
  16. Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
  17. Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
  18. Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
  19. Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
  20. Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
  21. Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
  22. Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
  23. Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
  24. Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
  25. Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
  26. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
  27. Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
  28. Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186p21zF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved