İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Özet

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Nekrotizan enterokolit (NEC), preterm bebekleri etkileyen, intestinal inflamasyon ve nekroz ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Enteroidler son zamanlarda gastrointestinal patolojileri modellemek için umut verici bir sistem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, enteroid manipülasyon için şu anda kullanılan yöntemler ya epitelin apikal yüzeyine (üç boyutlu [3D]) erişimden yoksundur ya da zaman alıcı ve kaynak yoğundur (iki boyutlu [2D] tek katmanlılar). Bu yöntemler genellikle modelin fizyolojik olarak çevrilebilir hale gelmesi için mikroenjeksiyon gibi ek adımlar gerektirir. Burada, enteroid polariteyi tersine çevirerek in vitro NEC'yi incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve ucuz bir protokol tarif ediyoruz, bu da apikal yüzeyin dışa bakmasıyla sonuçlanıyor (apikal-dışarı). Norkoksi veya hipoksik koşullar altında tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) veya lipopolisakkarite (LPS) maruziyetini takiben enteroid bariyer bütünlüğünü ve bileşke protein ekspresyonunu incelemek için bir immünofloresan boyama protokolü de sağlanmaktadır. Normoksik veya hipoksik LPS veya TNF-α maruz kalan 3D apikal-out enteroidlerin 24 saat boyunca yaşayabilirliği de değerlendirilmektedir. LPS veya TNF-α maruz kalan enteroidler, hipoksi ile kombinasyon halinde, epitel mimarisinin bozulması, aderans birleşim proteini ekspresyonunun kaybı ve hücre canlılığında bir azalma sergiledi. Bu protokol, NEC tedavileri için potansiyel epitel hedeflerini belirlemek ve terapötiklere erken bağırsak yanıtını incelemek için fizyolojik olarak alakalı ve uygun maliyetli bir platform sunan yeni bir apikal-out-out-NEC-in-a-dish modelini tanımlamaktadır.

Giriş

Preterm bebeklerin %10'una varan oranda ince bağırsağın ciddi inflamatuar bir hastalığı olan nekrotizan enterokolit (NEK), genellikle yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir ^1,2. Cerrahi müdahale gerektiren çok düşük doğum ağırlıklı (<1500 g) bebeklerde %50'ye yaklaşan mortalite oranları nadir değildir³. NEC'nin kesin etiyolojisi şu anda anlaşılamamış olsa da, formül besleme gibi risk faktörlerinin, hastalığın gelişiminde dysbiosis, olgunlaşmamış bir bağırsak epiteli ve işlevsiz bir bağırsak bariyeri gibi fizyolojik anomalilerle birleştiği düşünülmektedir ^2,4. Önemli çabalara rağmen, son on yılda NEC'nin önlenmesi veya tedavisinde çok az ilerleme kaydedilmiştir⁵. NEC ve ilişkili intestinal epitel bariyer disfonksiyonunu incelemek için yeni bir in vitro yöntem, hastalığın patogenezinin anlaşılmasını ilerletmek için gereklidir, çünkü hayvan modellerinden elde edilen bulgular şimdiye kadar yatak başına kötü bir şekilde çevrilmiştir⁶.

NEC sırasında oyundaki mekanizmaları araştırmak için bir dizi in vitro model kullanılmıştır. İnsan bağırsak epitel hücre hattı Caco-2, NEC ^7,8'in in vitro modellerinde en yaygın kullanılanlar ^{arasındadır}. Kako-2 hücreleri, ince bağırsağın fırça sınırındaki morfolojik özelliklerini taklit eder, ancak bir hücre hattı olarak, yüksek oranda çevrilebilir bir model için gerekli olan mukus üreten kadeh hücreleri de dahil olmak üzere çok çeşitli in vivo hücre tiplerine farklılaşmaz. HT-29-MTX, insan kolon adenokarsinom hücreleri, karışık bir enterosit ve kadeh hücresi fenotipi içerir, ancak yine de bağırsak epiteli^9'un kript bazlı hücre tiplerinden yoksundur. IEC-6 ve IEC-18, olgunlaşmamış ileal kript benzeri bir morfolojiye sahip transforme edilmemiş hücre çizgileridir, ancak insan dokusundan türetilmezler ve translasyonel kapasitelerini sınırlarlar. FH'lar 74-Int ve H4 bağırsak hücre hatları insan fetal dokusundan türetilir ve sıkı kavşaklar veya polarize tek katmanlı^10,11 oluşturmaz ve bu nedenle ^NEC'ye duyarlı en prematüre bebeklerle karşılaştırıldığında bile olgunlaşmamıştır. Tipik olarak, NEC in vitro modeller, NEC^12'de bağırsak iltihabını başlatan majör bir reseptör olan toll-like reseptör 4'ü (TLR4) indüklemek için lipopolisakkarit (LPS) tedavilerini kullanır. Reaktif oksijen türleri (ROS) tedavisi yoluyla, tipik olarak hidrojen peroksit yoluyla aracılık edilen hasar, genellikle NEC benzeri oksidatif hasarı ve apoptozu indüklemek için kullanılır^13,14. İntestinal inflamasyonun ana itici gücü olarak, inflamatuar TLR4 sinyallemesinin bir aşağı akış bileşeni olan tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α), in vivo patogenezi taklit etmek için bu in vitro modellerde yaygın olarak kullanılmaktadır¹⁵.

İndüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) üretilen organoidler, kompleks in vivo mimarisini ve türetildikleri dokunun hücre tipi kompozisyonunu özetleme yetenekleri nedeniyle bağırsağın in vitro bir modeli olarak popülerlik kazanmıştır^16,17. İlgili bir in vitro sistem olan enteroidler, iPSC türevi organoidlerden daha kolay kurulan ve bakımı yapılan rezeke edilmiş bağırsak kriptlerinden türetilen organoidlerdir. Enteroidler tipik olarak bazolateral hücre yüzeyi ile sınırlı deneysel erişime sahip üç boyutlu (3D) hücre dışı bir matriste (ECM) yetiştirilir. Apikal yüzeye olan bu engelin üstesinden gelmek için mikroenjeksiyon^18,19 gibi yöntemler geliştirilmiştir^, ancak lümen içinde dökülmüş hücresel enkaz ve mukus birikmesi, mikroenjeksiyonu hem teknik olarak zor hem de tutarsız hale getirmektedir. Özel robotik mikroenjeksiyon platformlarına yaygın olarak erişilemediğinden²⁰, teknik yetenek ve genel teknikteki laboratuvardan laboratuvara değişkenlik, mikroenjeksiyon protokolleri ile üstesinden gelinmesi gereken önemli değişkenler haline gelmektedir. Ayrışmış 3D enteroidlerden türetilen ve hala bağırsak epitelinin tüm ana hücre tiplerini içeren iki boyutlu (2D) monokatmanlar, apikal yüzeye erişime izin verir, ancak geleneksel olarak mezenkimal miyofibroblastların besleyici tabakası olmadan sürdürülmesi zor olmuştur²¹. Hücre kültürü geçirgen destekleri, altta yatan miyofibroblastlar kullanılmadan enteroid monokatmanların hem apikal hem de bazolateral taraflarına erişmek için kullanılabilirken, bu ekler konfokal mikroskopi gibi modalitelerle kullanılmadan önce eksizyon ve membranın monte edilmesini gerektirir, bu da geleneksel mikroskopi yöntemlerini kullanırken daha teknik olarak zorlu ve zor bir işlemle sonuçlanır²². NEC, geleneksel 3D enteroidler 23,24,25 ve geçirgen destekler 26,27 kullanılarak in vitro olarak modellenmiştir ve bağırsak iltihabı son zamanlarda çip üzerinde bağırsak modelleri^28,29 ile çoğaltılmıştır. Mikroakışkanları içeren çip üzerinde bağırsak modelleri, şimdiye kadar, en gelişmiş ve çevrilebilir modeller olsa da, bu teknoloji pahalı, karmaşık ve çoğu araştırmacı için erişilemez³⁰.

Apikal-out enteroid tekniklerindeki son gelişmeler, in vitro epitel^31,32,33'ün yapısal bütünlüğüne zarar verme riski olmadan 3D enteroidlerin apikal yüzeyine daha kolay erişim ^{sağlamıştır.} Apikal-out enteroidler, in vivo bağırsak epitelinin hücre tipi kompozisyonunu ve bariyer fonksiyonunu paylaşır, ancak tipik 3D enteroidlerin aksine, bu hücrelerin apikal yüzeyleri kültür ortamına bakar ve besin emilimi, mikrobiyal enfeksiyon ve luminal sekresyon hakkında fizyolojik olarak daha ilgili çalışmalara izin verir³¹. Apikal-dışarı enteroidlerin ek bir avantajı, deneysel ajanları enteroidlere homojen olarak dağıtma yeteneğidir. Mikroenjeksiyonda olduğu gibi enteroid boyutuna göre değişen tedavi hacimleri gerekli değildir ve bu enteroidleri süspansiyon kültüründe tutma yeteneği, deneysel ajan difüzyonu³² üzerindeki herhangi bir ECM girişimini ortadan kaldırır.

Nekrotizan enterokolit, çoklu intestinal epitel hücre tiplerini ve çeşitli çevresel ve patofizyolojik faktörleri içeren multifaktöriyel bir hastalıktır³⁴. Bağırsak enteroidlerinin çeşitli hücre bileşimi, NEC gibi karmaşık bir hastalığın modellenmesinde monokültürlere göre açık bir gelişmedir. İlginç bir şekilde, in vitro monokültürlerde hasarı indüklemek için tek bir enflamatuar maruziyet genellikle yeterli olsa da, enteroidler, fare modelleri^23'te olduğu gibi, NEC benzeri hasarı indüklemek için en az iki enflamatuar bileşen gerektirmektedir⁶. Burada, hipoksi (NEC^6'nın önemli bir klinik özelliği) ve LPS veya TNF-α ile kombinasyon halinde apikal-out enteroidleri kullanarak, NEC benzeri inflamasyona epitel yanıtlarını incelemek ve potansiyel olarak terapötik hedefleri tanımlamak için geliştirilmiş ve fizyolojik olarak daha alakalı bir in vitro model olarak apikal-out NEC-in-a-dish modelini sunuyoruz. İnce bağırsak 3D enteroidlerinin polaritesini tersine çevirmek için bir protokolün yanı sıra epitel bariyeri bozulmasını ve bileşke protein ekspresyon değişikliklerini tanımlamak için bir immünofloresan boyama protokolü tanımladık. Son olarak, çift vuruşlu, apikal çıkışlı NEC-in-a-dish modelimizin etkisini belirlemek için basit bir enteroid canlılık testi daha da gösteriyoruz.

Protokol

Bu çalışmadaki tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ayrı bir çalışma için ötenaziyi takiben preterm insan olmayan primattan (NHP,% 90 gebelik, zeytin babunu, Papio anubis) ince bağırsak kolaylık örnekleri elde edildi (Protokol # 101523-16-039-I).

1. Apikal-out enteroid NEC-in-a-dish modelinin kurulması

1. Medya ve enteroid tedavilerin hazırlanması
   NOT: Standart aseptik tekniğe uygun olarak hazırlandıktan sonra, ortam 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
   1. 50 mL insan organoid büyüme ortamını 50 mL organoid takviyesi ile karıştırarak antibiyotiksiz ortam (AFM) hazırlayın (bkz. 9.900 μL PBS'ye 100 μL 0,5 M EDTA ekleyerek 5 mM etilendiamintetraasetik asit/1x fosfat tamponlu salin (EDTA/PBS) hazırlayın.
   2. Chill Dulbecco'nun modifiye kartalın orta / besin jambonunun karışımı F12 + 15 mM HEPES Tamponu (DMEM / F12) 2-8 ° C'de.
   3. 1 mL 1x PBS'de 100 μg TNF-α tozunu askıya alarak TNF α stok çözeltisi hazırlayın. TNF-α stokunu çözücü olarak AFM kullanarak 20 ng / mL ve 50 ng / mL konsantrasyonlarına kadar seyreltin. 1 mL 1x PBS'de 2 mg LPS'yi askıya alarak LPS stok çözeltisi hazırlayın. Çözücü olarak AFM kullanarak stok LPS'yi 100 μg / mL ve 200 μg / mL'ye kadar seyreltin.
2. 3D enteroidlerin polaritesini tersine çevirme
   NOT: Aşağıdaki prosedür, tek bir 24 delikli düz tabanlı doku kültürü plakasının iki adet 24 delikli ultra düşük ataşman doku kültürü plakasına çevrilmesi için tasarlanmıştır. Doku kültürü plakaları kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye ısıtılmalıdır. Bazolateral çıkışlı 3D enteroidlerin türetilmesi, daha önce birçok grup^35,36 tarafından tanımlandığı gibi^, ortam için hafif değişikliklerle (yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır) elde edilmiştir. Genel enteroid türetme prosedürü insanlarınkinden farklı değildir. Kısacası, eksize edilen doku yıkanır, küçük parçalar halinde kesilir ve hücre bozulma tamponunda inkübe edilir. Hücre çözeltisi daha sonra 70 μM'lik bir hücre süzgecinden geçirilir ve bu da yüksek yoğunlukta kaplanmış kriptlerle sonuçlanır.
   1. Ortamları, 24 delikli bir 3D bazolateral-çıkış enteroidi plakasının her bir kuyucuğundan aspire edin.
   2. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL 5 mM buz gibi soğuk EDTA/PBS ekleyin ve minimum 5x-6x p200 pipetle yukarı ve aşağı pipet yaparak bazal membran ekstraktını/ECM kubbesini nazikçe mekanik olarak bozun.
   3. Dört kuyucuğun içeriğini 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve konik tüpe 8 mL buz gibi soğuk EDTA / PBS ekleyin. Kalan 20 kuyuyu da aynı şekilde aktarın.
   4. 15 mL konik tüpleri dönen bir platformda 1 saat boyunca 4 °C'de veya 330 rpm'de çalkalayıcıda inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, konik tüpleri 300 x g'de 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı her tüpten çıkarın ve atın.
   5. Hücre peletlerini 5 mL DMEM / F12 ile birleştirin ve yıkayın ve hücre süspansiyonunu iki 15 mL konik tüpe dağıtın.
   6. 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yaparak hücreleri pelet edin. Süpernatantı çıkarın ve her tüpe 12 mL AFM ekleyerek hücre peletlerinin yeniden askıya alınmasını sağlayın.
   7. İki adet 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna enteroid süspansiyonun 500 μL'lik pipeti.
   8. Plakaları 37 ° C'de ve% 5 CO_{2'de 2-5} gün boyunca veya enteroidler polariteyi tersine çevirene kadar inkübe edin.
   9. Enteroid reversal'ı kontrol etmek için, önce doğrulayıcı immünofloresan boyamayı ve ortalama tersine çevirme süresini (~ 3 gün) belirleyin, ardından temel bir ışık mikroskobu görselleştirmesi kullanarak polarite tersine çevirmesini onaylayın. Apikal-out enteroidleri görünüşte çok hücreseldir, bazolateral çıkış enteroidleri ise genellikle büyük bir merkezi lümen veya tomurcuklanma varlığı ile baskındır (bakınız Ek Şekil 1).
      NOT: Prosedür standartlaştırıldıktan sonra, apikal-out'a dönüşüm oranı tipik olarak% 95'i aşıyor. Apikal-çıkış enteroidlerinin kullanımı bir terminal deneyi olarak tasarlanmıştır, ancak apikal çıkış enteroidlerini az sayıda bazolateral çıkış enteroidine geçirmek teorik olarak mümkündür.
3. Apikal-out NEC-in-a-dish
   NOT: Enteroidler polariteyi tersine çevirdikten sonra, kültürleri sonraki deneylerde hızlı bir şekilde kullanın, çünkü apikal konformasyondaki uzun ömürleri 3-4 günden fazla doğrulanmamıştır. Aşağıdaki NEC-in-a-dish modeli için, enteroidler 24 saat boyunca tedavi edildi, daha sonra hemen sonra toplandı ve aşağı akış deneyleri için korundu.
   1. Enteroidler en az% 95 verimlilikle polariteyi görsel olarak tersine çevirdikten sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve 24 kuyucuklu bir plakanın sekiz kuyuğunu 15 mL konik bir tüpe toplayın. Apikal çıkış enteroidleri süspansiyonda olduğundan, enteroid/ortam çözeltisini pipetlemeniz yeterlidir. 15 mL tüpü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Hücreler peletlendikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, 1x PBS'nin (kontrol) istenen hacmiyle (eklenen en yüksek işlem hacmine uymak için burada 10 μL) karıştırılmış 4 mL AFM'de yeniden askıya alın.
   3. Pipet, 500 μL enteroid/PBS/AFM süspansiyonunu 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasının sekiz deliğine yerleştirir ve plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO_2'de inkübe eder.
   4. 1.3.1.-1.3.3 adımlarını yineleyin. normokside TNF-α (20 ng/mL ve 50 ng/mL) ve LPS (100 μg/mL ve 200 μg/mL) tedavileri için. Tüm hipoksi tedavileri için, Adım 1.3.1.-1.3.3.'ü tekrarlayın, ancak plakayı 24 saat boyunca 37 ° C,% 5 CO₂ ve% 1_O2'de ayrı bir inkübatöre yerleştirin.
      NOT: Adım 1.3.4. Adım 1.3.1.-1.3.3 ile aynı anda yapılabilir, ancak netlik için, yukarıdaki prosedür karmaşıklığı azaltmak için tedavi ile ayrılmıştır.

2. İmmünofloresan boyama ve konfokal mikroskopi

1. Boyama çözeltilerinin hazırlanması
   1. 7 μL Triton X-100'ü 1x PBS'de 7 mL'lik son hacme karıştırarak %0,1 Triton X-100 hazırlayın. 30 mL'lik son hacme 30 μL Tween-20 ila 1x PBS ekleyerek PBST'yi (PBS-Ara) hazırlayın.
   2. 6.3 mL PBST'ye 700 μL NDS ekleyerek %10 normal eşek serumu (NDS)/PBST hazırlayın. PBST'ye 7 mL'lik son hacme 70 μL NDS ekleyerek %1 NDS/PBST hazırlayın.
      NOT: Burada eşek serumu sekonder antikor konakçısı ile korelasyon için kullanıldı. Bununla birlikte, bloke edici serum türleri, spesifik olmayan bağlanmayı düzgün bir şekilde bloke etmek için ikincil antikor türleriyle eşleşmelidir.
2. Boyama (1. Gün)
   1. 24 delikli bir plakanın dört kuyucuğunun içeriğini 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. İstenilen tüm kuyucuklar / tedaviler için, her tedavi ayrı bir tüpte olacak şekilde tekrarlayın. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Enteroidler peletlendikten sonra, süpernatanı çıkarın.
   2. Hücre peletlerini oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 300 μL% 4 formaldehit fiksatif olarak yeniden askıya alın. 30 dakika sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve peleti 500 μL steril, RT 1x PBS ile yıkayın.
   3. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve% 0.1 Triton X-100'ün 500 μL'sini ekleyin ve RT'de 1 saat bekletin.
   4. 1 saat sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve tüpleri 2-8 ° C'de 15 dakika boyunca 200 rpm'de bir rotatör veya çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bunu toplam 4 kat tekrarlayın.
   5. Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. 500 μL %10 NDS/PBST ekleyin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, 24 delikli bir plakanın sekiz kuyucuğu için 20 μL rekombinant anti-villin antikoru, 10 μL E-kadherin antikoru ve 1970 μL % 1 NDS / PBST'yi birleştirerek birincil antikor çözeltileri hazırlayın.
   6. 45 dakikalık inkübasyondan sonra, tüpleri 4 ° C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı çıkarın ve 250 μL birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Tüpleri gece boyunca 2-8 ° C'de inkübe edin.
3. Boyama (2. Gün)
   1. Tüpleri 300 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Peletin boyutuna bağlı olarak her tüpe 250-500 μL PBST ekleyin ve 2-8 ° C'de 1 saat boyunca 200 rpm'de rotatör veya çalkalayıcıya yerleştirin. PBST yıkamasını 4x tekrarlayın.
   2. % 50 gliserol için 52 μL Cy3 eşek anti-tavşan IgG (H + L) ve 5142.8 μL% 1 NDS / PBST'ye 5.2 μL eşek anti-fare floresan yeşil 488 sekonder antikor ekleyerek ikincil antikor çözeltisi hazırlayın.
   3. Son PBST yıkama ve santrifüjlemeyi takiben, süpernatantı tüplerden çıkarın. Her tüpe 200 μL ikincil antikor çözeltisi dağıtın ve gece boyunca karanlıkta 2-8 ° C'de inkübe edin.
4. Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 1)
   1. Mavi nükleer boya içeren gliserol bazlı mountantı 1 saat boyunca RT'ye getirin.
   2. Tüpleri 4 °C'de 4 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantın 100 μL'sini çıkarın ve kalan ~ 100 μL süpernatanttaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 0,5 mL tüplere aktarın.
   3. Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL uzak kırmızı nükleik asit boyasında yeniden askıya alın. RT'deki tüpleri 10 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Hücreleri peletlemek için tüpleri 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın.
   5. Tüpleri, hücreleri peletlemek ve süpernatanın 70 μL'sini çıkarmak için 20 sn boyunca mini bir santrifüjde santrifüj yapın. PBS'nin kalan hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın ve içeriği etiketli bir kapak kapağına (24 mm x 60 mm) aktarın.
   6. 75 μL montaj maddesini doğrudan numunenin üzerine uygulayın ve pipet ucu olan kabarcıkları çıkarın. Kapakların karanlıkta RT'de gece boyunca (18-24 saat) iyileşmesine izin verin.
5. Lekeli apikal-out enteroidlerinin montajı (Gün 2)
   1. Gece boyunca kürlendikten sonra, kapak kapaklarına ince bir gliserol tabakası (~ 15 μL) uygulayın. Kapak kaymasını cam kızağa monte edin ve yavaşça yerine bastırın. Kapak kapağı ile slayt arasındaki kabarcıkları kaldırmak için dokunun.
   2. Konfokal mikroskopla 20x büyütmede görüntülemeden önce, kapak kaymasının karanlıkta en az 2 saat boyunca RT'ye ayarlanmasına izin verin. Çeşitli konfokal edinim yöntemleri kullanılarak enteroidlerin mikroskobik olarak görselleştirilmesi için, Lallemant ve ^ark.37'ye bakınız.
6. İmmünofloresan nicelleştirme
   NOT: Bu yöntem, ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanarak arka plan sinyalini kaldırarak düzeltilmiş toplam floresansı belirler.
   1. ImageJ'de konfokal görüntüleri açın ve ilgilenilen bölge (ROI) aracıyla istediğiniz alanı ana hatlarıyla belirtin.
   2. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya giderek kullanıcı tanımlı parametreleri ayarlayın. Ayarlar sekmesinin altında Alan > Entegre Yoğunluk > Ortalama Gri Değer'i seçin.
   3. Analiz > Ölçü'ye gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Bu ölçümleri kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
   4. Arka plan sinyalini çıkarmak için, görüntünün floresan olmayan küçük bir alanını seçin. Bu bölge için > Ölçüyü Analiz Et'e gidin. Ölçümleri içeren bir açılır pencere görünecektir. Çıktıyı kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırın.
   5. Seçilen hücrenin alanını, arka plan okumalarının ortalama floresansı ile çarpın ve düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) hesaplamak için toplamı entegre yoğunluktan çıkarın. Bir elektronik tablodaki veya istatistiksel yazılım paketindeki kayıtları tutarken ilgilendiğiniz tüm resimler için yukarıdaki adımları tekrarlayın (bkz.

3. Apikal çıkış NEC-in-a-dish hücre canlılığı

1. Enteroid tedavileri
   1. Adım 1'de olduğu gibi 24 saat boyunca apikal-out NEC-in-a-dish modelini oluşturun.
   2. Hücre canlılığı testi reaktifini 4 ° C'de gece boyunca çözün. Tahlil gününde, reaktifi kullanımdan 30 dakika önce RT'ye getirin. Karıştırmak için reaktifi ters çevirin.
   3. Testi yapmadan önce, her bir kuyucuktan 100 μL ortam çıkarın ve kalan 400 μL'yi bırakın.
   4. RT'deki bir plaka çalkalayıcıdaki içeriği, hücre lizisini indüklemek için 200 rpm'de 5 dakika boyunca kuvvetlice karıştırın. Sallamayı takiben, plakayı RT'de 25 dakika daha inkübe edin.
   5. 25 dakikalık inkübasyondan sonra, pipetleme yoluyla bir kuyucuğun içeriğini karıştırın ve 800 μL'nin 200 μL'sini 96 delikli, opak, polistiren, şeffaf tabanlı bir plakanın tek bir kuyucuğuna aktarın. Kalan 600 μL için tekrarlayın ve kuyu başına dört teknik kopya oluşturun. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğunun kalan içeriğini bu şekilde 96 delikli bir plakaya aktarın.
   6. Lüminesans yapabilen bir plaka okuyucu kullanarak, 0,25 ms entegrasyonda değerleri kaydedin ve tedaviler arasındaki göreceli değerleri karşılaştırın. Alternatif olarak, tedavi lüminesansını adenozin trifosfat (ATP) standardıyla karşılaştırın.

Sonuçlar

Nekrotizan enterokolit bağlamında bile, bağırsak iltihabını modellemek için enteroidlerin kullanımı artık yaygındır. Bununla birlikte, şu anda kullanılan yöntemlerin çoğu, enteroidlerin apikal yüzeyine erişimden yoksundur, oral terapötikler olarak nihai kullanım için amaçlanan bileşiklerin fizyolojik alaka düzeyini reddeder veya enteroid türevi tek katmanlarda olduğu gibi teknik olarak zor ve zaman alıcıdır. NEC'nin akım in vitro enteroid modellerinin faydasını arttırmak için, ...

Tartışmalar

İntestinal epitel kriptlerinden türetilen enteroid modellerin son zamanlarda geliştirilmesi, nekrotizan enterokolit patogenezinin inceleneceği fizyolojik olarak daha ilgili bir in vitro dokuya izin vermektedir. Bağırsak epitelinin tüm majör farklılaşmış hücre tiplerini içermesine rağmen, 3D enteroidler hala birkaç önemli sınırlamaya tabidir. Konvansiyonel, bazolateral çıkışlı enteroidler, bileşimi ve yoğunluğu doku kültürü ortamında normal difüzyonu sınırlayabilen 3D ECM hidroje...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5