Detektion und Quantifizierung von tunnelnden Nanoröhren mittels 3D-Volumenansichtsbildern

Zusammenfassung

Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) sind in erster Linie offene F-Aktin-Membran-Nanoröhren, die benachbarte Zellen verbinden und die interzelluläre Kommunikation erleichtern. Das bemerkenswerte Merkmal, das TNTs von anderen Zellvorsprüngen unterscheidet, ist die schwebende Natur der Nanoröhrchen zwischen den Zellen. Hier charakterisieren wir TNTs, indem wir eine 3D-Volumenansicht von konfokalen Z-Stack-Bildern erstellen.

Zusammenfassung

Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass Zellen einen direkten, langreichweitigen interzellulären Transfer über Aktinmembrankanäle im Nanobereich durchführen, nämlich "tunnelnde Nanoröhren" (TNTs). TNTs sind definiert als offene, lipid-doppelschichtige Membranverlängerungen, die die Kontinuität zwischen benachbarten Zellen mit Durchmessern zwischen 50 nm und 1 μm vermitteln. TNTs wurden zunächst in neuronalen Zellen nachgewiesen, aber aufeinanderfolgende Studien haben die Existenz von TNTs in verschiedenen Zelltypen und Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, Virusinfektionen und Krebs gezeigt. Mehrere Studien haben sich auf geschlossene, elektrisch gekoppelte Membran-Nanostrukturen zwischen benachbarten Zellen als TNTs oder TNT-ähnliche Strukturen bezogen.

Die Aufklärung der Ultrastruktur in Bezug auf die Membrankontinuität am Endpunkt ist technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus sind Studien zur Zell-Zell-Kommunikation aufgrund des Fehlens spezifischer Marker eine Herausforderung hinsichtlich der Charakterisierung von TNTs mit herkömmlichen Methoden. TNTs werden in erster Linie als F-Aktin-basierte, offene Membranvorsprünge definiert. Eine wesentliche Einschränkung ist jedoch, dass F-Aktin in allen Arten von Vorsprüngen vorhanden ist, was es schwierig macht, TNTs von anderen Vorsprüngen zu unterscheiden. Eine der bemerkenswerten Eigenschaften von F-Aktin-basierten TNTs ist, dass diese Strukturen zwischen zwei Zellen schweben, ohne das Substrat zu berühren. Daher können unterschiedliche F-Aktin-gefärbte TNTs bequem von anderen Vorsprüngen wie Filopodien und Neuriten unterschieden werden, basierend auf ihrem Schweben zwischen den Zellen.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Internalisierung von oligomerem Amyloid-β_1-42 (oAβ) über Aktin-abhängige Endozytose die aktivierte p21-aktivierte Kinase-1 (PAK1) stimuliert, die die Bildung von F-Aktin-haltigen TNTs vermittelt, die mit Phospho-PAK1 zwischen SH-SY5Y-neuronalen Zellen koexprimiert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Volumenanalysemethode zur Identifizierung und Charakterisierung von TNTs aus den aufgenommenen z-Stack-Bildern von F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten Membranvorsprüngen in oAβ-behandelten neuronalen Zellen. Darüber hinaus unterscheiden sich TNTs von der Entwicklung von Neuriten und neuronalen Auswüchsen auf Basis von F-Aktin- und β-III-Tubulin-immungefärbten Membranleitungen.

Einleitung

Tunneling Nanotubes (TNTs) sind F-Aktin-basierte, hauptsächlich offene Membrankanäle und spielen eine wichtige Rolle beim interzellulären Transfer von Fracht und Organellen¹. Das einzigartige Merkmal von TNTs ist, dass sie benachbarte Zellen ohne Kontakt mit dem Substrat verbinden; Sie sind über 10-300 μm lang und ihre Durchmesser variieren zwischen 50 nm und 1 μm ^2,3. TNTs sind vorübergehende Strukturen, und ihre Lebensdauer dauert zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden. TNTs wurden erstmals in PC12-Nervenzellen nachgewiesen¹; Später zeigten zahlreiche Studien ihre Existenz in mehreren Zelltypen in vitro und in vivo ^4,5. Mehrere Studien haben die pathologische Bedeutung von TNTs in verschiedenen Krankheitsmodellen wie neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen gezeigt ^6,7,8.

Die strukturellen Heterogenitäten von TNTs wurden durch mehrere Studien in verschiedenen zellulären Systemen nachgewiesen⁹. Die Unterschiede beruhen auf der Zusammensetzung des Zytoskeletts, dem Mechanismus der Bildung und den übertragenen Frachttypen¹⁰. In erster Linie wird angenommen, dass die offene, F-Aktin-positive Membrankontinuität, die zwischen zwei benachbarten Zellen schwebt und Organellen überträgt, aus TNTs¹¹ besteht. Der Mangel an Klarheit oder Vielfalt, der bei der Bildung von TNTs beobachtet wird, trägt jedoch zur Schwierigkeit bei der Entwicklung von TNT-spezifischen Markern bei. Daher ist es schwierig, TNT-Strukturen mit herkömmlichen Detektionsmethoden zu identifizieren und Membrannanoröhren in Bezug auf offene und geschlossene Vorsprünge zu unterscheiden¹². Die Eigenschaft von TNTs, als F-Aktin-Membranvorsprünge zwischen zwei Zellen zu schweben, ist jedoch mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren relativ einfacher und praktikabler zu identifizieren. Andere Aktin-basierte zelluläre Vorsprünge wie Filopodien und dorsale Filopodien können nicht zwischen zwei entfernten Zellen schweben, insbesondere wenn Zellen fixiert sind. Bemerkenswert ist, dass geschlossene, elektrisch gekoppelte, sich entwickelnde Neuriten oft als TNT-ähnliche Strukturen bezeichnet^{werden 13}.

Es ist bekannt, dass F-Aktin eine wichtige Rolle bei der TNT-Bildung spielt, und mehrere Studien haben gezeigt, dass der F-Aktin-Inhibitor Cytochalasin D die Bildung von TNTs^14,15 hemmt. Im Gegensatz dazu haben Inhibitoren von Mikrotubuli keinen Einfluss auf die TNT-Bildung¹⁶. In den letzten 2 Jahrzehnten gab es mehrere Berichte über die bedeutende Rolle, die TNTs bei der Ausbreitung von Pathologie und Tumorresistenz und Therapie spielen¹⁷. Daher gibt es eine nie endende Nachfrage nach besseren Techniken zur TNT-Charakterisierung.

Das Fehlen spezifischer TNT-Marker und die Vielfalt in Morphologie und Zusammensetzung des Zytoskeletts erschweren die Entwicklung einer einzigartigen Charakterisierungsmethode. Einige Studien haben automatisierte Bilderkennungs- und TNT-Quantifizierungstechniken verwendet^18,19. Es gibt jedoch mehrere Vorteile der derzeitigen manuellen 3D-Volumenanalysemethode gegenüber der automatischen Bildanalyse zur Detektion und Quantifizierung von TNTs. Oft können geschulte menschliche Augen diese schwebenden Nanostrukturen leichter erkennen als eine automatisierte Bilddetektionsmethode. Darüber hinaus könnten automatische Nachweismethoden in Laboratorien ohne Algorithmus-Know-how schwierig zu implementieren sein. Die vorliegende Methode könnte aufgrund ihrer Präzision und Reproduzierbarkeit von Forschern weitgehend übernommen werden.

