インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

要約

このプロトコルは、極性が逆の小腸炎を利用し、頂端表面へのアクセスを可能にする頂端外壊死性腸炎(NEC)-in-a-dishモデルを記述する。NEC関連上皮破壊を検出するための免疫蛍光染色プロトコールと、NECインディッシュプロトコルに供するアピカルアウトエンテロイドの生存率を決定する方法を提供します。

要約

壊死性腸炎(NEC)は、腸の炎症および壊死を特徴とする早産児に影響を及ぼす壊滅的な疾患である。エンテロイドは最近、胃腸病理をモデル化する有望なシステムとして浮上している。しかし、腸内障操作のために現在利用されている方法は、上皮の頂端表面へのアクセスを欠いているか(3次元[3D])、または時間がかかり、リソースを大量に消費する(2次元[2D]単分子層)。これらの方法は、モデルが生理学的に翻訳可能になるために、マイクロインジェクションなどの追加のステップを必要とすることが多い。ここでは、腸突起極性を反転させることによってNECを in vitroで 研究するための生理学的関連性のある安価なプロトコルを記載し、頂端表面が外側を向く(apical-out)。正常酸素または低酸素条件下での腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)またはリポ多糖(LPS)への曝露後のエンテロイドバリア完全性および接合タンパク質発現を調べるための免疫蛍光染色プロトコルも提供される。正常酸素性または低酸素性のLPSまたはTNF-αに24時間曝露された3D頂端アウト腸ロイドの生存率も評価される。LPSまたはTNF-αのいずれかに曝露されたエンテロイドは、低酸素症と組み合わせて、上皮構造の破壊、接着接合タンパク質発現の喪失、および細胞生存率の低下を示した。このプロトコルは、NEC療法の潜在的な上皮標的を特定し、治療薬に対する早産腸応答を研究するための生理学的関連性と費用対効果の高いプラットフォームを提示する新しい頂端アウトNECインディッシュモデルを記述しています。

概要

壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最大10%に発生する小腸の重篤な炎症性疾患であり、一般的に高い罹患率および死亡率と関連している^1,2。外科的介入を必要とする超低出生体重(<1500g)乳児の死亡率が50%に近づくことは珍しくありません³。NECの正確な病因は現在解明されていませんが、フォーミュラフィーディングなどの危険因子は、この疾患の発症において、ジスバイオシス、未熟な腸上皮、機能不全の腸障壁などの生理学的異常と化合物化すると考えられています^2,4。多大な努力にもかかわらず、NECの予防や治療は過去10年間にほとんど進展していません⁵。NECおよび関連する腸上皮バリア機能障害を研究するための新規なin vitro法は、動物モデルからの所見がこれまでのところベッドサイドにうまく翻訳されていないため、疾患の病因の理解を進めるために必要である⁶。

NEC中に作用するメカニズムを調査するために、多くのin vitroモデルが利用されている。ヒト腸管上皮細胞株であるCaco-2は、NEC ^7,8の最も一般的に利用されているインビトロモデルの1つです。Caco-2細胞は、小腸のブラシボーダー形態学的特徴をエミュレートするが、細胞株として、高度に翻訳可能なモデルに必要な粘液産生杯細胞を含む多種多様なin vivo細胞型に分化しない。HT−29−MTXは、ヒト結腸腺癌細胞、混合腸細胞および杯細胞表現型を含むが、腸上皮の陰窩ベースの細胞型を依然として欠いている⁹。IEC-6およびIEC-18は、未熟な回腸陰窩様形態を有する非形質転換細胞株であるが、ヒト組織に由来するものではなく、それらの翻訳能力を制限する。FHs74-IntおよびH4腸細胞株は、ヒト胎児組織に由来し、タイトジャンクションまたは分極単層^10,11を形成しないため、NECの影響を受けやすい最も未熟児と比較して未熟である。典型的には、NECインビトロモデルは、NEC¹²における腸の炎症を開始する主要な受容体であるtoll様受容体4(TLR4)を誘導するために、リポ多糖(LPS)治療を利用する。活性酸素種(ROS)処理を介して媒介される損傷は、典型的には過酸化水素を介して、NEC様酸化的損傷およびアポトーシスを誘導するためにしばしば使用される^13、14。腸内炎症の主な駆動因子として、炎症性TLR4シグナル伝達の下流成分である腫瘍壊死因子−α(TNF−α)もまた、インビボ病因を模倣するためにこれらのインビトロモデルにおいて一般的に利用されている¹⁵。

誘導性多能性幹細胞(iPSC)から生成されたオルガノイドは、それらが由来する組織の複雑なin vivoアーキテクチャおよび細胞型組成を再現する能力のために、腸のin vitroモデルとして人気が高まっている^16,17。関連するin vitro系であるエンテロイドは、切除された腸陰窩に由来するオルガノイドであり、iPSC由来オルガノイドよりも容易に確立および維持される。エンエロイドは、典型的には、基底側細胞表面への実験的アクセスが制限された三次元(3D)細胞外マトリックス(ECM)中で増殖される。マイクロインジェクション^18,19などの方法は、頂端表面に対するこの障壁を克服するために開発されてきたが、内腔内のスラウド細胞破片および粘液の蓄積は、マイクロインジェクションを技術的に困難かつ一貫性のないものにする。カスタムロボットマイクロインジェクションプラットフォームは広くアクセスできない^ため、技術能力と一般的な技術におけるラボ間のばらつきは、マイクロインジェクションプロトコルで克服すべき重要な変数になります。解離した3D腸突起に由来する2次元(2D)単層は、依然として腸上皮のすべての主要な細胞型を含み、頂端表面へのアクセスを可能にするが、間葉系筋線維芽細胞²¹のフィーダー層なしで維持することは伝統的に困難であった。細胞培養透過性支持体は、根底にある筋線維芽細胞を使用せずにエンテロイド単層の頂端側および基底側の両方にアクセスするために使用することができるが、これらの挿入物は、共焦点顕微鏡法などのモダリティで使用する前に膜の切除および取り付けを必要とし、従来の顕微鏡法²²を使用する場合、より技術的に要求の厳しい困難なプロセスをもたらす。NECは、従来の3Dエンテロイド23,24,25および透過性サポート^26,27を使用してインビトロでモデル化されており、腸の炎症は最近、腸内オンチップモデル^28,29で再現されている。マイクロフルイディクスを組み込んだガット・オン・ア・チップ・モデルは、群を抜いて最も先進的で翻訳可能なモデルですが、この技術は高価で複雑で、ほとんどの研究者にとってアクセスできません³⁰。

頂端アウト腸突起技術の最近の進歩は、in vitro上皮の構造的完全性への損傷を危険にさらすことなく、3D腸ロイドの頂端表面への容易なアクセスを可能にした^31,32,33。頂端外腸ロイドは、in vivo腸上皮の細胞型組成およびバリア機能を共有するが、典型的な3D腸状腸炎とは異なり、これらの細胞の頂端表面は培養培地に面しており、栄養素の吸収、微生物感染、および管腔分泌に関するより生理学的に関連性のある研究を可能にする³¹。頂端アウトエンテロイドのさらなる利点は、実験薬剤をエンテロイドに均質に分配する能力である。マイクロインジェクションの場合のように、エンテロイドサイズに基づいて治療量を変えることは必要なく、浮遊培養においてこれらのエンテロイドを維持する能力は、実験薬剤拡散³²に対するECM干渉を否定する。

壊死性腸炎は、複数の腸上皮細胞型および様々な環境的および病態生理学的因子を含む多因子疾患である³⁴。腸管腸薬の多様な細胞組成は、NECなどの複雑な疾患をモデル化する上での単一培養に対する明らかな改善である。興味深いことに、単一の炎症性曝露がin vitro単培養において損傷を誘発するのに十分であることが多いが、エンテロイドは、マウスモデル²³と同様に、NEC様損傷を誘発するために少なくとも2つの炎症性成分を必要とするようである⁶。ここでは、NEC様炎症に対する上皮応答を研究し、潜在的に治療標的を特定するための改良された生理学的関連性の高いin vitroモデルとして、頂端アウト腸ロイドを低酸素症(NEC⁶の重要な臨床的特徴)およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて使用する頂端アウトNECインディッシュモデルを提示する。我々は、小腸3Dエンテロイドの極性を逆転させるためのプロトコル、ならびに上皮バリア破壊および接合タンパク質発現変化を同定するための免疫蛍光染色プロトコルについて記載する。最後に、我々はさらに、我々のデュアルヒット、アディッシュ内のNECインディッシュモデルの影響を決定するために、単純な腸突起生存率アッセイを実証した。

プロトコル

この研究におけるすべての動物処置は、オクラホマ大学健康科学センター施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。早産非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの小腸便宜サンプルは、別の研究(プロトコル#101523-16-039-I)のために安楽死後に得られた。

1. 頂端外腸科NECインディッシュモデルの構築

1. 培地およびエンエロイド治療の調製
   注:標準的な無菌技術に従って調製されると、メディアは4°Cで最大1週間保存することができます。
   1. 抗生物質非含有培地(AFM)は、50 mLのヒトオルガノイド増殖培地と50 mLのオルガノイドサプリメントを混合することによって調製する( 材料表を参照)。9,900 μL の PBS に 0.5 M EDTA を 100 μL 加えて、5 mM エチレンジアミン四酢酸/1x リン酸緩衝生理食塩水 (EDTA/PBS) を調製します。
   2. ダルベッコの改変イーグルの培地/栄養素ハムの混合物F12 + 15 mM HEPESバッファー(DMEM/F12)を2-8°Cでチルします。
   3. 100μgのTNF-α粉末を1mLの1x PBSに懸濁してTNF-α原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として用いて、TNF-αストックを20ng/mLおよび50ng/mL濃度に希釈する。1mLの1x PBSに2mgのLPSを懸濁してLPS原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として使用して、LPSのストックを100μg/mLおよび200μg/mLに希釈する。
2. 3Dエンテロイドの極性を反転させる
   注: 以下の手順は、単一の 24 ウェル平底組織培養プレートを 2 つの 24 ウェル超低付着組織培養プレートに反転させることを目的としています。組織培養プレートは、使用前に少なくとも30分間37°Cに加温する必要があります。側底アウト3Dエンテロイドの誘導は、多くのグループ^35,36によって以前に説明したように、培地(上記で詳述)に対してわずかな修正を加えて達成された。一般的な腸突起誘導手順は、ヒトのそれと変わらない。簡単に言えば、摘出した組織は洗浄され、小さな断片に切断され、そして細胞破壊緩衝液中でインキュベートされる。次に、細胞溶液を70μMのセルストレーナーに通し、陰窩を高密度でメッキします。
   1. 確立された3D側底外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。
   2. 500 μL の 5 mM 氷冷 EDTA/PBS を 24 ウェルプレートの各ウェルに加え、p200 ピペットで最低 5x-6x のピペッティングを行い、基底膜抽出液/ECM ドームを穏やかに機械的に破壊します。
   3. 4つのウェルの内容物を15mLの円錐形チューブに移し、8mLの氷冷EDTA/PBSを円錐形チューブに加える。残りの20ウェルを同様に移す。
   4. 15 mLの円錐形チューブを4°Cで330 rpmの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。1時間のインキュベーションの後、円錐管を300 x g で4°Cで3分間遠心分離する。 各チューブから上清を取り出して廃棄します。
   5. 細胞ペレットを5 mLのDMEM/F12で結合して洗浄し、細胞懸濁液を2本の15 mL円錐管に分配します。
   6. 4°Cで3分間300 x g で遠心分離することにより細胞をペレット化する。 上清を除去し、各チューブに12mLのAFMを加え、細胞ペレットが再懸濁されていることを確認する。
   7. 500 μLのエンテロイド懸濁液を2つの24ウェル超低付着プレートの各ウェルにピペットで入れる。
   8. プレートを37°Cおよび5%_CO2で2 〜5日間、またはエンエロイドの極性が逆になるまでインキュベートする。
   9. 腸溶性反転を確認するには、まず確認免疫蛍光染色と反転までの平均時間(〜3日)を確立し、次に基本的な光学顕微鏡可視化を用いて極性反転を確認する。頂端アウトエンテロイドは外観が非常に細胞的であるが、側底外側エンテロイドはしばしば大きな中央内腔の存在または出芽によって支配される( 補足図1を参照)。
      注:手順が標準化されると、頂端アウトへの変換率は通常95%を超えます。頂端アウトエンテロイドの使用は終末実験として意図されているが、理論的にはアピカルアウトエンテロイドを少数の側底外側アウトエンテロイドに通過させることは可能である。
3. アピカルアウトNECインディッシュ
   注:エンテロイドの極性が逆になったら、頂端アウトコンフォメーションの寿命が3〜4日を超えて確認されていないため、その後の実験で培養物を素早く使用してください。以下のNECインディッシュモデルでは、エンテロイドを24時間処理し、その後すぐに回収し、下流の実験のために保存した。
   1. エンテロイドが少なくとも95%の効率で視覚的に極性が逆転したら、プレートをインキュベーターから取り出し、24ウェルプレートの8ウェルを15mL円錐管に集めます。頂端アウトエンテロイドは懸濁液中であるため、エンテロイド/培地溶液をピペットでピペットするだけです。15 mLチューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
   2. 細胞がペレット化されたら、上清を除去し、細胞ペレットを1x PBS(対照)の所望の容量(ここでは最大処理量と一致するように10μL)と混合した4mLのAFMに再懸濁する(ここでは10μLを加えた)。
   3. 500 μL のエンテロイド/PBS/AFM 懸濁液を 24 ウェル超低付着プレートの 8 ウェルにピペットで入れ、プレートを 37 °Cおよび 5%_{CO2 で 24} 時間インキュベートします。
   4. 手順 1.3.1.-1.3.3 を繰り返します。正常酸素でのTNF-α(20 ng/mLおよび50 ng/mL)およびLPS(100 μg/mLおよび200 μg/mL)処理用。すべての低酸素治療について、ステップ1.3.1.-1.3.3を繰り返しますが、プレートを37°C、5%CO2、および1%_O2の別のインキュベーターに24時間置きます。
      メモ: ステップ 1.3.4.ステップ1.3.1.-1.3.3と同時に行うことができますが、わかりやすくするために、上記の手順は複雑さを軽減するために処理によって分離されています。

2. 免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡

1. 染色液の調製
   1. 1 μL の Triton X-100 を 1x PBS 中で 7 mL の最終容量に混合して、0.1% Triton X-100 を調製します。PBST(PBS-Tween)を30 μLのTween-20を1x PBSに30 mLの最終容量に加えることによって調製する。
   2. 6.3 mL の PBST に 700 μL の NDS を加えて、10% 正常ロバ血清 (NDS)/PBST を調製します。PBSTに70 μLのNDSを最終容量7 mL となるように添加して、1% NDS/PBST を調製します。
      注:ロバ血清は、二次抗体宿主と相関させるためにここで使用された。しかしながら、ブロッキング血清種は、非特異的結合を適切にブロックするために二次抗体種と一致するべきである。
2. 染色(1日目)
   1. 24ウェルプレートの4ウェルの内容物を1.5mL微量遠心チューブに移す。すべての所望のウェル/治療について、各処理を別々のチューブに入れて繰り返します。チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 腸ロイドがペレット化されたら、上清を除去する。
   2. 細胞ペレットを300 μLの4%ホルムアルデヒド固定液に室温(RT)で30分間再懸濁します。30分後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを500μLの滅菌RT 1x PBSで洗浄した。
   3. チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 上清を除去し、0.1% Triton X-100 を 500 μL 加え、RT で 1 時間放置します。
   4. 1時間後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去する。500 μL の 1x PBS で洗浄し、チューブを回転子またはシェーカーに 200 rpm で 2 ~ 8 °C で 15 分間置きます。 これを合計4倍繰り返します。
   5. チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。500 μL の 10% NDS/PBST を加え、RT で 45 分間インキュベートします。インキュベーション中、24ウェルプレートの8ウェルに、組換え抗ビリン抗体20 μL、E-カドヘリン抗体10 μL、および1% NDS/PBST1970 μLを組み合わせて一次抗体溶液を調製します。
   6. 45分間のインキュベーションの後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 チューブを氷の上に置きます。上清を除去し、250 μLの一次抗体溶液と交換する。チューブを2〜8°Cで一晩インキュベートする。
3. 染色(2日目)
   1. チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットのサイズに応じて、PBSTを各チューブに250〜500μL加え、2〜8°Cで1時間200rpmで回転子またはシェーカーの上に置く。 PBST洗浄を4回繰り返します。
   2. 50%グリセロールに52 μLのCy3ロバ抗ウサギIgG(H + L)を、5.2 μLのロバ抗マウス蛍光緑色488二次抗体を5142.8 μLの1% NDS/PBSTに添加して、二次抗体溶液を調製する。
   3. 最後のPBST洗浄および遠心分離に続いて、上清をチューブから取り除いた。各チューブに200 μLの二次抗体溶液を分注し、暗所で2〜8°Cで一晩インキュベートする。
4. 染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(1日目)
   1. 青色核色素を含むグリセロールベースのマウント剤を1時間かけてRTに持ち込みます。
   2. チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 100 μLの上清を除去し、残りの〜100 μLの上清に細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を0.5 mLチューブに移す。
   3. チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの遠赤色核酸染色剤に再懸濁した。チューブをRTで10分間インキュベートする。
   4. チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁する。2回目の洗浄を繰り返します。
   5. チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化し、上清70μLを除去する。PBSの残りの容量に細胞を再懸濁し、内容物をラベル付きカバースリップ(24 mm x 60 mm)に移します。
   6. 75 μLのマウント剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を除去します。カバースリップが暗闇の中でRTで一晩(18-24時間)硬化するのを待ちます。
5. 染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(2日目)
   1. 一晩硬化させた後、グリセロールの薄い層(〜15μL)をカバースリップに塗布する。カバースリップをスライドガラスに取り付け、所定の位置に静かに押し込みます。カバースリップとスライドの間にある泡をタップして取り除きます。
   2. カバースリップを暗闇の中でRTに最低2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でイメージングします。様々な共焦点取得法を用いたエンテロイドの顕微鏡的可視化については、Lallemantら³⁷を参照されたい。
6. 免疫蛍光定量
   注:この方法は、ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/)を使用してバックグラウンドシグナルを除去することによって、補正された総蛍光を決定します。
   1. ImageJで共焦点画像を開き、関心領域(ROI)ツールを使用して目的の領域を概説します。
   2. ユーザー定義のパラメータを設定するには、[ 分析]>[測定値の設定]に移動します。[設定]タブで[ 面積>積分密度]>[平均グレー値 ]を選択します。
   3. [ 分析とメジャー] に移動>ます。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。これらの測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
   4. 背景信号を減算するには、画像の小さな非蛍光領域を選択します。その地域の [分析>メジャー] に移動します。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。出力をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
   5. 選択した細胞の面積にバックグラウンド読み取り値の平均蛍光を乗算し、積分密度から合計を減算して、補正された総細胞蛍光(CTCF)を計算する。スプレッドシートまたは統計ソフトウェアパッケージに記録を保持しながら、関心のあるすべての画像について上記の手順を繰り返します( 材料表を参照)。

3. アディッシュ内のNEC細胞生存率

1. 腸科治療
   1. ステップ1のように、24時間にわたって頂端出力NECインディッシュモデルを確立します。
   2. 細胞生存率測定試薬を4°Cで一晩解凍する。 アッセイ当日、使用の30分前に試薬をRTに持参してください。試薬を反転させて混合します。
   3. アッセイを実行する前に、各ウェルから100 μLの培地を除去し、残りの400 μLを残します。
   4. 内容物をプレートシェーカー上でRTで200rpmで5分間激しくよく混合し、細胞溶解を誘導した。振盪後、プレートをRTでさらに25分間インキュベートする。
   5. 25分間のインキュベーション後、ピペッティングを介して1ウェルの内容物を混合し、800μLの200μLを96ウェルの不透明なポリスチレン製透明底プレートのシングルウェルに移します。残りの600 μLについて繰り返し、ウェルあたり4回のテクニカルレプリケートを作成します。このようにして24ウェルプレートの各ウェルの残りの内容物を96ウェルプレートに移す。
   6. 発光可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、治療間の相対値を比較します。あるいは、処理発光をアデノシン三リン酸(ATP)標準と比較する。

結果

腸の炎症をモデル化するための腸溶の使用は、壊死性腸炎の文脈の中でも、現在一般的である。しかしながら、現在利用されているほとんどの方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを欠いているか、経口治療薬としての最終的な使用を意図した化合物の生理学的関連性を否定するか、またはエンテロイド由来単分子層と同様に技術的に困難で時間がかかる。NECの現在のin vitro?...

ディスカッション

腸上皮陰窩に由来する腸様モデルの最近の開発は、壊死性腸炎の病因を研究するためのより生理学的に関連する in vitro 組織を可能にする。腸上皮のすべての主要な分化細胞型を含むにもかかわらず、3Dエンテロイドは依然としていくつかの重要な制限を受ける。従来の、側底外側エンテロイドは、3D ECMヒドロゲルドームに懸濁されており、その組成および密度は、組織培養環境

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5