JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает модель апикального некротизирующего энтероколита (NEC) в чашке, использующую энтероиды тонкой кишки с обратной полярностью, позволяющую получить доступ к апикальной поверхности. Мы предоставляем протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для обнаружения эпителиальных нарушений, связанных с NEC, и метод определения жизнеспособности апикальных энтероидов, подвергающихся протоколу NEC-in-a-dish.

Аннотация

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является разрушительным заболеванием, поражающим недоношенных детей, характеризующимся воспалением кишечника и некрозом. Энтероиды в последнее время стали перспективной системой для моделирования желудочно-кишечных патологий. Однако используемые в настоящее время методы энтероидных манипуляций либо не имеют доступа к апикальной поверхности эпителия (трехмерные [3D]), либо являются трудоемкими и ресурсоемкими (двумерные [2D] монослои). Эти методы часто требуют дополнительных шагов, таких как микроинъекция, чтобы модель стала физиологически переводимой. Здесь мы описываем физиологически значимый и недорогой протокол для изучения NEC in vitro путем обращения вспять энтероидной полярности, в результате чего апикальная поверхность обращена наружу (апикально-наружу). Также предусмотрен протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения целостности энтероидного барьера и экспрессии соединительного белка после воздействия фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) или липополисахарида (ЛПС) в нормоксических или гипоксических условиях. Также оценивается жизнеспособность 3D-апикально-ауттероидных энтероидов, подвергшихся воздействию нормоксических или гипоксических ЛПС или TNF-α в течение 24 ч. Энтероиды, подвергшиеся воздействию ЛПС или TNF-α в сочетании с гипоксией, демонстрировали нарушение эпителиальной архитектуры, потерю экспрессии белка соединения адгезий и снижение жизнеспособности клеток. Этот протокол описывает новую апикальную модель NEC-in-a-dish, которая представляет собой физиологически значимую и экономически эффективную платформу для выявления потенциальных эпителиальных целей для терапии NEC и изучения преждевременного кишечного ответа на терапию.

Введение

Некротизирующий энтероколит (НЭК), тяжелое воспалительное заболевание тонкой кишки, встречающееся у 10% недоношенных детей, обычно связано с высокой заболеваемостью и смертностью 1,2. Показатели смертности, приближающиеся к 50% у младенцев с очень низкой массой тела при рождении (<1500 г), требующих хирургического вмешательства, не редкость3. Хотя точная этиология НЭК в настоящее время не понята, считается, что факторы риска, такие как искусственное вскармливание, сочетаются с физиологическими аномалиями, такими как дисбактериоз, незрелый кишечный эпителий и дисфункциональный кишечный барьер, в развитии заболевания 2,4. Несмотря на значительные усилия, за последнее десятилетие5 был достигнут незначительный прогресс в профилактике или лечении НЭК. Новый метод in vitro для изучения NEC и связанной с ним дисфункции кишечного эпителиального барьера необходим для углубления понимания патогенеза заболевания, поскольку результаты животных моделей до сих пор плохо переводились на прикроватную часть6.

Ряд моделей in vitro был использован для исследования механизмов, действующих во время NEC. Клеточная линия эпителия кишечника человека, Caco-2, является одной из наиболее часто используемых моделей IN VITRO NEC 7,8. Клетки Caco-2 имитируют морфологические особенности границы кисти тонкой кишки, но, как клеточная линия, не дифференцируются в широкий спектр типов клеток in vivo, включая слизь-продуцирующие бокалы, необходимые для высокотранслизируемой модели. HT-29-MTX, клетки аденокарциномы толстой кишки человека, включают смешанный фенотип энтероцитарных и бокаловидных клеток, но все еще не имеют типов клеток на основе крипты кишечного эпителия9. IEC-6 и IEC-18 являются нетрансформированными клеточными линиями с незрелой подвздошной криптоподобной морфологией, но не получены из тканей человека, что ограничивает их поступательную способность. Линии клеток кишечника FHs 74-Int и H4 получены из ткани плода человека и не образуют плотных соединений или поляризованных монослоев10,11 и, таким образом, являются незрелыми по сравнению даже с самыми недоношенными детьми, восприимчивыми к NEC. Как правило, модели NEC in vitro используют лечение липополисахаридами (LPS) для индуцирования толл-подобного рецептора 4 (TLR4), основного рецептора, инициирующего воспаление кишечника в NEC12. Повреждение, опосредованное обработкой активными формами кислорода (АФК), обычно через перекись водорода, часто используется для индуцирования NEC-подобного окислительного повреждения и апоптоза13,14. В качестве основного фактора воспаления кишечника фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), последующий компонент воспалительной передачи сигналов TLR4, также обычно используется в этих моделях in vitro для имитации патогенеза in vivo 15.

Органоиды, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), стали популярными в качестве модели кишечника in vitro из-за их способности повторять сложную архитектуру in vivo и клеточный состав ткани, из которой они получены16,17. Родственная система in vitro, энтероиды, представляют собой органоиды, полученные из резецированных кишечных крипт, которые легче установить и поддерживать, чем органоиды, полученные из iPSC. Энтероиды обычно выращиваются в трехмерном (3D) внеклеточном матриксе (ECM) с экспериментальным доступом, ограниченным базолатеральной клеточной поверхностью. Методы, такие как микроинъекция18,19, были разработаны для преодоления этого барьера на апикальной поверхности, но накопление слоистого клеточного мусора и слизи в просвете делает микроинъекцию как технически сложной, так и непоследовательной. Поскольку пользовательские роботизированные платформы микроинъекции не являются широко доступными20, лабораторная изменчивость технических возможностей и общей техники становится значительными переменными для преодоления с помощью протоколов микроинъекции. Двумерные (2D) монослои, полученные из диссоциированных 3D-энтероидов, все еще включающие все основные типы клеток кишечного эпителия, обеспечивают доступ к апикальной поверхности, но традиционно их трудно поддерживать без питающего слоя мезенхимальных миофибробластов21. В то время как проницаемые опоры клеточной культуры могут быть использованы для доступа как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам энтероидных монослоев без использования нижележащих миофибробластов, эти вставки требуют иссечения и монтажа мембраны перед использованием с такими модальностями, как конфокальная микроскопия, что приводит к более технически сложному и сложному процессу при использовании традиционных методов микроскопии22. NEC был смоделирован in vitro с использованием традиционных 3D-энтероидов 23,24,25 и проницаемых опор 26,27, а воспаление кишечника недавно было воспроизведено с моделями gut-on-a-chip28,29. В то время как модели «кишка на чипе», включающие микрофлюидику, на сегодняшний день являются самыми передовыми и переводимыми моделями, эта технология дорога, сложна и недоступна для большинства исследователей30.

Последние достижения в области апикальных энтероидных методов позволили облегчить доступ к апикальной поверхности 3D-энтероидов без риска повреждения структурной целостности эпителия in vitro 31,32,33. Апикальные энтероиды разделяют состав клеточного типа и барьерную функцию кишечного эпителия in vivo, но, в отличие от типичных 3D-энтероидов, апикальные поверхности этих клеток обращены к культуральной среде, что позволяет проводить более физиологически значимые исследования абсорбции питательных веществ, микробной инфекции и люминальной секреции31. Дополнительным преимуществом апикально-ауттероидов является способность гомогенно распределять экспериментальные агенты по энтероидам. Изменение объемов обработки в зависимости от размера энтероидов не требуется, как это происходит при микроинъекции, а способность поддерживать эти энтероиды в культуре суспензии сводит на нет любые интерференции ECM на экспериментальной диффузии агента32.

Некротизирующий энтероколит представляет собой многофакторное заболевание, включающее множественные типы эпителиальных клеток кишечника и различные факторы окружающей среды и патофизиологические факторы34. Разнообразный клеточный состав кишечных энтероидов является явным улучшением по сравнению с монокультурами в моделировании сложного заболевания, такого как NEC. Интересно, что в то время как одного воспалительного воздействия часто достаточно, чтобы вызвать повреждение монокультур in vitro , энтероиды, как и в случае с мышиными моделями23, по-видимому, требуют как минимум двух воспалительных компонентов, чтобы вызвать NEC-подобное повреждение6. Здесь мы представляем апикальную модель NEC-in-a-dish, использующую апикальные энтероиды в сочетании с гипоксией (важная клиническая особенность NEC6) и либо LPS, либо TNF-α, в качестве улучшенной и более физиологически значимой модели in vitro для изучения эпителиальных реакций на воспаление, подобное NEC, и, потенциально, определения терапевтических мишеней. Мы описываем протокол для изменения полярности 3D-энтероидов тонкой кишки, а также протокол иммунофлуоресцентного окрашивания для выявления нарушения эпителиального барьера и изменений экспрессии соединительного белка. Наконец, мы дополнительно демонстрируем простой анализ энтероидной жизнеспособности, чтобы определить влияние нашей модели NEC-in-a-dish с двойным ударом.

протокол

Все процедуры для животных в этом исследовании были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Центра медицинских наук Университета Оклахомы. Образцы для удобства тонкой кишки от недоношенного нечеловеческого примата (NHP, 90% беременности, оливковый бабуин, Papio anubis) были получены после эвтаназии для отдельного исследования (Протокол No101523-16-039-I).

1. Создание апикально-ауттероидной модели NEC-in-a-dish

  1. Подготовка средств для лечения сред и энтероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления в соответствии со стандартной асептической техникой среду можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели.
    1. Получают безантибиотиковую среду (AFM), смешивая 50 мл органоидной ростовой среды человека с 50 мл органоидной добавки (см. Таблицу материалов). Приготовьте 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты/1x фосфатно-буферного физиологического раствора (ЭДТА/ПБС), добавив 100 мкл 0,5 М ЭДТА к 9 900 мкл ПБС.
    2. Охладите модифицированную смесь Ветчины F12 + 15 мМ HEPES Buffer (DMEM/F12) при 2-8 °C.
    3. Приготовьте TNF-α растворе, суспендируя 100 мкг порошка TNF-α в 1 мл 1x PBS. Далее разбавляют TNF-α запасы до концентраций 20 нг/мл и 50 нг/мл, используя AFM в качестве растворителя. Приготовьте раствор ЛПС, суспендируя 2 мг ЛПС в 1 мл 1x PBS. Далее разбавляют запас ЛПС до 100 мкг/мл и 200 мкг/мл, используя АСМ в качестве растворителя.
  2. Изменение полярности 3D-энтероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура предназначена для разворота одной 24-луночной пластины для культивирования тканей с плоским дном в две 24-луночные пластины для культивирования тканей со сверхнизким прикреплением. Пластины для культивирования тканей следует нагревать до 37 °C в течение не менее 30 мин перед использованием. Выведение базолатеральных 3D-энтероидов было достигнуто, как описано ранее многими группами 35,36, с небольшими модификациями для сред (подробно описано выше). Общая процедура получения энтероидов не отличается от таковой у человека. Короче говоря, иссеченная ткань промывается, разрезается на мелкие фрагменты и инкубируется в буфере разрушения клеток. Затем клеточный раствор пропускают через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ, в результате чего образуются крипты, которые покрыты высокой плотностью.
    1. Аспиратные среды из каждой лунки 24-луночной пластины установленных 3D базолатеральных энтероидов.
    2. Добавьте 500 мкл 5 мМ ледяного ЭДТА/ПБС в каждую скважину плиты из 24 скважин и осторожно механически разрушайте экстракт базальной мембраны/ купол ECM, пипеткой вверх и вниз пипеткой p200 минимум 5x-6x.
    3. Перенесите содержимое четырех скважин в коническую трубку объемом 15 мл и добавьте в коническую трубку 8 мл ледяного ЭДТА/ПБС. Перенесите оставшиеся 20 скважин таким же образом.
    4. Инкубируйте конические трубки объемом 15 мл при 4 °C в течение 1 ч на вращающейся платформе или шейкере при 330 об/мин. После инкубации 1 ч центрифугируют конические трубки при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Извлеките и выбросьте супернатант из каждой трубки.
    5. Соедините и промывайте гранулы ячейки с 5 мл DMEM/F12 и распределите клеточную суспензию по две конические трубки по 15 мл.
    6. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Удалите супернатант и добавьте 12 мл AFM в каждую трубку, гарантируя, что гранулы клеток будут повторно суспендированы.
    7. Пипетка 500 мкл энтероидной суспензии в каждую скважину из двух 24-луночных сверхнизких пластин крепления.
    8. Инкубируют пластины при 37 °C и 5% CO2 в течение 2-5 дней или до тех пор, пока энтероиды не изменят полярность.
    9. Чтобы проверить интероидную реверсию, сначала установите подтверждающее иммунофлуоресцентное окрашивание и среднее время до разворота (~ 3 дня), затем подтвердите изменение полярности с помощью базовой визуализации светового микроскопа. Апикально-наружные энтероиды очень клеточны по внешнему виду, в то время как в базолатеральных энтероидах часто преобладает наличие большого центрального просвета или бутонизации (см. Дополнительный рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После стандартизации процедуры коэффициент конверсии в апикальный выход обычно превышает 95%. Использование апикальных энтероидов задумано как терминальный эксперимент, хотя теоретически возможно прохождение апикальных энтероидов в небольшое количество базолатеральных энтероидов.
  3. Апикальный NEC-in-a-dish
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только энтероиды изменили полярность, быстро используйте культуры в последующих экспериментах, так как их долговечность в апикальной конформации не была подтверждена более 3-4 дней. Для следующей модели NEC-in-a-dish энтероиды обрабатывали в течение 24 ч, а затем собирали сразу после этого и сохраняли для последующих экспериментов.
    1. После того, как энтероиды визуально изменили полярность с эффективностью не менее 95%, извлеките пластины из инкубатора и соберите восемь лунок 24-луночной пластины в коническую трубку объемом 15 мл. Поскольку апикальные энтероиды находятся в суспензии, просто пипетка энтероидного/медиа раствора. Центрифугировать пробирку объемом 15 мл при 300 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    2. После того, как клетки гранулированы, удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки в 4 мл AFM, смешанной с желаемым объемом (10 мкл здесь, чтобы соответствовать наибольшему добавленному объему обработки) 1x PBS (контроль).
    3. Пипетка 500 мкл энтероидной/PBS/AFM суспензии в восемь скважин 24-луночной сверхнизкой крепежной пластины и инкубирует пластину при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
    4. Повторите шаги 1.3.1.-1.3.3. для лечения TNF-α (20 нг/мл и 50 нг/мл) и ЛПС (100 мкг/мл и 200 мкг/мл) при нормоксии. Для всех методов лечения гипоксии повторите шаги 1.3.1.-1.3.3., но поместите пластину в отдельный инкубатор при 37 °C, 5% CO2 и 1% O2 в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.3.4. это может быть сделано одновременно с этапами 1.3.1.-1.3.3, но для ясности приведенная выше процедура была разделена обработкой, чтобы уменьшить сложность.

2. Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия

  1. Приготовление окрашивающих растворов
    1. Приготовьте 0,1% Triton X-100, смешивая 7 мкл Triton X-100 в 1x PBS до конечного объема 7 мл. Подготовьте PBST (PBS-Tween), добавив 30 мкл Tween-20 к 1x PBS к конечному объему 30 мл.
    2. Приготовьте 10% нормальной ослиной сыворотки (NDS)/PBST, добавив 700 мкл NDS к 6,3 мл PBST. Приготовьте 1% НДС/ПБСТ, добавив 70 мкл НДС к ПБСТ к конечному объему 7 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ослиная сыворотка использовалась здесь для корреляции с вторичным антителом хозяина. Тем не менее, блокирующие виды сыворотки должны соответствовать вторичным видам антител, чтобы правильно блокировать неспецифическое связывание.
  2. Окрашивание (День 1)
    1. Перенесите содержимое четырех скважин 24-луночной плиты в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Повторите для всех желаемых лунок / процедур, с каждой обработкой в отдельной трубке. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Как только энтероиды будут гранулированы, удалите супернатант.
    2. Повторно суспендируют ячейки гранул в 300 мкл 4% формальдегидного фиксатора в течение 30 мин при комнатной температуре (RT). Через 30 мин центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C, удаляют супернатант и промывают гранулу 500 мкл стерильной, RT 1x PBS.
    3. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Удалите надосадочный материал и добавьте 500 мкл 0,1% тритона X-100, и оставьте на 1 ч при RT.
    4. Через 1 ч центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °С и удаляют надосадочное вещество. Промыть 500 мкл 1x PBS и поместить трубки на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение 15 мин при 2-8 °C. Повторите это в общей сложности 4x.
    5. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C и удалите супернатант. Добавьте 500 мкл 10% NDS/PBST и инкубируйте на RT в течение 45 мин. Во время инкубации готовят растворы первичных антител, комбинируя 20 мкл рекомбинантного антивиллинового антитела, 10 мкл антитела к Е-кадгерину и 1970 мкл 1% NDS/PBST для восьми лунок 24-луночной пластины.
    6. После 45 мин инкубации центрифугируют пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Поместите трубки на лед. Удалить супернатант и заменить 250 мкл раствора первичного антитела. Инкубировать пробирки в течение ночи при температуре 2-8 °C.
  3. Окрашивание (День 2)
    1. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C и удалите супернатант. Добавьте 250-500 мкл ПБСТ в каждую трубку, в зависимости от размера гранулы, и поместите на ротатор или шейкер при 200 об/мин в течение 1 ч при 2-8 °C. Повторите промывку PBST 4x.
    2. Готовят раствор вторичных антител, добавляя 52 мкл Cy3 ослиного анти-кролика IgG (H + L) к 50% глицерину и 5,2 мкл флуоресцентных зеленых 488 вторичных антител против осла к 5142,8 мкл 1% NDS/PBST.
    3. После последней промывки и центрифугирования PBST удалите супернатант из трубок. Вводят по 200 мкл раствора вторичных антител в каждую пробирку и инкубируют в темноте на ночь при 2-8 °C.
  4. Монтаж окрашенных апикальных энтероидов (День 1)
    1. В течение 1 ч доведите до РТ монтант на основе глицерина, содержащий синий ядерный краситель.
    2. Центрифугируйте пробирки при 300 х г в течение 4 мин при 4 °C. Удалите 100 мкл супернатанта и повторно суспендируйте клетки в оставшихся ~100 мкл супернатанта. Переложите клеточную суспензию в пробирки по 0,5 мл.
    3. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 мкл пятна дальней красной нуклеиновой кислоты. Инкубировать пробирки на RT в течение 10 мин.
    4. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 мкл 1x PBS. Повторите вторую стирку.
    5. Центрифугируйте трубки в мини-центрифуге в течение 20 с, чтобы гранулировать ячейки и удалить 70 мкл супернатанта. Повторно суспендируйте ячейки в оставшемся объеме PBS и перенесите содержимое в помеченный крышку (24 мм x 60 мм).
    6. Нанесите 75 мкл монтажника непосредственно на образец и удалите все пузырьки кончиком пипетки. Дайте покровам затвердеть в течение ночи (18-24 ч) при РТ в темноте.
  5. Монтаж окрашенных апикальных энтероидов (День 2)
    1. После отверждения на ночь нанесите тонкий слой (~15 мкл) глицерина на покровные листы. Прикрепите крышку к стеклянному слайду и осторожно прижмите на место. Нажмите, чтобы удалить пузырьки между обложек и слайдом.
    2. Позвольте крышке установить на RT в темноте в течение как минимум 2 ч, прежде чем визуализировать с 20-кратным увеличением с помощью конфокального микроскопа. Для микроскопической визуализации энтероидов с использованием различных конфокальных методов получения см. Lallemant et al.37.
  6. Иммунофлуоресцентная количественная оценка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод определяет скорректированную общую флуоресценцию путем удаления фонового сигнала с помощью программного обеспечения ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
    1. Откройте конфокальные изображения в ImageJ и наметьте нужную область с помощью инструмента интересующей области (ROI).
    2. Задайте пользовательские параметры, перейдя в раздел Анализ > Набор измерений. Выберите Область > Встроенная плотность > Среднее значение серого цвета на вкладке настроек.
    3. Перейдите в раздел Анализ > меры. Появится всплывающее окно, содержащее измерения. Скопируйте и вставьте эти измерения в электронную таблицу.
    4. Чтобы вычесть фоновый сигнал, выберите небольшую нефлуоресцентную область изображения. Перейдите в раздел Анализ > меры для этого региона. Появится всплывающее окно, содержащее измерения. Скопируйте и вставьте выходные данные в электронную таблицу.
    5. Умножьте площадь выбранной ячейки на среднюю флуоресценцию фоновых показаний и вычтите сумму из интегральной плотности, чтобы вычислить скорректированную общую флуоресценцию ячейки (CTCF). Повторите описанные выше шаги для всех интересующих изображений, сохраняя записи в электронной таблице или пакете статистического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).

3. Жизнеспособность ячейки NEC-in-a-dish

  1. Лечение энтероидов
    1. Установите апикальную модель NEC-in-a-dish в течение 24 ч, как показано на шаге 1.
    2. Реагент для анализа жизнеспособности оттаивающих клеток в течение ночи при 4 °C. В день анализа доведите реагент до RT за 30 мин до использования. Переверните реагент для смешивания.
    3. Перед выполнением анализа удалите 100 мкл среды из каждой лунки, оставив оставшиеся 400 мкл. Добавьте 400 мкл реагента для анализа жизнеспособности клеток в каждую лунку.
    4. Энергично хорошо перемешайте содержимое на пластинчатом шейкере на RT в течение 5 мин при 200 об/мин, чтобы вызвать лизис клеток. После встряхивания высиживают пластину в RT в течение дополнительных 25 минут.
    5. После 25 мин инкубации смешайте содержимое одной скважины путем пипетки и перенесите 200 мкл из 800 мкл в одну скважину из 96-луночной, непрозрачной, полистирольной плиты с прозрачным дном. Повторите для оставшихся 600 мкл, создав четыре технические реплики на скважину. Таким образом, перенесите оставшееся содержимое каждой скважины из 24-луночной плиты в плиту из 96 скважин.
    6. Используя пластинчатый считыватель, способный к люминесценции, записывайте значения при интеграции 0,25 мс и сравнивайте относительные значения среди обработок. В качестве альтернативы можно сравнить люминесценцию лечения со стандартом аденозинтрифосфата (АТФ).

Результаты

Использование энтероидов для моделирования воспаления кишечника, даже в контексте некротизирующего энтероколита, в настоящее время распространено. Однако большинство используемых в настоящее время способов либо не имеют доступа к апикальной поверхности энтероидов, что сводит на не?...

Обсуждение

Недавняя разработка энтероидных моделей, полученных из кишечных эпителиальных крипт, позволяет получить более физиологически значимую ткань in vitro , в которой можно изучать патогенез некротизирующего энтероколита. Несмотря на включение всех основных дифференцированных типов кле...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать и у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Мы благодарим Лабораторию молекулярной биологии и исследований цитометрии в OUHSC за использование Core Facility, которая обеспечивала конфокальную визуализацию.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA, pH 8.0Fisher Scientific15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher Scientific05-408-129
15 mL Conical tubeVWR89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well MicroplatesFisher Scientific07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mmThermo Scientific102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo ScientificA-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugateSigma-AldrichAP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES bufferSTEMCELL Technologies36254
E-cadherin antibody (7H12)Novus BiologicalsNBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9Millipore Sigma1004960700
GlycerolSigma-Aldrich56-81-5
ImageJFijiN/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)STEMCELL Technologies06010
Leica SP8 Confocal MicroscopeLeica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatographyMillipore SigmaL3012-10MG
Microscope SlidesFisher Scientific12-544-7
Normal Donkey SerumSigma-Aldrich566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom MicroplateThermo Scientific136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4Corning21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlueFisher ScientificP36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]Abcamab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µgBio-Techne210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate ReaderMolecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184LFisher Scientific3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)Thermo ScientificT3605
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat capThermo ScientificAB0350
Tween-20Sigma-Aldrich9005-64-5

Ссылки

  1. Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Bazacliu, C., Neu, J. Necrotizing enterocolitis: long term complications. Current Pediatric Reviews. 15 (2), 115-124 (2019).
  4. Lim, J. C., Golden, J. M., Ford, H. R. Pathogenesis of neonatal necrotizing enterocolitis. Pediatric Surgery International. 31 (6), 509-518 (2015).
  5. Neu, J. Necrotizing enterocolitis: the future. Neonatology. 117 (2), 240-244 (2020).
  6. Kovler, M. L., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. Precision-based modeling approaches for necrotizing enterocolitis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), (2020).
  7. Emami, C. N., Mittal, R., Wang, L., Ford, H. R., Prasadarao, N. V. Recruitment of dendritic cells is responsible for intestinal epithelial damage in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by Cronobacter sakazakii. Journal of Immunology. 186 (12), 7067-7079 (2011).
  8. Chen, L., et al. Human β-defensin-3 reduces excessive autophagy in intestinal epithelial cells and in experimental necrotizing enterocolitis. Scientific Reports. 9 (1), 19890 (2019).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  10. Gimeno-Alcañiz, J. V., Collado, M. C. Impact of human milk on the transcriptomic response of fetal intestinal epithelial cells reveals expression changes of immune-related genes. Food & Function. 10 (1), 140-150 (2019).
  11. Claud, E. C., Savidge, T., Walker, W. A. Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatric Research. 53 (3), 419-425 (2003).
  12. De Plaen, I. G. Inflammatory signaling in necrotizing enterocolitis. Clinics in Perinatology. 40 (1), 109-124 (2013).
  13. Subramanian, S., Geng, H., Tan, X. D. Cell death of intestinal epithelial cells in intestinal diseases. Sheng Li Xue Ba : [Acta Physiologica Sinica]. 72 (3), 308-324 (2020).
  14. Li, B., et al. Intestinal epithelial cell injury is rescued by hydrogen sulfide. Journal of Pediatric Surgery. 51 (5), 775-778 (2016).
  15. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum reduces apoptosis in the intestinal epithelium in necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (5), 1118-1127 (2010).
  16. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Experimental & Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  17. Stelzner, M., et al. A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (12), 1359-1363 (2012).
  18. Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of helicobacter pylori. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (105), e53359 (2015).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. Williamson, I. A., et al. A high-throughput organoid microinjection platform to study gastrointestinal microbiota and luminal physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).
  21. Moorefield, E. C., Blue, R. E., Quinney, N. L., Gentzsch, M., Ding, S. Generation of renewable mouse intestinal epithelial cell monolayers and organoids for functional analyses. BMC Cell Biology. 19 (1), 15 (2018).
  22. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  23. Werts, A. D., et al. A novel role for necroptosis in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 403-423 (2020).
  24. Li, B., et al. Intestinal epithelial tight junctions and permeability can be rescued through the regulation of endoplasmic reticulum stress by amniotic fluid stem cells during necrotizing enterocolitis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 35 (1), 21265 (2021).
  25. Ares, G. J., Buonpane, C., Yuan, C., Wood, D., Hunter, C. J. A novel human epithelial enteroid model of necrotizing enterocolitis. JoVE:Journal of Visualized Experiments. (146), e59194 (2019).
  26. Senger, S., et al. Human fetal-derived enterospheres provide insights on intestinal development and a novel model to study necrotizing enterocolitis (NEC). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
  27. Li, B., et al. Activation of Wnt signaling by amniotic fluid stem cell-derived extracellular vesicles attenuates intestinal injury in experimental necrotizing enterocolitis. Cell Death & Disease. 11 (9), 750 (2020).
  28. Beaurivage, C., et al. Development of a human primary gut-on-a-chip to model inflammatory processes. Scientific Reports. 10 (1), 21475 (2020).
  29. Jeon, M. S., et al. Contributions of the microbiome to intestinal inflammation in a gut-on-a-chip. Nano Convergence. 9 (1), 8 (2022).
  30. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  31. Co, J. Y., et al. Controlling epithelial polarity: a human enteroid model for host-pathogen interactions. Cell Reports. 26 (9), 2509-2520 (2019).
  32. Co, J. Y., Margalef-Català, M., Monack, D. M., Amieva, M. R. Controlling the polarity of human gastrointestinal organoids to investigate epithelial biology and infectious diseases. Nature Protocols. 16 (11), 5171-5192 (2021).
  33. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  34. Li, B., et al. Neonatal intestinal organoids as an ex vivo approach to study early intestinal epithelial disorders. Pediatric Surgery International. 35 (1), 3-7 (2019).
  35. Stewart, C. J., Estes, M. K., Ramani, S. Establishing human intestinal enteroid/organoid lines from preterm infant and adult tissue. Methods in Molecular Biology. 2121, 185-198 (2020).
  36. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. JoVE: Journal of Visualized Experiments. (97), e52483 (2015).
  37. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  38. Buonpane, C., et al. ROCK1 inhibitor stabilizes E-cadherin and improves barrier function in experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 318 (4), 781-792 (2020).
  39. Shin, W., et al. Spatiotemporal gradient and instability of Wnt induce heterogeneous growth and differentiation of human intestinal organoids. iScience. 23 (8), 101372 (2020).
  40. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  41. Schneider, M. R., et al. A key role for E-cadherin in intestinal homeostasis and Paneth cell maturation. PLoS One. 5 (12), 14325 (2010).
  42. Khailova, L., et al. Bifidobacterium bifidum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (5), 940-949 (2009).
  43. Khailova, L., et al. Changes in hepatic cell junctions structure during experimental necrotizing enterocolitis: effect of EGF treatment. Pediatric Research. 66 (2), 140-144 (2009).
  44. Ravisankar, S., et al. Necrotizing enterocolitis leads to disruption of tight junctions and increase in gut permeability in a mouse model. BMC Pediatrics. 18 (1), 372 (2018).
  45. Han, X., et al. Creating a more perfect union: modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 769-782 (2021).
  46. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals: An Open Access Journal from MDPI. 12 (3), 372 (2022).
  47. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocols. 2 (4), 100951 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены