3D Hacim Görünümü Görüntüleri Kullanarak Tünelleme Nanotüplerinin Tespiti ve Niceliği

Özet

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) öncelikle komşu hücreleri birbirine bağlayan ve hücreler arası iletişimi kolaylaştıran açık uçlu F-aktin membran nanotüpleridir. TNT'leri diğer hücre çıkıntılarından ayıran göze çarpan özellik, nanotüplerin hücreler arasında gezinen doğasıdır. Burada, TNT'leri konfokal z-yığın görüntülerinin 3B hacim görünümünü oluşturarak karakterize ediyoruz.

Özet

Son keşifler, hücrelerin nano ölçekli, aktin-membran kanalları, yani "tünelleme nanotüpleri" (TNT'ler) yoluyla doğrudan, uzun menzilli, hücreler arası transfer gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur. TNT'ler, 50 nm ile 1 μm arasında değişen çaplardaki komşu hücreler arasında sürekliliğe aracılık eden açık uçlu, lipid çift katmanlı kuşatılmış membran uzantıları olarak tanımlanmaktadır. TNT'ler başlangıçta nöronal hücrelerde gösterilmiştir, ancak birbirini izleyen çalışmalar, nörodejeneratif hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi çeşitli hücre tiplerinde ve hastalıklarında TNT'lerin varlığını ortaya koymuştur. Birçok çalışma, komşu hücreler arasındaki yakın uçlu, elektriksel olarak bağlanmış membran nanoyapılarına TNT'ler veya TNT benzeri yapılar olarak atıfta bulunmuştur.

Ultrayapının uç noktadaki membran sürekliliği açısından aydınlatılması teknik olarak zordur. Ayrıca hücre-hücre iletişimi üzerine yapılan çalışmalar, spesifik belirteçlerin bulunmaması nedeniyle TNT'lerin konvansiyonel yöntemler kullanılarak karakterizasyonu açısından zordur. TNT'ler öncelikle F-aktin bazlı, açık uçlu membran çıkıntıları olarak tanımlanır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, F-aktin'in her türlü çıkıntıda mevcut olmasıdır ve TNT'leri diğer çıkıntılardan ayırt etmeyi zorlaştırır. F-aktin bazlı TNT'lerin göze çarpan özelliklerinden biri, bu yapıların substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinmesidir. Bu nedenle, farklı F-aktin boyalı TNT'ler, hücreler arasında gezinmelerine bağlı olarak filopodia ve nöritler gibi diğer çıkıntılardan, kolayca ayırt edilebilir.

Son zamanlarda, oligomerik amiloid β 1-42'nin (oAβ) aktin bağımlı endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, SH-SY5Y nöronal hücreleri arasında fosfo-PAK1 ile birlikte eksprese edilen F-aktin içeren TNT'lerin oluşumuna aracılık eden aktif p21-aktive_kinaz-1'i (PAK1) uyardığını gösterdik. Bu protokol, oAβ ile tedavi edilen nöronal hücrelerde F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı membran çıkıntılarının yakalanan z-yığın görüntülerinden TNT'leri tanımlamak ve karakterize etmek için bir 3D hacim analizi yöntemini özetlemektedir. Ayrıca, TNT'ler, F-aktin ve β-III tübülin-immünoboyalı membran kanallarına dayanan nöritler ve nöronal çıkıntılar geliştirmekten ayırt edilir.

Giriş

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) F-aktin bazlı, öncelikle açık uçlu membran kanallarıdır ve kargo ve organellerin hücreler arası transferinde hayati bir rol oynarlar¹. TNT'lerin benzersiz özelliği, komşu hücreleri substratla herhangi bir temas olmadan bağlamalarıdır; uzunlukları 10-300 μm'nin üzerindedir ve çapları 50 nm ila 1 μm ^2,3 arasında değişmektedir. TNT'ler geçici yapılardır ve ömürleri birkaç dakika ila birkaç saat arasında sürer. TNT'ler ilk olarak PC12 nöronal hücrelerinde^{gösterilmiştir 1}; Daha sonra, çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo....

Protokol

NOT: DMEM/F-12 ortamında kültürlenen SH-SY5Y hücreleri 7 gün boyunca 10 μM retinoik asit ile farklılaştırıldı ve 37 °C'de (% 5 CO_{2) 2} saat boyunca 1 μM oAβ oligomerleri ile muamele edildi. Tedaviden sonra, hücreler Karnovsky'nin fiksatif çözeltisi ile sabitlendi ve fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı faloidin ile çift immüno-boyandı. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak konfokal z-stack görüntüleri alındı. TNT'ler manuel sayımla ölçüldü ve 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak ve yapıları substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerinden tanımlayarak diğer nöritlerden / hücre çıkıntıları....

Sonuçlar

Burada, SH-SY5Y nöronal hücrelerinde oAβ kaynaklı TNT'leri, konfokal z-yığın görüntülerinden 3D hacim görünümleri oluşturarak tanımlamakta ve karakterize ediyoruz (Şekil 1). Hücreler F-aktin ve fosfo-PAK1 ile çift immün boyandı. İmmünoboyalı hücrelerin konfokal z-stack görüntüleri TNT'leri tanımlamak için analiz edildi (Şekil 2). Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları oldu?.......

Tartışmalar

Son 2 yılda birçok araştırmacı TNT'lerin yapısını anlamaya ve karakterize etmeye çalışıyor¹⁸. Spesifik belirteçlerin eksikliği ilerlemeyi engeller ve TNT'leri tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabilecek uygun, standartlaştırılmış bir yönteme olan talep artmaktadır. TNT'ler, iki hücre arasında gezinen F-aktin bazlı membran kanalları olarak tanımlanır. Çalışmalar, β-tübülin-pozitif, yakın uçlu, gelişmekte olan nöritlerin iki uzak hücre ara.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation