3D Hacim Görünümü Görüntüleri Kullanarak Tünelleme Nanotüplerinin Tespiti ve Niceliği

Özet

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) öncelikle komşu hücreleri birbirine bağlayan ve hücreler arası iletişimi kolaylaştıran açık uçlu F-aktin membran nanotüpleridir. TNT'leri diğer hücre çıkıntılarından ayıran göze çarpan özellik, nanotüplerin hücreler arasında gezinen doğasıdır. Burada, TNT'leri konfokal z-yığın görüntülerinin 3B hacim görünümünü oluşturarak karakterize ediyoruz.

Özet

Son keşifler, hücrelerin nano ölçekli, aktin-membran kanalları, yani "tünelleme nanotüpleri" (TNT'ler) yoluyla doğrudan, uzun menzilli, hücreler arası transfer gerçekleştirdiğini ortaya koymuştur. TNT'ler, 50 nm ile 1 μm arasında değişen çaplardaki komşu hücreler arasında sürekliliğe aracılık eden açık uçlu, lipid çift katmanlı kuşatılmış membran uzantıları olarak tanımlanmaktadır. TNT'ler başlangıçta nöronal hücrelerde gösterilmiştir, ancak birbirini izleyen çalışmalar, nörodejeneratif hastalıklar, viral enfeksiyonlar ve kanser gibi çeşitli hücre tiplerinde ve hastalıklarında TNT'lerin varlığını ortaya koymuştur. Birçok çalışma, komşu hücreler arasındaki yakın uçlu, elektriksel olarak bağlanmış membran nanoyapılarına TNT'ler veya TNT benzeri yapılar olarak atıfta bulunmuştur.

Ultrayapının uç noktadaki membran sürekliliği açısından aydınlatılması teknik olarak zordur. Ayrıca hücre-hücre iletişimi üzerine yapılan çalışmalar, spesifik belirteçlerin bulunmaması nedeniyle TNT'lerin konvansiyonel yöntemler kullanılarak karakterizasyonu açısından zordur. TNT'ler öncelikle F-aktin bazlı, açık uçlu membran çıkıntıları olarak tanımlanır. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, F-aktin'in her türlü çıkıntıda mevcut olmasıdır ve TNT'leri diğer çıkıntılardan ayırt etmeyi zorlaştırır. F-aktin bazlı TNT'lerin göze çarpan özelliklerinden biri, bu yapıların substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinmesidir. Bu nedenle, farklı F-aktin boyalı TNT'ler, hücreler arasında gezinmelerine bağlı olarak filopodia ve nöritler gibi diğer çıkıntılardan, kolayca ayırt edilebilir.

Son zamanlarda, oligomerik amiloid β 1-42'nin (oAβ) aktin bağımlı endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, SH-SY5Y nöronal hücreleri arasında fosfo-PAK1 ile birlikte eksprese edilen F-aktin içeren TNT'lerin oluşumuna aracılık eden aktif p21-aktive_kinaz-1'i (PAK1) uyardığını gösterdik. Bu protokol, oAβ ile tedavi edilen nöronal hücrelerde F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı membran çıkıntılarının yakalanan z-yığın görüntülerinden TNT'leri tanımlamak ve karakterize etmek için bir 3D hacim analizi yöntemini özetlemektedir. Ayrıca, TNT'ler, F-aktin ve β-III tübülin-immünoboyalı membran kanallarına dayanan nöritler ve nöronal çıkıntılar geliştirmekten ayırt edilir.

Giriş

Tünelleme nanotüpleri (TNT'ler) F-aktin bazlı, öncelikle açık uçlu membran kanallarıdır ve kargo ve organellerin hücreler arası transferinde hayati bir rol oynarlar¹. TNT'lerin benzersiz özelliği, komşu hücreleri substratla herhangi bir temas olmadan bağlamalarıdır; uzunlukları 10-300 μm'nin üzerindedir ve çapları 50 nm ila 1 μm ^2,3 arasında değişmektedir. TNT'ler geçici yapılardır ve ömürleri birkaç dakika ila birkaç saat arasında sürer. TNT'ler ilk olarak PC12 nöronal hücrelerinde^{gösterilmiştir 1}; Daha sonra, çok sayıda çalışma, in vitro ve in vivo ^4,5 çeşitli hücre tiplerinde varlıklarını göstermiştir. Birçok çalışma, nörodejeneratif hastalıklar, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalık modellerinde TNT'lerin patolojik önemini ortaya koymuştur ^6,7,8.

TNT'lerin yapısal heterojenlikleri çeşitli hücresel sistemlerde yapılan çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir⁹. Farklılıklar sitoiskelet bileşimine, oluşum mekanizmasına ve¹⁰ aktarılan kargo tiplerine dayanmaktadır. Öncelikle, iki komşu hücre arasında gezinen ve organelleri transfer eden açık uçlu, F-aktin-pozitif membran sürekliliğinin TNT'lerden oluştuğu düşünülmektedir¹¹. Bununla birlikte, TNT'lerin oluşumunda gözlenen netlik veya çeşitlilik eksikliği, TNT'ye özgü belirteçlerin geliştirilmesindeki zorluğu arttırmaktadır. Bu nedenle, TNT yapılarını geleneksel tespit yöntemleriyle tanımlamak ve membran nanotüplerini açık uçlu ve kapalı uçlu çıkıntılar açısından ayırt etmek zordur¹². Bununla birlikte, TNT'lerin iki hücre arasında F-aktin membran çıkıntıları olarak gezinme özelliği, geleneksel görüntüleme teknikleri kullanılarak tanımlanması nispeten daha kolay ve daha uygundur. Filopodia ve dorsal filopodia gibi diğer aktin bazlı hücresel çıkıntılar, özellikle hücreler sabitlendiğinde, iki uzak hücre arasında gezinemez. Not olarak, yakın uçlu, elektriksel olarak birleşmiş, gelişmekte olan nöritler genellikle TNT benzeri yapılar olarak adlandırılır¹³.

F-aktinin TNT oluşumunda önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ve birçok çalışma F-aktin inhibitörü sitokalasin D'nin TNT oluşumunu inhibe ettiğini göstermiştir^14,15. Buna karşılık, mikrotübül inhibitörlerinin TNT oluşumu¹⁶ üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Son 2 yılda, TNT'lerin patoloji ve tümör direncinin ve tedavisinin yayılmasında oynadığı önemli rol hakkında çeşitli raporlar görülmüştür¹⁷. Bu nedenle, TNT karakterizasyonu için daha iyi teknikler için hiç bitmeyen bir talep vardır.

TNT'lerin spesifik belirteçlerinin eksikliği ve morfoloji ve sitoiskelet kompozisyonundaki çeşitlilik, benzersiz bir karakterizasyon yönteminin geliştirilmesini zorlaştırmaktadır. Bazı çalışmalarda otomatik görüntü algılama ve TNT niceleme teknikleri kullanılmıştır^18,19. Bununla birlikte, mevcut 3D hacimli manuel analiz yönteminin, TNT'lerin tespiti ve nicelleştirilmesi için otomatik görüntü analizine göre birkaç avantajı vardır. Ayrıca, algoritma uzmanlığı olmayan laboratuvarlarda otomatik algılama yöntemlerinin uygulanması zor olabilir. Mevcut yöntem, hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak benimsenebilir.

Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, oAβ'nın nöronal hücrelerdeki TNT'lerin biyogenezini PAK1 aracılı, aktin bağımlı, endositoz mekanizması¹² aracılığıyla desteklediğini gösterdik. oAβ kaynaklı TNT'ler ayrıca aktif PAK1'i (veya fosfo-PAK1) eksprese eder. OAβ ile indüklenen, F-aktin ve fosfo-PAK1-immünoboyalı TNT'leri ayırt etmek için bir 3D hacim görünümü görüntü rekonstrüksiyon yöntemi geliştirdik. β-III tübülin-pozitif, gelişen nöritler genellikle TNT benzeri gezinme yapılarına benzerler²⁰. Bu nedenle, F-aktin bazlı TNT'leri β-III tübülin pozitif nöritlerden ve diğer TNT benzeri çıkıntılardan daha da ayırt ettik. 3D hacim görünümü görüntüleri, TNT'leri substratum üzerinde gezinme ve iki komşu hücre arasında bağlı kalma özelliklerine dayanarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bu yazıda, aktin içeren membran kanallarının veya TNT'lerin konfokal z-yığın görüntüleri kullanılarak tanımlanması ve tespiti ve son olarak, 3D hacim görünümü rekonstrüksiyon görüntülerinden tanımlanan yapıların manuel olarak ölçülmesi açıklanmaktadır. Sunulan yöntem, açık uçlu uygun TNT'leri kapalı uçlu TNT benzeri yapılardan ayırt edemez; Bu yöntem, TNT'lerin in vitro 2D hücre kültürünü düz bir substrat üzerinde tanımlamaya yardımcı olur. Bununla birlikte, yöntemin uygulanması ve çoğaltılması kolaydır ve sadece aktin bazlı TNT'lerin hassas bir şekilde ölçülmesi ve bunları nöritlerden ve β-tübülin pozitif TNT benzeri yapılardan ayırt etmek için yaygın olarak kullanılabilir.

Protokol

NOT: DMEM/F-12 ortamında kültürlenen SH-SY5Y hücreleri 7 gün boyunca 10 μM retinoik asit ile farklılaştırıldı ve 37 °C'de (% 5 CO_{2) 2} saat boyunca 1 μM oAβ oligomerleri ile muamele edildi. Tedaviden sonra, hücreler Karnovsky'nin fiksatif çözeltisi ile sabitlendi ve fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı faloidin ile çift immüno-boyandı. Daha sonra, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak konfokal z-stack görüntüleri alındı. TNT'ler manuel sayımla ölçüldü ve 3D hacim görünümü görüntüleri oluşturarak ve yapıları substratuma dokunmadan iki hücre arasında gezinme özelliklerinden tanımlayarak diğer nöritlerden / hücre çıkıntılarından ayırt edildi (Şekil 1).

1. Hücre kültürü ve farklılaşması

1. DMEM/F12 (Ham's) media 1:1'deki SH-SY5Y nöronal hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin-neomisin karışımı (PSN) ile kültüre alın. Hücreleri, tabana tutturulmuş çanağın ortasındaki #1.5 kapak kaymasından oluşan 14 mm'lik bir kuyu ile 35 mm'lik bir görüntüleme kabına tohumlayın. Görüntüleme kabındaki hücreleri 12.000 hücre^{/ cm2} konsantrasyonda tohumlayın ve deneyleri% 60 -% 70 oranında gerçekleştirin.
2. 10 μM retinoik asit (RA) içeren hücreleri 100 mM'lik bir stok çözeltisinden (15 mL dimetil sülfoksit [DMSO] içinde 5 mg RA) kısmen ayırt edin. Daha sonra, her 2 günde bir medya değişikliği ile farklılaşma için hücreleri 7 gün boyunca 37 ° C'de (% 5 CO₂) inkübe edin.
   NOT: Hücrelerin (hem farklılaşmamış hem de kısmen farklılaşmış hücreler) akıcılığını (% 60-% 70) korumaya dikkat edin. Hücre yoğunluğu, hücreler arasındaki TNT'lerin oluşumunu etkileyebilir.

2. Nöronal hücreleri tedavi etmek için amiloid β_1-42 (oAβ) oligomerlerinin hazırlanması

1. Aβ _1-42'yi (1 mg) 200 μL 1,1,1,3,3,3-hekzafloro-2-propanol içinde çözün ve çözeltiyi her biri 0.05 mg peptit içeren 20 alikot'a bölün. Alikotları liyofilize edin ve daha sonra kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.
2. DMSO'daki liyofilize Aβ _1-42'nin stok çözeltisini (5 mM), 0.05 mg liyofilize peptide 2.2 μL DMSO ekleyerek hazırlayın. Peptitleri dikkatlice çözmek için, çözeltiyi vorteksleyin ve bir su banyosu sonikatöründe 2 dakika boyunca sonikat yapın.
3. Peptitleri monomerlere dönüştürmek için stok çözeltisini DMEM, pH 7.4 ve vortekste 100 μM'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin, ardından Aβ 1-42 (oAβ)_12,21,22 oligomerleri elde etmek için ²⁴ saat boyunca ₄ ° ^C'de inkübasyon ^yapın.
4. Deneylerden önce oAβ'yı daha önce bildirildiği gibi^21,22 transmisyon elektron mikroskobu görüntüleme ile karakterize edin.
5. Kısmen farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerini 1 μM oAβ ile tedavi edin. Tedavilerden önce ortamı çıkarın ve taze FBS içermeyen DMEM ekleyin. Orta değişimden sonra, önceden hazırlanmış oAβ'yu (100 μM) ortama 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. hücreleri 37 ° C'de (% 5 CO 2) 2 saat boyunca 1 μM oAβ ile inkübe_edin. Tedavi edilmemiş hücreler şeklinde negatif bir kontrol ekleyin.

3. TNT'lerin karakterizasyonu için F-aktin ve aktif-PAK1'in immün boyanması

1. Fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) antikoru ve F-aktin bağlayıcı fallotoksin falloidin kullanarak diferansiyel immün boyama yapın.
2. Sabitlemeden önce kontrol ve oAβ ile muamele edilmiş hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 x 2 dakika yıkayın. Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini, 0.1 M fosfat tamponunda, pH 7.2'de çözünmüş% 2 formalin fiksatif ve% 2.5 glutaraldehit kullanarak hazırlayın. Ardından, Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini (hücreleri örtmek için yeterli) oda sıcaklığında 45 dakika ekleyerek görüntüleme kabındaki hücreleri sabitleyin.
3. Sabit hücreleri inkübasyon tamponu kullanarak 2 x 2 dakika yıkayın. Kuluçka tamponunu (20x) 0.1 g saponini 5 mL FBS'de çözerek hazırlayın ve 95 mL 1x PBS ekleyerek 1x'e seyreltin.
4. Fiksasyondan sonra, ilk antikoru phopho-PAK1'e karşı inkübasyon tamponunda 1:250'lik bir seyreltmede ekleyin ve karanlık nemli bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
5. Ertesi gün, 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 x 2 dakika yıkayın; daha sonra, Alexa Fluor 488 (1: 1.000 seyreltme) ve Phalloidin 555'e (1: 1.000 seyreltme) konjuge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Karanlık nemli odadaki hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
6. Kuluçkadan sonra, hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 x 2 dakika yıkayın. 1:2.000 seyreltmeye 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyerek çekirdeği sabitleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika ila 10 dakika kuluçkaya yatırın.
7. DABCO montaj ortamını, %90 gliserol ve %10 1x PBS'de 25 mg DABCO kullanarak hazırlayın. Düzgün bir şekilde çözünmesi için, spektrofotometrik sınıf kullanarak pH'ı 8.6'ya ayarlayın, HCl'yi seyreltin (suyla 1:20 seyreltilmiş) ve çözeltiyi karıştırmak için bir rocker üzerinde tutun.
8. Ağartma önleyici bir ajan olarak, DABCO montaj ortamını doğrudan alttaki kapak kaymasını içeren görüntüleme kabının üzerine ekleyin. En az 1-2 saat bekleyin ve doğrudan konfokal görüntüleme yapmaya devam edin.
   NOT: Kapak kapaklarını sabitlemek için yapıştırıcı gerekmez.

4. TNT'leri nöritlerden ayırt etmek için F-aktin ve β-III tübülinin immün boyanması

1. β-III tübülin antikoru ve F-aktin bağlayıcı fallotoksin faloidin ile diferansiyel immün boyama yapın.
2. Karnovsky'nin fiksatif çözeltisini eklemeden önce oAβ ile muamele edilmiş hücreleri 1x PBS ile 2 kat yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri 2 x 2 dakika inkübasyon tamponu ile yıkayın.
3. Fiksasyondan sonra, β-III tübüline (TUBb3) karşı antikoru inkübasyon tamponunda 1:250'lik bir seyreltmede ekleyin ve karanlık nemli odada gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Ertesi gün, hücreleri kuluçka tamponu (2 x 2 dakika) ile yıkayın ve Alexa Fluor 488 (1: 1.000 seyreltme) ve Phalloidin 555'e (1: 1.000 seyreltme) konjuge edilmiş ikincil antikoru aynı kaba ekleyin. Daha sonra, hücreleri karanlık nemli odada oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.
5. Hücreleri inkübasyon tamponu ile 2 kat yıkayın ve karanlıkta oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 1:2.000 seyreltmede nükleer lekeli DAPI ekleyin.
6. Yukarıda belirtildiği gibi montaj ortamına ağartma önleyici ajan DABCO ekleyin ve görüntülemeden önce 2 saat bekleyin.

5. Konfokal mikroskopi ile görüntüleme

1. TNT'leri tanımlamak için, konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak immünoboyalı hücrelerin z-yığın görüntülerini yakalayın. DAPI, floresein izotiyosiyanat (FITC) ve tetrametilrodamin (TRITC) filtre setleri ile 40x/1.40 Oil DIC objektifini kullanarak görüntüleri çekin.
2. İlk olarak, konfokal yazılımdaki Track 1, Track 2 ve Track 3 pencerelerinde gerekli lazerleri sırayla tıklatarak kanalları seçin. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) görüntülerini floresan kanallarıyla çekmek için İzleme 1 penceresinin altındaki T-PMT seçeneğini tıklatın.
   NOT: DIC görüntüleri, T-PMT olarak etiketlenmiş farklı bir dedektör tarafından yakalanır.
3. Yazılımın edinme sekmesini seçin, Z-yığını sekmesine tıklayın ve bir pencerenin açılmasını bekleyin. Ardından, çanağın altındaki hücreleri odaklamak için canlı tarama'yı tıklayın. Bu odaklanmış görüntüyü ilk yığın olarak seçin. Ardından, hücrenin en üst kısmını görmek için yukarı odaklanın ve bunu son yığın olarak seçin. Canlı taramayı durdurun ve yığınların adım boyutunu düzeltmek için en uygun sekmenin yanındaki sayıyı tıklatın. Adım boyutu, dilim sayısını ve hücrelerin kalınlığına bağlı olarak aralıkları belirler.
   NOT: Adım boyutu, yeterli dilim almak ve iki yığın arasında boşluk olmadığından emin olmak için Nyquist örneklemesine göre seçilecektir. Nyquist örneklemesi, ışıkların amacı ve dalga boyları temelinde belirlenir²³.
4. 405 nm, 488 nm ve 561 nm lazerlerle DAPI, FTC ve TRITC'nin üç kanalının sıralı görüntülerini alın ve 1,02 μs piksel bekleme süresiyle çekim yapın. Hücre sınırını gözlemlemek için floresan kanallı DIC kanalındaki görüntüleri yakalayın.
5. x: 224,92 μm ve y: 224,92 μm boyutlarında, her piksel 220 nm ² boyutunda ve z ölçeklendirmesi 415 nm olan bir görüntü yığını yakalayın.
6. Hücrelerin altından üstüne kadar birkaç z-yığını (15-22 yığın) yakalayan görüntüler çekin. Toplam ~ 200-300 hücre elde etmek için kültür çanağının rastgele alanından en az 10 görüntü elde edin.
7. TNT'leri 3B hacim görünümü analizi ile tanımlamak için yakalanan görüntüleri çevrimdışı olarak analiz edin

6. TNT'leri tanımlamak ve ölçmek için konfokal z-yığını görüntülerinin analizi

1. Analiz için Fiji yazılımında .czi veri biçiminde kaydedilmiş konfokal görüntüleri açın.
2. Görüntünün her z-yığınını ve kanalını görmek için Hyperstack seçeneğini belirleyin. Şekil 2'de gösterildiği gibi tek bir pencerede açılan z yığınlarının ve kanallarının hiperyığınlarını arayın. Belirli bir ilgi alanı kanalının tam yığınını seçmek için kanalı (kırmızı ve yeşil oklarla gösterilir) ve z-yığınını (mavi oklarla gösterilir) kaydırma çubuklarını kaydırın.
   NOT: Sabit hücrelerde, havada asılı duran TNT'ler veya membran kanalları yüzeyin üzerinde kaldığından, yapılar z-yığınlarının alt kısımlarında görünmez. Bununla birlikte, sabit hücrelerde, nöritler yüzeyde bulunur ve z-yığınlarının alt kısımlarında tespit edilebilir (z = 0 ila 2). Tanımlama adımları için Şekil 2'ye bakın.
3. Şekil 2'de gösterildiği gibi, önce kanal çubuğunu kaydırarak F-aktin lekeli kanalı (kırmızı oklarla gösterilir) seçin. Ardından, her bir yığını tek tek görmek için z yığınlarını (mavi oklarla gösterilir) manuel olarak kaydırın. Hücreleri birbirine bağlıyor gibi görünen, z-yığınlarının alt kısımlarında görülebilen ve görüntüleme kabının yüzeyine yakın olan (z = 2) F-aktin lekeli yapıları nöritler olarak tanımlayın (beyaz oklarla gösterilir).
   NOT: Nöritlerin çoğunluğunun, uzatılmış çıkıntılar (pembe oklarla gösterilir) olarak göründükleri için tanımlanması kolaydır.
4. TNT'leri, F-aktin pozitif, hücreden hücreye gezinen kanalları, z-yığınlarını üste doğru kaydırarak tanımlayın (Şekil 2'de z = 4'ten; sarı oklarla gösterilir). Z-yığınlarının alt kısımlarının yakınında yüzeye doğru nöritleri arayın ve z-yığınlarının üste doğru kaydırılmasıyla kaybolmaya başladıklarını gözlemleyin (Şekil 2'de z = 6'da; nöritler açıkça görülemez).
5. Fosfo-PAK1-pozitif TNT'leri, z-yığınlarından gelen kanalların gezinen doğasını analiz ederek F-aktin-pozitif TNT'lere benzer şekilde tanımlayın. Fosfo-PAK1 boyaması F-aktin boyamasından daha zayıf olduğundan, z = 4 (hafif görünür) ve z = 6'da (belirgin) phopho-PAK1 boyalı TNT'leri arayın.
6. Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları olduğunu doğrulamak için DIC görüntülerini gözlemleyin (Şekil 3). Ek olarak, tanımlanan TNT'lerin F-aktin ve fosfo-PAK1 birlikte boyanmış yapılar olduğunu doğrulamak için F-aktin (kırmızı) ve fosfo-PAK1 (yeşil) kanallarını birleştirin (Şekil 3).
7. TNT'leri ölçmek için, toplam hücre sayılarını ve tanımlanan TNT'leri manuel olarak sayın ve sayıları yüzde olarak temsil edin.
8. F-aktin pozitif TNT'leri ve β-III tübülin (TUBb3)-pozitif, TNT benzeri gezinme kanallarını z-yığın görüntülerden ayırt etmek için, F-aktin (kırmızı) ve TUBb3 (yeşil) kanallarını birleştirin (Şekil 4). Ardından, birleştirilen görüntülerin z yığınlarını analiz edin.
   1. Sadece z = 3'te hafifçe görülebilen ve z = 6 ve z = 9'da belirgin olan F-aktin lekeli TNT'leri arayın (sarı oklar). Benzer şekilde, F-aktin ve β-III tübülini (TUBb3) çift pozitif, TNT benzeri gezinme kanallarını z = 6 ve z = 9'da (camgöbeği okları) tanımlayın. Diğer F-aktin ve β-III tübülin lekeli, z-yığınlarının alt kısımlarından (beyaz oklar) gezinmeyen çıkıntıları tanımlayın.
9. Fiji'deki hat aracını kullanarak TNT'lerin çapını ölçün. Analiz et'i tıklayarak ölçüm ölçeğini doğrulayın | Ölçek'i , .czi görüntülerinden "piksel cinsinden uzaklık" otomatik olarak ayarlanacak şekilde ayarlayın. TNT'lerin çaplarını xy düzleminde ölçün.
   NOT: Çapların çoğu 1 piksel ile 4 piksel arasındadır (yani, 220-880 nm); her piksel 220 nm'dir. Z-yığını konfokal görüntülerin analizine yönelik protokolün bir özeti için Şekil 5'e bakın.

7.3D TNT'leri karakterize etmek için z-yığın görüntülerin yeniden yapılandırılması

1. Fiji'de, 3B yeniden kaydetme ve eşik özellikli 3B görselleştirmeye izin veren birim görüntüleyici eklentisini kullanın (Şekil 6).
2. Z-stack görüntülerini tek tek kanallara bölün. Ardından, tek kanallı (F-aktin kanalı) z-stack görüntülerini kırparak bir seferde bir veya iki TNT veya nörit vurgulamak üzere 3B yeniden yapılandırma görünümünü kullanın. xy, yz ve xz görünümlerini görselleştirmek için birim görünümü eklentisini etkinleştirin.
3. xy düzlemine tek bir TNT veya nörit sabitleyin (beyaz oklar Şekil 6A'daki nöritleri temsil eder; sarı oklar Şekil 6B'deki TNT'leri temsil eder) ve xz (kırmızı) ve yz (yeşil) eksen kesitlerini işaretleyin. xz ve yz düzlemlerindeki xz düzleminin altındaki nöritleri (beyaz oklar, Şekil 6A) ve üst z-yığınlarındaki TNT'leri (sarı oklar, Şekil 6B) gözlemleyin.
4. xz düzleminde 3B hacim görünümünü yeniden yapılandırmak için tek tek TNT veya nörit seçin (Şekil 6C, D). 3B rekonstrüksiyonunda, z-düzleminin altındaki nöritleri (beyaz oklar, Şekil 6C) ve TNT'lerin alt z-düzlemine dokunmadan iki hücreyi birbirine bağlayan gezinen yapılar olarak göründüğünü gözlemleyin (sarı oklar, Şekil 6D).

Sonuçlar

Burada, SH-SY5Y nöronal hücrelerinde oAβ kaynaklı TNT'leri, konfokal z-yığın görüntülerinden 3D hacim görünümleri oluşturarak tanımlamakta ve karakterize ediyoruz (Şekil 1). Hücreler F-aktin ve fosfo-PAK1 ile çift immün boyandı. İmmünoboyalı hücrelerin konfokal z-stack görüntüleri TNT'leri tanımlamak için analiz edildi (Şekil 2). Ayrıca, F-aktin ve fosfo-PAK1 boyalı TNT yapılarının hücreler arasındaki membran kanalları oldu?...

Tartışmalar

Son 2 yılda birçok araştırmacı TNT'lerin yapısını anlamaya ve karakterize etmeye çalışıyor¹⁸. Spesifik belirteçlerin eksikliği ilerlemeyi engeller ve TNT'leri tanımlamak, karakterize etmek ve ölçmek için kullanılabilecek uygun, standartlaştırılmış bir yönteme olan talep artmaktadır. TNT'ler, iki hücre arasında gezinen F-aktin bazlı membran kanalları olarak tanımlanır. Çalışmalar, β-tübülin-pozitif, yakın uçlu, gelişmekte olan nöritlerin iki uzak hücre ara...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip	Cellvis	D35-14-1.5-N	Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane]	Merck	8034560100	Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM media	Gibco	11965092	Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12)	Gibco	12500062	Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade	Cryopur	CP-100	Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade	Himedia	MB058	Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O)	Sigma	G5882	Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution	TCI	H024	Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer	Christ, Alpha	2.4 LDplus	0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture	Thermo fisher Scientific	15640055	Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit]	CST	#2601	Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3)	Cloud clone	PAE711Hu01	Primary antibody
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Differentiating reagent
Saponin	Merck	8047-15-2	Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater)	Ultrasonic Cleaner	3.0 L/3.2	Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software	ZEISS (Carl Zeiss)		Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation