体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型

摘要

该协议描述了一种顶端坏死性小肠结肠炎（NEC）在培养皿中的模型，该模型利用具有反向极性的小肠类化合物，允许进入顶端表面。我们提供免疫荧光染色方案来检测NEC相关的上皮破坏，并提供一种确定受NEC培养皿中方案影响的顶出类肠蛋白的活力的方法。

摘要

坏死性小肠结肠炎（NEC）是一种影响早产儿的破坏性疾病，其特征是肠道炎症和坏死。类肠类药物最近已成为一种有前途的系统，用于模拟胃肠道病变。然而，目前使用的肠类操作方法要么无法进入上皮的顶端表面（三维[3D]），要么耗时且资源密集（二维[2D]单层）。这些方法通常需要额外的步骤，例如显微注射，以使模型在生理上可转化。在这里，我们描述了一种生理学上相关且廉价的方案，用于通过逆转肠极性 在体外 研究NEC，导致顶端表面朝外（顶端外）。还提供了免疫荧光染色方案，用于在常氧或缺氧条件下暴露于肿瘤坏死因子α（TNF-α）或脂多糖（LPS）后检查肠屏障完整性和连接蛋白表达。还评估了暴露于常氧或缺氧LPS或TNF-α 24 h的3D顶端类肠类药物的生存能力。暴露于LPS或TNF-α的类肠细胞与缺氧相结合，表现出上皮结构的破坏，贴壁连接蛋白表达的丧失以及细胞活力的降低。该协议描述了一种新的顶端NEC在培养皿中模型，该模型提供了一个生理学相关且具有成本效益的平台，以确定NEC治疗的潜在上皮靶点并研究治疗药物的早产肠道反应。

引言

坏死性小肠结肠炎 （NEC） 是一种严重的小肠炎性疾病，见于多达 10% 的早产儿，通常与高发病率和死亡率相关^1，2。在需要手术干预的极低出生体重（<1500克）婴儿中，死亡率接近50%并不少见³。虽然目前尚不了解NEC的确切病因，但危险因素（如配方奶喂养）被认为与生理异常（例如生态失调，未成熟的肠上皮和功能失调的肠屏障）在疾病发展中复合^2，4。尽管作出了重大努力，但在过去十年中，在预防或治疗NEC方面进展甚微⁵.需要一种新的 体外 方法来研究NEC和相关肠上皮屏障功能障碍，以进一步了解该疾病的发病机制，因为到目前为止，动物模型的研究结果尚未转化为床边⁶。

已经利用许多体外模型来研究NEC期间起作用的机制。人肠上皮细胞系Caco-2是NEC^7，8最常用的体外模型之一。Caco-2细胞模拟小肠的刷子边界形态特征，但是，作为细胞系，不会分化成高度可翻译的模型所需的各种体内细胞类型，包括产生粘液的杯状细胞。HT-29-MTX，人结肠腺癌细胞，包括混合肠细胞和高脚杯细胞表型，但仍缺乏基于隐窝的细胞类型的肠上皮⁹。IEC-6和IEC-18是非转化细胞系，具有未成熟的回肠隐窝样形态，但不是来自人体组织，限制了它们的转化能力。FHs 74-Int和H4肠细胞系来源于人胎儿组织，不形成紧密连接或极化单层^10，11，因此与最易患NEC的早产儿相比，它们都是不成熟的。通常，NEC体外模型利用脂多糖（LPS）治疗来诱导Toll样受体4（TLR4），这是NEC¹²中引发肠道炎症的主要受体。通过活性氧（ROS）处理介导的损伤，通常通过过氧化氢，通常用于诱导NEC样氧化损伤和细胞凋亡^13，14。作为肠道炎症的主要驱动因素，肿瘤坏死因子α（TNF-α）是炎症性TLR4信号传导的下游成分，在这些体外模型中也通常用于模拟体内发病机制¹⁵。

由诱导性多能干细胞（iPSCs）产生的类器官作为肠道的体外模型越来越受欢迎，因为它们能够概括复杂的体内结构和衍生它们的组织的细胞类型组成^16，17。相关的体外系统，类肠动物，是从切除的肠隐窝中提取的类器官，比iPSC衍生的类器官更容易建立和维持。类肠细胞通常在三维（3D）细胞外基质（ECM）中生长，实验访问仅限于基底外侧细胞表面。已经开发了诸如显微注射^18，19的方法，以克服顶端表面的这种障碍，但是腔内脱落的细胞碎片和粘液的积聚使得显微注射在技术上既困难又不一致。由于定制的机器人显微注射平台无法广泛使用²⁰，因此技术能力和一般技术的实验室间差异成为显微注射方案需要克服的重要变量。来自解离的3D类肠细胞的二维（2D）单层，仍然包括肠上皮的所有主要细胞类型，允许进入顶端表面，但传统上很难维持没有间充质肌成纤维母细胞²¹的饲养层。虽然细胞培养渗透性载体可用于进入肠样单层的顶端和基底外侧，而无需使用下面的肌成纤维母细胞，但这些插入片段在与共聚焦显微镜等模态一起使用之前需要切除和安装膜，导致在使用传统显微镜方法²²时技术要求更高且难度更大。NEC已经使用传统的3D类肠类化合物^23，24，25和可渗透支持^26，27进行体外建模，并且肠道炎症最近已经通过芯片上的肠道模型^28，29进行了复制。虽然包含微流体的芯片上的肠道模型是迄今为止最先进和可转化的模型，但该技术昂贵，复杂且大多数研究人员都无法访问³⁰。

顶端出肠技术的最新进展使得更容易进入3D类肠细胞的顶端表面，而不会对体外上皮^31，32，33的结构完整性造成损害。顶端出肠类化合物共享体内肠上皮的细胞类型组成和屏障功能，但是，与典型的3D类肠细胞不同，这些细胞的顶端表面面向培养基，允许对营养吸收，微生物感染和腔内分泌进行更多生理相关的研究³¹。顶端出肠类药物的另一个优点是能够将实验药物均匀地分布到类肠道。不需要根据肠样大小改变治疗体积，因为它是显微注射，并且在悬浮培养物中维持这些肠道的能力否定了对实验剂扩散³²的任何ECM干扰。

坏死性小肠结肠炎是一种多因素疾病，涉及多种肠上皮细胞类型和多种环境和病理生理因素³⁴。肠道类固醇的不同细胞组成在模拟NEC等复杂疾病方面比单一栽培有了明显的改进。有趣的是，虽然单一的炎症暴露通常足以 在体外 单一培养中诱导损伤，但与小鼠模型²³一样，类肠杆菌似乎需要至少两种炎症成分来诱导NEC样损伤⁶。在这里，我们提出了一个顶端出的NEC在培养皿模型中，使用顶端出肠类化合物结合缺氧（NEC⁶的重要临床特征）和LPS或TNF-α，作为一种改进的和生理上更相关的 体外 模型，以研究对NEC样炎症的上皮反应，并可能确定治疗靶点。我们描述了一种逆转小肠3D类肠细胞极性的方案，以及一种免疫荧光染色方案，用于识别上皮屏障破坏和连接蛋白表达改变。最后，我们进一步演示了一个简单的肠溶性测定，以确定我们的双重打击，顶端出的NEC在培养皿中模型的影响。

研究方案

本研究中的所有动物程序均由俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。在安乐死后，在一项单独的研究中，从早产非人灵长类动物（NHP，90%妊娠，橄榄狒狒， Papio anubis）中获得小肠方便样本（协议#101523-16-039-I）。

1. 建立顶端出肠状NEC盘式模型

1. 培养基和肠道治疗的制备
   注意:一旦按照标准无菌技术制备，培养基可以在4°C下储存长达1周。
   1. 通过将50 mL人类器官生长培养基与50 mL类器官补充剂混合来制备无抗生素培养基（AFM）（参见 材料表）。通过将100μL0.5M EDTA加入9，900μL PBS来制备5mM乙二胺四乙酸/ 1x磷酸缓冲盐水（EDTA / PBS）。
   2. 在2-8°C下冷却杜尔贝科的改性鹰的中等/营养火腿混合物F12 + 15 mM HEPES缓冲液（DMEM / F12）。
   3. 通过将100μgTNF-α粉末悬浮在1 mL 1x PBS中来制备TNF-α储备溶液。使用原子力显微镜作为溶剂，进一步将TNF-α储液稀释至20纳克/毫升和50纳克/毫升浓度。通过将2毫克LPS悬浮在1毫升1x PBS中来制备LPS储备溶液。使用原子力显微镜作为溶剂，进一步将储备液 LPS 稀释至 100 μg/mL 和 200 μg/mL。
2. 反转 3D 类肠机器人的极性
   注意:以下程序旨在将单个24孔平底组织培养板反转为两个24孔超低附着组织培养板。组织培养板应在使用前加热至37°C至少30分钟。基底外侧3D类固醇的推导如前所述，许多组^35，36实现了，对介质进行了轻微的修改（详见上文）。一般的类肠衍生程序与人类没有区别。简而言之，将切除的组织洗涤，切成小片段，并在细胞破碎缓冲液中孵育。然后将细胞溶液通过70μM细胞过滤器运行，从而产生以高密度电镀的隐窝。
   1. 从已建立的 3D 基底外侧肠类化合物的 24 孔板的每个孔中抽吸培养基。
   2. 向24孔板的每个孔中加入500μL冰冷的5 mM EDTA / PBS，并通过用p200移液管上下移液至少5x-6x来轻轻地机械地破坏基底膜提取物/ ECM圆顶。
   3. 将四个孔的内容物转移到15 mL锥形管中，并向锥形管中加入8 mL冰冷的EDTA / PBS。以相同的方式转移剩余的20口井。
   4. 将15 mL锥形管在4°C下在旋转平台或振荡器上以330rpm孵育1小时。孵育1小时后，将锥形管以300× g 在4°C下离心3分钟。 从每个管中取出并丢弃上清液。
   5. 将细胞沉淀与5 mL DMEM / F12混合并洗涤，并将细胞悬浮液分配到两个15 mL锥形管中。
   6. 通过在4°C下以300× g 离心3分钟来沉淀细胞。 取出上清液并向每个管中加入12mL AFM，确保重悬细胞沉淀。
   7. 将500μL肠悬浮液移液到两个24孔超低连接板的每个孔中。
   8. 将板在37°C和5%CO₂ 下孵育2-5天或直到类肠具有相反的极性。
   9. 为了检查肠道逆转，首先建立确认性免疫荧光染色和平均逆转时间（约3天），然后使用基本的光学显微镜可视化确认极性逆转。顶端出肠样体在外观上非常多细胞，而基底外侧类肠样通常由大的中心管腔或萌芽的存在为主（见 补充图1）。
      注意:一旦程序标准化，到顶点的转换率通常超过95%。顶端出肠类药物的使用旨在作为终末期实验，尽管理论上可以将顶端输出的肠类药物传入少量的基底外侧出肠类药物中。
3. 顶出的内克在菜中
   注意:一旦类肠动物的极性反转，在随后的实验中迅速使用培养物，因为它们在顶端构象中的寿命尚未超过3-4天得到证实。对于以下NEC在培养皿模型中，将肠类化合物处理24小时，然后立即收集并保存用于下游实验。
   1. 一旦类肠动物以至少95%的效率在视觉上反转极性，从培养箱中取出板并将24孔板的八个孔收集到15 mL锥形管中。由于顶端出肠类药物处于悬浮液中，只需移取肠/培养基溶液即可。在4°C下以300× g 离心15mL管5分钟。
   2. 一旦细胞沉淀，取出上清液并将细胞沉淀重悬于4mL AFM中，混合所需体积（此处为10μL以匹配添加的最高处理体积）的1x PBS（对照）。
   3. 将500μL肠杆菌/ PBS / AFM悬浮液移入24孔超低附着板的八孔中，并将板在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
   4. 重复步骤 1.3.1.-1.3.3。用于常氧条件下的 TNF-α（20 纳克/毫升和 50 纳克/毫升）和低磷脂蛋白（100 微克/毫升和 200 微克/毫升）治疗。对于所有缺氧处理，重复步骤1.3.1.-1.3.3.，但将板置于单独的培养箱中，温度为37°C，5%CO₂和1%O₂ ，持续24小时。
      注:步骤 1.3.4。可以与步骤1.3.1.-1.3.3同时完成，但是，为了清楚起见，为了降低复杂性，上述程序通过处理分开。

2. 免疫荧光染色和共聚焦显微镜检查

1. 染色溶液的制备
   1. 通过将7μL海卫一X-100与1x PBS混合至最终体积为7 mL来制备0.1%海卫一X-100。通过将30μL吐温-20至1x PBS加入最终体积为30 mL来制备PBS（PBS-吐温）。
   2. 通过将 700 μL NDS 加入 6.3 mL PBST 来制备 10% 的正常驴血清 （NDS）/PBST。通过将70微升NDS加入PBS至最终体积为7毫升来制备1%的NDS / PBST。
      注意:驴血清在这里用于与二抗宿主相关。然而，阻断血清物质应与二抗物质相匹配，以便正确阻断非特异性结合。
2. 染色（第1天）
   1. 将24孔板的四个孔的内容物转移到1.5 mL微量离心管中。对所有所需的孔/处理重复，每次处理都在单独的管中。在4°C下以300× g 离心管4分钟。 一旦类肠蛋白沉淀，除去上清液。
   2. 将细胞沉淀重悬于室温（RT）下300μL的4%甲醛固定剂中30分钟。30分钟后，在4°C下以300× g 离心管4分钟，除去上清液，并用500μL无菌，RT 1x PBS洗涤沉淀。
   3. 在4°C下以300× g 离心管4分钟。 除去上清液并加入500μL0.1%曲拉酮X-100，并在室温下静置1小时。
   4. 1小时后，在4°C下以300× g 离心管4分钟并除去上清液。用500μL1x PBS洗涤，并将管子以200rpm的速度放在旋转器或振荡器上，在2-8°C下放置15分钟。 重复此步骤共 4 次。
   5. 在4°C下以300× g 离心管4分钟并除去上清液。加入500μL 10%NDS / PBST并在室温下孵育45分钟。在孵育过程中，将20μL重组抗维林抗体，10μLE-钙粘蛋白抗体和1970μL1%NDS / PBST组合用于24孔板的8孔，制备一抗溶液。
   6. 孵育45分钟后，在4°C下以300× g 离心管4分钟。 将管子放在冰上。取出上清液并用250μL一抗溶液代替。将试管在2-8°C下孵育过夜。
3. 染色（第2天）
   1. 在4°C下以300× g 离心管4分钟并除去上清液。根据沉淀的大小，向每个管中加入250-500μL PBST，并在2-8°C下以200rpm置于旋转器或振荡器上1小时。 重复PBST洗涤4次。
   2. 将52μLCy3驴抗兔IgG（H + L）加入50%甘油和5.2μL驴抗小鼠荧光绿488个二抗到5142.8μL1%NDS / PBST中制备二抗溶液。
   3. 在最后一次PBST洗涤和离心之后，从管中取出上清液。将200μL二抗溶液分配到每个管中，并在2-8°C的黑暗中孵育过夜。
4. 安装染色的顶端类肠类药物（第 1 天）
   1. 将含有蓝色核染料的甘油基卡定剂带到室温中超过1小时。
   2. 在4°C下以300× g 离心管4分钟。 除去100μL上清液，并将细胞重悬于剩余的〜100μL上清液中。将细胞悬浮液转移到0.5 mL管中。
   3. 在小型离心机中离心管20秒以沉淀细胞。除去上清液并将细胞沉淀重悬于100μL远红核酸染色剂中。将试管在室温下孵育10分钟。
   4. 在小型离心机中离心管20秒以沉淀细胞。除去上清液并将细胞沉淀重悬于100μL1x PBS中。重复第二次洗涤。
   5. 在小型离心机中离心管20秒以沉淀细胞并除去70μL上清液。将细胞重悬于PBS的剩余体积中，并将内容物转移到标记的盖玻片（24 mm x 60 mm）中。
   6. 将75μL安装剂直接涂在试样上，并用移液器吸头除去任何气泡。让盖玻片在黑暗中室温下固化过夜（18-24小时）。
5. 安装染色的顶端类肠类药物（第 2 天）
   1. 固化过夜后，将一层薄薄的甘油（〜15μL）涂在盖玻片上。将盖玻片安装到载玻片上，然后轻轻按压到位。点击以删除盖玻片和幻灯片之间的任何气泡。
   2. 让盖玻片在黑暗中以RT设置至少2小时，然后用共聚焦显微镜以20倍放大倍率成像。有关使用各种共聚焦采集方法的类肠动物的微观可视化，请参阅Lallemant等人^.37。
6. 免疫荧光定量
   注意:此方法通过使用ImageJ软件（https://imagej.nih.gov/ij/）去除背景信号来确定校正后的总荧光。
   1. 在 ImageJ 中打开共聚焦图像，并使用感兴趣区域 （ROI） 工具勾勒出所需区域。
   2. 通过导航到 分析>设置测量值来设置用户定义的参数。选择 设置选项卡下的面积>集成密度>平均灰度值 。
   3. 导航到 分析>度量。将出现一个包含测量值的弹出窗口。将这些测量值复制并粘贴到电子表格中。
   4. 要减去背景信号，请选择图像的一个小的非荧光区域。导航到 分析该区域>度量 值。将出现一个包含测量值的弹出窗口。将输出复制并粘贴到电子表格中。
   5. 将所选细胞的面积乘以背景读数的平均荧光，然后从积分密度中减去总和以计算校正的总细胞荧光（CTCF）。对所有感兴趣的图像重复上述步骤，同时在电子表格或统计软件包中维护记录（请参见 材料表）。

3. 顶出的培养皿中NEC细胞活力

1. 肠道治疗
   1. 建立顶端出的NEC在盘子里模型24小时，如步骤1所示。
   2. 解冻细胞活力测定试剂在4°C下过夜。 在测定当天，将试剂带到使用前30分钟。倒置试剂以混合。
   3. 在进行测定之前，从每个孔中取出100μL培养基，留下剩余的400μL。向每个孔中加入400μL细胞活力测定试剂。
   4. 在室温下在平板振荡器上以200rpm剧烈混合内容物5分钟以诱导细胞裂解。摇动后，将板在室温下再孵育25分钟。
   5. 孵育25分钟后，通过移液混合一个孔的内容物，并将200μL的800μL转移到96孔，不透明，聚苯乙烯，清底板的单孔中。对剩余的600μL重复上述步骤，每孔产生4次技术重复。以这种方式将24孔板的每个孔的剩余内容物转移到96孔板中。
   6. 使用能够发光的读板器，记录0.25 ms积分时的值，并比较治疗之间的相对值。或者，将治疗发光与三磷酸腺苷（ATP）标准品进行比较。

结果

使用类肠杆菌来模拟肠道炎症，即使在坏死性小肠结肠炎的背景下，现在也很常见。然而，目前使用的大多数方法要么缺乏进入类肠素的顶端表面，否定了最终用作口服治疗的化合物的生理相关性，要么在技术上是困难和耗时的，如肠源性单层。为了增加NEC当前体外类肠模型的实用性，我们反转了类肠细胞的极性，并结合24小时缺氧和LPS或TNF-α，生成了顶端出的NEC在碟中模型。免疫荧光染?...

讨论

最近开发的源自肠上皮隐窝的类肠模型允许更生理相关的 体外 组织，其中研究坏死性小肠结肠炎的发病机制。尽管包括肠上皮的所有主要分化细胞类型，但3D类肠细胞仍然受到一些显着的限制。将常规的基底外侧出的类肠物质悬浮在3D ECM水凝胶穹顶中，其组成和密度可限制组织培养环境³⁹内的正常扩散。重要的是，这些类肠物质提供了对细胞顶端表面的有限访问，该表面 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5