In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass oAβ die Biogenese von TNTs in neuronalen Zellen über einen PAK1-vermittelten, Aktin-abhängigen Endozytose-Mechanismus fördert¹². oAβ-induzierte TNTs exprimieren auch aktiviertes PAK1 (oder Phospho-PAK1). Wir entwickelten eine 3D-Volumenansichts-Bildrekonstruktionsmethode zur Unterscheidung von oAβ-induzierten, F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten TNTs. β-III-Tubulin-positive, sich entwickelnde Neuriten ähneln oft TNT-ähnlichen schwebenden Strukturen²⁰. Daher unterschieden wir F-Actin-basierte TNTs weiter von β-III-Tubulin-positiven Neuriten und anderen TNT-ähnlichen Vorsprüngen. 3D-Volumenansichtsbilder wurden verwendet, um TNTs anhand ihrer Eigenschaften zu identifizieren, über dem Substrat zu schweben und zwischen zwei benachbarten Zellen verbunden zu bleiben. Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung und Detektion von Aktin-haltigen Membrankanälen oder TNTs unter Verwendung konfokaler Z-Stack-Bilder und schließlich die manuelle Quantifizierung der identifizierten Strukturen aus 3D-Volumenansichtsrekonstruktionsbildern. Das vorgestellte Verfahren kann keine offenen TNTs von geschlossenen TNT-ähnlichen Strukturen unterscheiden; Diese Methode hilft, TNTs in In-vitro-2D-Zellkultur auf einem flachen Substrat zu identifizieren. Die Methode ist jedoch einfach zu implementieren und zu reproduzieren und kann weit verbreitet sein, um nur Aktin-basierte TNTs genau zu quantifizieren und sie von Neuriten und β-Tubulin-positiven TNT-ähnlichen Strukturen zu unterscheiden.

Protokoll

HINWEIS: SH-SY5Y-Zellen, die in DMEM/F-12-Medien kultiviert wurden, wurden 7 Tage lang mit 10 μM Retinsäure differenziert und 2 h lang bei 37 °C (5%_CO2) mit 1 μM oAβ-Oligomeren behandelt. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit Karnovskys Fixierlösung fixiert und mit Phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) Antikörper und F-Aktin-bindendem Phalloidin doppelt immungefärbt. Später wurden konfokale Z-Stack-Bilder mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Die TNTs wurden durch manuelle Zählung quantifiziert und von anderen Neuriten/Zellvorsprüngen unterschieden, indem 3D-Volumenansichtsbilder erstellt und die Strukturen anhand ihrer Eigenschaft identifiziert wurden, zwischen zwei Zellen zu schweben, ohne das Substrat zu berühren (Abbildung 1).

1. Zellkultur und Differenzierung

1. Kultur der SH-SY5Y neuronalen Zellen in DMEM/F12 (Ham's) Medien 1:1 mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin-Neomycin-Mischung (PSN). Säen Sie die Zellen in einer 35-mm-Bildschale mit einem 14-mm-Brunnen, der aus einem # 1,5-Deckglas in der Mitte der am Boden befestigten Schale besteht. Säen Sie die Zellen auf der bildgebenden Schale in einer Konzentration von 12.000 Zellen /^cm2 und führen Sie die Experimente bei 60% -70% Konfluenz durch.
2. Die Zellen werden teilweise mit 10 μM Retinsäure (RA) von einer 100 mM Stammlösung (5 mg RA in 15 mL Dimethylsulfoxid [DMSO]) unterschieden. Dann inkubieren Sie die Zellen für 7 Tage bei 37 ° C (5% CO 2) zur Differenzierung mit Medienwechsel alle₂ Tage.
   HINWEIS: Seien Sie vorsichtig bei der Aufrechterhaltung des Konfluenzes (60% -70%) der Zellen (sowohl undifferenzierte als auch teilweise differenzierte Zellen). Die Zelldichte kann die Bildung von TNTs zwischen den Zellen beeinflussen.

2. Herstellung von Oligomeren aus Amyloid-β_1-42 (oAβ) zur Behandlung neuronaler Zellen

1. Aβ _1-42 (1 mg) wird in 200 μL 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol gelöst und die Lösung in 20 Aliquots aufgeteilt, die jeweils 0,05 mg Peptide enthalten. Lyophilisieren und lagern Sie die Aliquots bei −20 °C für die spätere Verwendung.
2. Die Stammlösung (5 mM) des lyophilisierten Aβ _1-42 in DMSO wird durch Zugabe von 2,2 μL DMSO zu 0,05 mg lyophilisiertem Peptid hergestellt. Um die Peptide vorsichtig aufzulösen, wirbeln Sie die Lösung vor und beschallen Sie sie für 2 Minuten in einem Wasserbad-Ultraschallgerät.
3. Die Stammlösung wird auf eine Konzentration von 100 μM in DMEM, pH 7,4 und Wirbel verdünnt, um die Peptide in Monomere umzuwandeln, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C für 24 h, um Oligomere von Aβ _1-42 (oAβ)^12,21,22 zu erhalten.
4. Charakterisierung von oAβ vor den zuvor berichteten^{Experimenten 21,22} durch Transmissionselektronenmikroskopie-Bildgebung.
5. Behandeln Sie die teildifferenzierten SH-SY5Y-Zellen mit 1 μM oAβ. Entfernen Sie das Medium vor den Behandlungen und fügen Sie frisches FBS-freies DMEM hinzu. Nach dem Mediumwechsel wird dem Medium zuvor hergestelltes oAβ (100 μM) bis zu einer Endkonzentration von 1 μM zugegeben. Die Zellen mit 1 μM oAβ für 2 h bei 37 °C (5%_CO2) inkubieren. Schließen Sie eine Negativkontrolle in Form von unbehandelten Zellen ein.

3. Immunfärbung von F-Aktin und aktiviertem PAK1 zur Charakterisierung von TNTs

1. Führen Sie eine differentielle Immunfärbung durch, indem Sie Phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402)-Antikörper und F-Aktin-bindendes Phallotoxin Phalloidin verwenden.
2. Waschen Sie die Kontroll- und oAβ-behandelten Zellen vor der Fixierung 2 x 2 min lang mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Karnovsky-Fixierlösung wird unter Verwendung von 2% Formalinfixiermittel und 2,5% Glutaraldehyd, gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, hergestellt. Fixieren Sie dann die Zellen in der Bildgebungsschale, indem Sie Karnovskys Fixierlösung (gerade genug, um die Zellen zu bedecken) für 45 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen.
3. Waschen Sie die fixierten Zellen 2 x 2 min mit Inkubationspuffer. Bereiten Sie den Inkubationspuffer (20x) vor, indem Sie 0,1 g Saponin in 5 ml FBS auflösen und durch Zugabe von 95 ml 1x PBS auf 1x verdünnen.
4. Nach der Fixierung den ersten Antikörper gegen Phopho-PAK1 in einer Verdünnung von 1:250 in den Inkubationspuffer geben und über Nacht bei 4 °C in einer dunklen feuchten Kammer inkubieren.
5. Am nächsten Tag, nach 24 h Inkubation, waschen Sie die Zellen 2 x 2 min mit dem Inkubationspuffer; Fügen Sie dann sekundäre Antikörper hinzu, die an Alexa Fluor 488 (1:1.000 Verdünnung) und Phalloidin 555 (1:1.000 Verdünnung) konjugiert sind. Inkubieren Sie die Zellen in der dunklen feuchten Kammer für 1,5 h bei Raumtemperatur.
6. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen 2 x 2 min mit Inkubationspuffer. Färben Sie den Zellkern durch Zugabe von 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Verdünnung von 1:2.000 und inkubieren Sie für 5 min bis 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. Bereiten Sie das DABCO-Montagemedium mit 25 mg DABCO in 90% Glycerin und 10% 1x PBS vor. Um sich richtig aufzulösen, stellen Sie den pH-Wert mit spektrophotometrischer Qualität auf 8,6 ein, verdünnen Sie HCl (verdünnt 1:20 mit Wasser) und halten Sie die Lösung zum Mischen auf einer Wippe.
8. Als Anti-Bleichmittel geben Sie das DABCO-Montagemedium direkt auf die Bildschale mit dem Deckglas an der Unterseite. Warten Sie mindestens 1-2 Stunden und fahren Sie direkt mit der konfokalen Bildgebung fort.
   HINWEIS: Es sind keine Klebstoffe erforderlich, um die Deckgläser zu fixieren.

4. Immunfärbung von F-Aktin und β-III-Tubulin zur Unterscheidung von TNTs von Neuriten

1. Führen Sie eine differentielle Immunfärbung mit β-III-Tubulin-Antikörper und F-Aktin-bindendem Phallotoxin Phalloidin durch.
2. Waschen Sie die oAβ-behandelten Zellen 2x mit 1x PBS, bevor Sie Karnovskys Fixierlösung hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen für 45 min bei Raumtemperatur und waschen Sie die Zellen 2 x 2 min mit Inkubationspuffer.
3. Nach der Fixierung den Antikörper gegen β-III-Tubulin (TUBb3) in einer Verdünnung von 1:250 in den Inkubationspuffer geben und bei 4 °C über Nacht in der dunklen Feuchtkammer inkubieren.
4. Am nächsten Tag waschen Sie die Zellen mit Inkubationspuffer (2 x 2 min) und fügen sekundäre Antikörper, die an Alexa Fluor 488 (1:1.000 Verdünnung) und Phalloidin 555 (1:1.000 Verdünnung) konjugiert sind, zusammen in dieselbe Schale hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen für 1,5 h bei Raumtemperatur in der dunklen feuchten Kammer.
5. Waschen Sie die Zellen 2x mit Inkubationspuffer und fügen Sie nuklear färbende DAPI in einer Verdünnung von 1:2.000 für 5-10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzu.
6. Fügen Sie das Anti-Bleichmittel DABCO wie oben erwähnt in Montagemedium hinzu und warten Sie 2 Stunden vor der Bildgebung.

5. Bildgebung mit konfokaler Mikroskopie

1. Um TNTs zu identifizieren, erfassen Sie Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Nehmen Sie die Bilder mit einem 40x/1,40 Öl-DIC-Objektiv mit DAPI, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrhodamin (TRITC) Filtersets auf.
2. Wählen Sie zunächst die Kanäle aus, indem Sie die gewünschten Laser nacheinander in den Fenstern Spur 1, Spur 2 und Spur 3 in der konfokalen Software anklicken. Klicken Sie auf die Option T-PMT unter dem Fenster Spur 1 , um die DIC-Bilder (Differential Interference Contrast) mit Fluoreszenzkanälen aufzunehmen.
   HINWEIS: DIC-Bilder werden von einem anderen Detektor aufgenommen, der als T-PMT bezeichnet wird.
3. Wählen Sie die Registerkarte Erfassung der Software, klicken Sie auf die Registerkarte Z-Stack und warten Sie, bis sich ein Fenster öffnet. Klicken Sie dann auf Live-Scan, um die Zellen am unteren Rand der Schale zu fokussieren. Wählen Sie dieses fokussierte Bild als ersten Stapel aus. Fokussieren Sie sich dann, um den obersten Teil der Zelle zu sehen, und wählen Sie diesen als letzten Stapel aus. Stoppen Sie den Live-Scan und klicken Sie auf die Zahl neben der optimalen Registerkarte, um die Schrittweite der Stapel zu korrigieren. Die Schrittweite bestimmt die Anzahl der Slices und die Intervalle basierend auf der Dicke der Zellen.
   HINWEIS: Die Schrittgröße wird basierend auf der Nyquist-Stichprobe ausgewählt, um genügend Scheiben aufzunehmen und sicherzustellen, dass keine Lücken zwischen den beiden Stapeln vorhanden sind. Die Nyquist-Probenahme wird anhand des Objektivs und der Wellenlängen der Lichter^{bestimmt 23}.
4. Nehmen Sie sequenzielle Bilder von drei Kanälen von DAPI, FITC und TRITC mit 405 nm, 488 nm und 561 nm Lasern auf und erfassen Sie sie mit einer Pixelverweilzeit von 1,02 μs. Nehmen Sie Bilder im DIC-Kanal mit Fluoreszenzkanälen auf, um die Zellgrenze zu beobachten.
5. Nehmen Sie einen Stapel von Bildern mit den Abmessungen x: 224,92 μm und y: 224,92 μm auf, wobei jedes Pixel eine Größe von 220 nm ² und eine Z-Skalierung von 415 nm aufweist.
6. Nehmen Sie Bilder auf, die mehrere Z-Stacks (15-22 Stacks) von unten nach oben in den Zellen erfassen. Nehmen Sie mindestens 10 Bilder aus dem zufälligen Feld der Kulturschale auf, um insgesamt ~ 200-300 Zellen zu erhalten.
7. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder offline, um die TNTs durch 3D-Volumenansichtsanalyse zu identifizieren

6. Analyse von konfokalen Z-Stack-Bildern zur Identifizierung und Quantifizierung von TNTs

1. Öffnen Sie die im .czi-Datenformat gespeicherten konfokalen Bilder zur Analyse in der Fidschi-Software.
2. Wählen Sie die Option Hyperstack aus, um jeden Z-Stack und Kanal des Bildes anzuzeigen. Suchen Sie nach den Hyperstacks der Z-Stacks und Kanäle, die in einem einzigen Fenster geöffnet werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Scrollen Sie durch die Bildlaufleisten des Kanals (gekennzeichnet durch rote und grüne Pfeile) und des Z-Stacks (gekennzeichnet durch blaue Pfeile), um den genauen Stapel eines bestimmten Kanals von Interesse auszuwählen.
   HINWEIS: In festen Zellen, da die schwebenden TNTs oder Membranleitungen über der Oberfläche bleiben, sind die Strukturen in den unteren Teilen der Z-Stacks nicht sichtbar. In fixierten Zellen liegen Neuriten jedoch auf der Oberfläche und sind in den unteren Teilen der z-Stacks nachweisbar (z = 0 bis 2). Die Identifizierungsschritte finden Sie in Abbildung 2 .
3. Wie in Abbildung 2 dargestellt, wählen Sie zuerst den F-Aktin-gefärbten Kanal (gekennzeichnet durch rote Pfeile) aus, indem Sie auf der Kanalleiste einen Bildlauf durchführen. Scrollen Sie dann manuell durch die Z-Stacks (gekennzeichnet durch blaue Pfeile), um jeden Stack einzeln zu sehen. Identifizieren Sie die F-Aktin-gefärbten Strukturen, die Zellen zu verbinden scheinen, in den unteren Teilen der Z-Stapel sichtbar sind und sich nahe der Oberfläche der Bildschale (z = 2) als Neuriten befinden (gekennzeichnet durch weiße Pfeile).
   HINWEIS: Die meisten Neuriten sind leicht zu identifizieren, da sie als ausgedehnte Vorsprünge erscheinen (gekennzeichnet durch rosa Pfeile).
4. Identifizieren Sie die TNTs, die F-Aktin-positiven, schwebenden Zell-zu-Zell-Conduits, indem Sie die Z-Stacks nach oben scrollen (von z = 4 in Abbildung 2; gekennzeichnet durch gelbe Pfeile). Suchen Sie nach Neuriten in der Nähe der unteren Teile der Z-Stacks zur Oberfläche und beobachten Sie, dass sie mit dem Scrollen von Z-Stacks nach oben verschwinden (bei z = 6 in Abbildung 2; Neuriten sind nicht deutlich sichtbar).
5. Identifizieren Sie Phospho-PAK1-positive TNTs ähnlich wie F-Actin-positive TNTs, indem Sie die schwebende Natur der Leitungen aus den Z-Stacks analysieren. Da die Phospho-PAK1-Färbung schwächer ist als die F-Aktin-Färbung, suchen Sie nach Phopho-PAK1-gefärbten TNTs bei z = 4 (schwach sichtbar) und bei z = 6 (prominent).
6. Beobachten Sie außerdem die DIC-Bilder, um zu überprüfen, ob die F-Aktin- und Phospho-PAK1-gefärbten TNT-Strukturen Membranleitungen zwischen Zellen sind (Abbildung 3). Darüber hinaus werden F-Aktin- (rot) und Phospho-PAK1-Kanäle (grün) zusammengeführt, um zu überprüfen, ob es sich bei den identifizierten TNTs um F-Aktin- und Phospho-PAK1-co-gefärbte Strukturen handelt (Abbildung 3).
7. Um die TNTs zu quantifizieren, zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen und die identifizierten TNTs manuell und stellen Sie die Zahlen als Prozentsätze dar.
8. Um F-Aktin-positive TNTs und β-III-Tubulin (TUBb3)-positive, TNT-ähnliche schwebende Kanäle von Z-Stack-Bildern zu unterscheiden, verschmelzen F-Aktin- (rot) und TUBb3-Kanäle (grün) (Abbildung 4). Analysieren Sie dann die Z-Stacks der zusammengeführten Bilder.
   1. Suchen Sie nach ausschließlich F-Aktin-gefärbten TNTs, die bei z = 3 schwach sichtbar und bei z = 6 und z = 9 auffällig sind (gelbe Pfeile). In ähnlicher Weise identifizieren Sie F-Aktin und β-III-Tubulin (TUBb3) doppelpositive, TNT-ähnliche schwebende Kanäle bei z = 6 und z = 9 (Cyanpfeile). Identifizieren Sie andere F-Actin- und β-III-Tubulin-gefärbte, nicht schwebende Vorsprünge aus den unteren Teilen der Z-Stapel (weiße Pfeile).
9. Messen Sie den Durchmesser der TNTs mit dem Linienwerkzeug in Fidschi. Überprüfen Sie die Messskala, indem Sie auf Analyze | Legen Sie Skalieren so fest , dass "Abstand in Pixeln" automatisch aus den CZI-Bildern festgelegt wird. Messen Sie die Durchmesser der TNTs in der xy-Ebene.
   HINWEIS: Die meisten Durchmesser liegen zwischen 1 Pixel und 4 Pixel (dh 220-880 nm); Jedes Pixel ist 220 nm groß. In Abbildung 5 finden Sie eine Zusammenfassung des Protokolls für die Analyse konfokaler Z-Stack-Bilder.

7.3D Rekonstruktion von Z-Stack-Bildern zur Charakterisierung von TNTs

1. Verwenden Sie das Volume Viewer-Plug-in in Fidschi, das 3D-Relicing und schwellenwertaktivierte 3D-Visualisierung ermöglicht (Abbildung 6).
2. Teilen Sie die Z-Stack-Bilder in einzelne Kanäle auf. Schneiden Sie dann die einkanaligen (F-Aktin-Kanal) Z-Stack-Bilder zu, um die 3D-Rekonstruktionsansicht zu verwenden, um ein oder zwei TNTs oder Neuriten gleichzeitig hervorzuheben. Aktivieren Sie das Volume View-Plug-In, um xy-, yz- und xz-Ansichten zu visualisieren.
3. Heften Sie ein einzelnes TNT oder Neurit in die xy-Ebene (weiße Pfeile stellen Neuriten in Abbildung 6A dar; gelbe Pfeile stellen TNTs in Abbildung 6B dar) und markieren Sie xz (rot) und yz (grün) Achsenquerschnitte. Beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der xz-Ebene in den xz- und yz-Ebenen (weiße Pfeile, Abbildung 6A) und die TNTs in den oberen z-Stapeln (gelbe Pfeile, Abbildung 6B).
4. Wählen Sie den einzelnen TNT oder Neuriten aus, um die 3D-Volumenansicht in der xz-Ebene zu rekonstruieren (Abbildung 6C, D). In der 3D-Rekonstruktion beobachten Sie die Neuriten am unteren Rand der z-Ebene (weiße Pfeile, Abbildung 6C) und die TNTs, die als schwebende Strukturen erscheinen, die zwei Zellen verbinden, ohne die untere z-Ebene zu berühren (gelbe Pfeile, Abbildung 6D).

Ergebnisse

Hier identifizieren und charakterisieren wir oAβ-induzierte TNTs in SH-SY5Y-neuronalen Zellen, indem wir 3D-Volumenansichten aus konfokalen z-Stack-Bildern konstruieren (Abbildung 1). Die Zellen wurden mit F-Aktin und Phospho-PAK1 doppelt immungefärbt. Konfokale Z-Stack-Bilder von immungefärbten Zellen wurden analysiert, um TNTs zu identifizieren (Abbildung 2). Darüber hinaus wurden DIC-Bilder analysiert, um zu verifizieren, dass die F-Aktin- und Phospho-PAK...

Diskussion

Mehrere Forscher haben in den letzten 2 Jahrzehnten versucht, die Struktur von TNTs¹⁸ zu verstehen und zu charakterisieren. Das Fehlen spezifischer Marker behindert den Fortschritt, und es besteht eine zunehmende Nachfrage nach einer praktischen, standardisierten Methode, mit der TNTs identifiziert, charakterisiert und quantifiziert werden können. TNTs sind definiert als F-Aktin-basierte Membranleitungen, die zwischen zwei Zellen schweben. Studien haben gezeigt, dass β-Tubulin-positive, geschlos...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation