In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Resumen

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

Resumen

La enterocolitis necrosante (ECN) es una enfermedad devastadora que afecta a los recién nacidos prematuros, caracterizada por inflamación intestinal y necrosis. Los enteroides han surgido recientemente como un sistema prometedor para modelar patologías gastrointestinales. Sin embargo, los métodos utilizados actualmente para la manipulación enteroide carecen de acceso a la superficie apical del epitelio (tridimensional [3D]) o consumen mucho tiempo y recursos (monocapas bidimensionales [2D]). Estos métodos a menudo requieren pasos adicionales, como la microinyección, para que el modelo se vuelva fisiológicamente traducible. Aquí, describimos un protocolo fisiológicamente relevante y económico para estudiar NEC in vitro invirtiendo la polaridad enteroide, lo que resulta en la superficie apical hacia afuera (apical-out). También se proporciona un protocolo de tinción inmunofluorescente para examinar la integridad de la barrera enteroide y la expresión de proteínas de unión después de la exposición al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o lipopolisacárido (LPS) en condiciones normóxicas o hipóxicas. También se evalúa la viabilidad de enteroides apicales 3D expuestos a LPS normóxico o hipóxico o TNF-α durante 24 h. Los enteroides expuestos a LPS o TNF-α, en combinación con hipoxia, exhibieron una interrupción de la arquitectura epitelial, una pérdida de la expresión de proteínas de unión adherentes y una reducción en la viabilidad celular. Este protocolo describe un nuevo modelo apical-out NEC-in-a-dish que presenta una plataforma fisiológicamente relevante y rentable para identificar posibles objetivos epiteliales para terapias NEC y estudiar la respuesta intestinal prematura a la terapéutica.

Introducción

La enterocolitis necrosante (ECN), una enfermedad inflamatoria grave del intestino delgado que ocurre en hasta 10% de los recién nacidos prematuros, se asocia comúnmente con alta morbilidad y mortalidad ^1,2. Las tasas de mortalidad cercanas al 50% en lactantes de muy bajo peso al nacer (<1500 g), que requieren intervención quirúrgica, no son infrecuentes³. Mientras que la etiología exacta de la ECN no se comprende actualmente, se cree que los factores de riesgo, como la alimentación con fórmula, se combinan con anomalías fisiológicas, como disbiosis, epitelio intestinal inmaduro y barrera intestinal disfuncional, en el desarrollo de la enfermedad ^2,4. A pesar de los esfuerzos significativos, se ha avanzado poco en la prevención o el tratamiento de la ECN en la última década⁵. Se requiere un nuevo método in vitro para estudiar la ECN y la disfunción de la barrera epitelial intestinal asociada para avanzar en la comprensión de la patogénesis de la enfermedad, ya que los hallazgos de modelos animales, hasta ahora, se han traducido mal a la cabecera^6.

Se han utilizado varios modelos in vitro para investigar los mecanismos en juego durante la ECN. La línea celular epitelial intestinal humana, Caco-2, se encuentra entre los modelos in vitro más utilizados de NEC ^7,8. Las células Caco-2 emulan las características morfológicas del borde en cepillo del intestino delgado, pero, como línea celular, no se diferencian en la amplia variedad de tipos de células in vivo, incluidas las células caliciformes productoras de moco, requeridas para un modelo altamente traducible. HT-29-MTX, células de adenocarcinoma de colon humano, incluyen un fenotipo mixto de enterocito y cáliz, pero aún carecen de tipos de células basadas en criptas del epitelio intestinal⁹. IEC-6 e IEC-18 son líneas celulares no transformadas con una morfología ileal inmadura similar a la cripta pero no se derivan de tejido humano, lo que limita su capacidad de traducción. Las líneas celulares intestinales FH 74-Int y H4 se derivan del tejido fetal humano y no forman uniones estrechas ni monocapas polarizadas^10,11, y por lo tanto son inmaduras en comparación incluso con los bebés más prematuros susceptibles a la ECN. Por lo general, los modelos in vitro de NEC utilizan tratamientos de lipopolisacáridos (LPS) para inducir el receptor tipo toll 4 (TLR4), un receptor importante que inicia la inflamación intestinal en NEC¹². El daño mediado por el tratamiento con especies reactivas de oxígeno (ROS), típicamente a través del peróxido de hidrógeno, se utiliza a menudo para inducir daño oxidativo similar al NEC y apoptosis^13,14. Como principal impulsor de la inflamación intestinal, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), un componente posterior de la señalización inflamatoria TLR4, también se utiliza comúnmente en estos modelos in vitro para imitar la patogénesis in vivo ¹⁵.

Los organoides, generados a partir de células madre pluripotentes inducibles (iPSCs), han crecido en popularidad como modelo in vitro del intestino debido a su capacidad para recapitular la compleja arquitectura in vivo y la composición de tipo celular del tejido del que se derivan^16,17. Un sistema in vitro relacionado, los enteroides, son organoides derivados de criptas intestinales resecadas que son más fáciles de establecer y mantener que los organoides derivados de iPSC. Los enteroides se cultivan típicamente en una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) con acceso experimental limitado a la superficie celular basolateral. Se han desarrollado métodos, como la microinyección^18,19, para superar esta barrera a la superficie apical^, pero la acumulación de desechos celulares desprendidos y moco dentro del lumen hace que la microinyección sea técnicamente difícil e inconsistente. Como las plataformas de microinyección robótica personalizadas no son ampliamente accesibles²⁰, la variabilidad de laboratorio a laboratorio en la capacidad técnica y la técnica general se convierten en variables significativas para superar con los protocolos de microinyección. Las monocapas bidimensionales (2D) derivadas de enteroides 3D disociados, que aún comprenden todos los principales tipos celulares del epitelio intestinal, permiten el acceso a la superficie apical, pero tradicionalmente han sido difíciles de mantener sin una capa alimentadora de miofibroblastos mesenquimales²¹. Mientras que los soportes permeables al cultivo celular pueden ser utilizados para acceder tanto al lado apical como basolateral de monocapas enteroides sin el uso de miofibroblastos subyacentes, estos insertos requieren escisión y montaje de la membrana antes de su uso con modalidades como la microscopía confocal, lo que resulta en un proceso técnicamente más exigente y difícil cuando se utilizan métodos tradicionales de microscopía²². NEC se ha modelado in vitro utilizando enteroides 3D tradicionales 23,24,25 y soportes permeables 26,27, y la inflamación intestinal se ha replicado recientemente con modelos gut-on-a-chip^28,29. Si bien los modelos gut-on-a-chip que incorporan microfluídica son, con mucho, los modelos más avanzados y traducibles, esta tecnología es costosa, compleja e inaccesible para la mayoría de los investigadores³⁰.

Los avances recientes en las técnicas de enteroides apical-out han permitido un acceso más fácil a la superficie apical de enteroides 3D sin correr el riesgo de dañar la integridad estructural del epitelio in vitro ^31,32,33. Los enteroides apicales comparten la composición del tipo celular y la función de barrera del epitelio intestinal in vivo, pero, a diferencia de los enteroides 3D típicos, las superficies apicales de estas células se enfrentan al medio de cultivo, lo que permite estudios fisiológicamente más relevantes sobre la absorción de nutrientes, la infección microbiana y la secreción luminal³¹. Una ventaja adicional de los enteroides apicales es la capacidad de distribuir homogéneamente agentes experimentales a enteroides. No se requiere variar los volúmenes de tratamiento según el tamaño enteroide, como ocurre con la microinyección, y la capacidad de mantener estos enteroides en cultivo en suspensión niega cualquier interferencia de la ECM en la difusión del agente experimental³².

La enterocolitis necrosante es una enfermedad multifactorial que involucra múltiples tipos de células epiteliales intestinales y una variedad de factores ambientales y fisiopatológicos³⁴. La composición celular variada de los enteroides intestinales es una clara mejora sobre los monocultivos en el modelado de una enfermedad compleja como la ECN. Curiosamente, mientras que una sola exposición inflamatoria es a menudo suficiente para inducir daño en monocultivos in vitro , los enteroides, como con los modelos de ratón²³, parecen requerir un mínimo de dos componentes inflamatorios para inducir un daño similar al NEC⁶. Aquí, presentamos un modelo apical-out NEC-in-a-dish, utilizando enteroides apical-out en combinación con hipoxia (una característica clínica importante de NEC⁶) y LPS o TNF-α, como un modelo in vitro mejorado y fisiológicamente más relevante para estudiar las respuestas epiteliales a la inflamación similar a la ECN y, potencialmente, identificar objetivos terapéuticos. Describimos un protocolo para invertir la polaridad de enteroides 3D del intestino delgado, así como un protocolo de tinción inmunofluorescente para identificar la interrupción de la barrera epitelial y las alteraciones de la expresión de proteínas de unión. Finalmente, demostramos además un ensayo de viabilidad enteroide simple para determinar el impacto de nuestro modelo NEC-in-a-a-dish de doble golpe y salida apical.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma. Se obtuvieron muestras de conveniencia del intestino delgado de un primate no humano prematuro (NHP, 90% de gestación, babuino olivo, Papio anubis) después de la eutanasia para un estudio separado (Protocolo # 101523-16-039-I).

1. Establecimiento del modelo enteroide apical-out NEC-in-a-dish

1. Preparación de tratamientos de medios y enteroides
   NOTA: Una vez preparado siguiendo la técnica aséptica estándar, el medio se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
   1. Prepare medios libres de antibióticos (AFM) mezclando 50 ml de medios de crecimiento de organoides humanos con 50 ml de suplemento organoide (consulte la Tabla de materiales). Preparar 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético/solución salina tamponada con fosfato (EDTA/PBS) añadiendo 100 μL de 0,5 M EDTA a 9.900 μL de PBS.
   2. Enfriar el medio del águila modificada de Dulbecco/nutriente Mezcla de jamón F12 + 15 mM HEPES Tampón (DMEM/F12) a 2-8 °C.
   3. Preparar la solución madre de TNF-α suspendiendo 100 μg de polvo de TNF-α en 1 ml de 1x PBS. Diluya aún más el stock de TNF-α a concentraciones de 20 ng / ml y 50 ng / ml utilizando AFM como solvente. Prepare la solución madre de LPS suspendiendo 2 mg de LPS en 1 ml de 1x PBS. Diluir más LPS madre diluido a 100 μg/ml y 200 μg/ml utilizando AFM como disolvente.
2. Invertir la polaridad de enteroides 3D
   NOTA: El siguiente procedimiento está diseñado para la inversión de una sola placa de cultivo de tejido de fondo plano de 24 pocillos en dos placas de cultivo de tejido de fijación ultra baja de 24 pocillos. Las placas de cultivo de tejidos deben calentarse a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de su uso. La derivación de enteroides 3D basolaterales hacia fuera se logró como se describió previamente por muchos grupos^35,36, con ligeras modificaciones para los medios (detallados anteriormente). El procedimiento general de derivación enteroide no difiere del de los humanos. En resumen, el tejido extirpado se lava, se corta en pequeños fragmentos y se incuba en un tampón de interrupción celular. La solución celular se ejecuta a través de un filtro celular de 70 μM, lo que resulta en criptas que se chapan en una alta densidad.
   1. Aspirar medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos.
   2. Agregue 500 μL de EDTA/PBS helado de 5 mM a cada pocillo de la placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal/domo ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta p200 un mínimo de 5x-6x.
   3. Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cónico de 15 ml y agregue 8 ml de EDTA/PBS helado al tubo cónico. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera.
   4. Incubar tubos cónicos de 15 ml a 4 °C durante 1 h en una plataforma giratoria o agitador a 330 rpm. Después de la incubación de 1 h, centrifugar los tubos cónicos a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire y deseche el sobrenadante de cada tubo.
   5. Combine y lave los gránulos celulares con 5 ml de DMEM/F12 y distribuya la suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 ml.
   6. Granular las células centrifugando a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 12 ml de AFM a cada tubo, asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.
   7. Pipetear 500 μL de la suspensión enteroide en cada pocillo de dos placas de fijación ultrabaja de 24 pocillos.
   8. Incubar las placas a 37 °C y 5% de_CO2 durante 2-5 días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad.
   9. Para verificar la reversión enteroide, primero establezca la tinción inmunofluorescente confirmatoria y el tiempo promedio de reversión (~ 3 días), luego confirme la inversión de polaridad utilizando una visualización básica de microscopio óptico. Los enteroides apicales son muy celulares en apariencia, mientras que los enteroides basolaterales a menudo están dominados por la presencia de una gran luz central o gemación (ver Figura suplementaria 1).
      NOTA: Una vez que el procedimiento ha sido estandarizado, la tasa de conversión a apical-out típicamente supera el 95%. El uso de enteroides apicales de salida pretende ser un experimento terminal, aunque teóricamente es posible pasar enteroides apicales a un pequeño número de enteroides basolaterales.
3. Salida apical NEC-in-a-dish
   NOTA: Una vez que los enteroides hayan invertido la polaridad, use los cultivos en experimentos posteriores rápidamente, ya que su longevidad en la conformación apical-out no se ha confirmado más allá de 3-4 días. Para el siguiente modelo de NEC en un plato, los enteroides se trataron durante 24 h, luego se recolectaron inmediatamente después y se conservaron para experimentos posteriores.
   1. Una vez que los enteroides hayan invertido visualmente la polaridad con al menos un 95% de eficiencia, retire las placas de la incubadora y recoja ocho pocillos de una placa de 24 pocillos en un tubo cónico de 15 ml. Como los enteroides apical-out están en suspensión, simplemente pipetea la solución enteroide/media. Centrifugar el tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
   2. Una vez que las células estén peletizadas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 4 ml de AFM mezclado con el volumen deseado (10 μL aquí para que coincida con el volumen de tratamiento más alto agregado) de 1x PBS (control).
   3. Pipetear 500 μL de suspensión enteroide/PBS/AFM en ocho pocillos de una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos e incubar la placa a 37 °C y 5% de_CO2 durante 24 h.
   4. Repita los pasos 1.3.1.-1.3.3. para los tratamientos TNF-α (20 ng/ml y 50 ng/ml) y LPS (100 μg/ml y 200 μg/ml) en normoxia. Para todos los tratamientos de hipoxia, repita los pasos 1.3.1.-1.3.3., pero coloque la placa en una incubadora separada a 37 °C, 5% de CO2 y 1% de_O2 durante 24 h.
      NOTA: Paso 1.3.4. se puede hacer simultáneamente con los pasos 1.3.1.-1.3.3, pero, para mayor claridad, el procedimiento anterior se separó por tratamiento para reducir la complejidad.

2. Tinción inmunofluorescente y microscopía confocal

1. Preparación de soluciones de tinción
   1. Preparar Triton X-100 al 0,1% mezclando 7 μL de Triton X-100 en 1x PBS hasta un volumen final de 7 mL. Prepare PBST (PBS-Tween) agregando 30 μL de Tween-20 a 1x PBS a un volumen final de 30 ml.
   2. Prepare suero de burro normal (NDS)/PBST al 10% agregando 700 μL de NDS a 6.3 ml de PBST. Preparar NDS/PBST al 1% añadiendo 70 μL de NDS a PBST a un volumen final de 7 ml.
      NOTA: El suero de burro se utilizó aquí para correlacionarse con el huésped de anticuerpos secundario. Sin embargo, las especies de suero bloqueantes deben coincidir con las especies de anticuerpos secundarias para bloquear adecuadamente la unión no específica.
2. Tinción (Día 1)
   1. Transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Repita para todos los pozos / tratamientos deseados, con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Una vez que los enteroides estén peletizados, retire el sobrenadante.
   2. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de fijador de formaldehído al 4% durante 30 min a temperatura ambiente (RT). Después de 30 min, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y lavar el pellet con 500 μL de ESTÉRIL, RT 1x PBS.
   3. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de Triton X-100 al 0,1%, y deje reposar durante 1 h en RT.
   4. Después de 1 h, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lavar con 500 μL de 1x PBS y colocar los tubos en un rotador o agitador a 200 rpm durante 15 min a 2-8 °C. Repita esto un total de 4x.
   5. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 500 μL de NDS/PBST al 10% e incubar a RT durante 45 min. Durante la incubación, preparar soluciones de anticuerpos primarios combinando 20 μL de anticuerpo antivillina recombinante, 10 μL de anticuerpo E-cadherina y 1970 μL de NDS/PBST al 1% para ocho pocillos de una placa de 24 pocillos.
   6. Después de la incubación de 45 minutos, centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Coloque los tubos sobre hielo. Retire el sobrenadante y sustitúyalo por 250 μL de solución de anticuerpos primarios. Incubar los tubos durante la noche a 2-8 °C.
3. Tinción (Día 2)
   1. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Añadir 250-500 μL de PBST a cada tubo, dependiendo del tamaño del pellet, y colocar en el rotador o agitador a 200 rpm durante 1 h a 2-8 °C. Repita el lavado PBST 4x.
   2. Preparar la solución secundaria de anticuerpos añadiendo 52 μL de Cy3 burro anti-conejo IgG (H + L) al 50% de glicerol y 5,2 μL de anticuerpos secundarios verde fluorescente 488 de burro a 5142,8 μL de NDS/PBST al 1%.
   3. Después del último lavado y centrifugación de PBST, retire el sobrenadante de los tubos. Dispensar 200 μL de solución de anticuerpos secundarios en cada tubo e incubar en la oscuridad durante la noche a 2-8 °C.
4. Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 1)
   1. Lleve el montante a base de glicerol que contenga colorante nuclear azul a RT durante 1 h.
   2. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 4 min a 4 °C. Retire 100 μL del sobrenadante y resuspenda las células en los ~100 μL restantes de sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a tubos de 0,5 ml.
   3. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 100 μL de tinción de ácido nucleico rojo lejano. Incubar los tubos a RT durante 10 min.
   4. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células. Retire el sobrenadante y resuspenda los gránulos celulares en 100 μL de 1x PBS. Repita para un segundo lavado.
   5. Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 s para granular las células y eliminar 70 μL del sobrenadante. Vuelva a suspender las celdas en el volumen restante de PBS y transfiera el contenido a un cubreobjetos etiquetado (24 mm x 60 mm).
   6. Aplicar 75 μL de montante directamente sobre la muestra y eliminar las burbujas con la punta de una pipeta. Deje que los cubreobjetos se curen durante la noche (18-24 h) en RT en la oscuridad.
5. Montaje de enteroides apicales teñidos (Día 2)
   1. Después de curar durante la noche, aplique una capa delgada (~ 15 μL) de glicerol a los cubreobjetos. Monte el cubreobjetos en la corredera de vidrio y presione suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre el cubreobjetos y la corredera.
   2. Deje que el cubreobjetos se fije en RT en la oscuridad durante un mínimo de 2 h, antes de obtener imágenes con un aumento de 20x con un microscopio confocal. Para la visualización microscópica de enteroides utilizando diversos métodos de adquisición confocal, véase Lallemant et ^al.37.
6. Cuantificación inmunofluorescente
   NOTA: Este método determina la fluorescencia total corregida eliminando la señal de fondo utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Abra las imágenes confocales en ImageJ y delinee el área deseada con la herramienta de región de interés (ROI).
   2. Para definir parámetros definidos por el usuario, vaya a Analizar > Establecer medidas. Seleccione Área > Densidad integrada > Valor gris medio en la pestaña de configuración.
   3. Desplácese hasta Analizar > medir. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega estas medidas en una hoja de cálculo.
   4. Para restar la señal de fondo, seleccione una pequeña área no fluorescente de la imagen. Vaya a Analizar > medida para esa región. Aparecerá una ventana emergente con las mediciones. Copia y pega la salida en una hoja de cálculo.
   5. Multiplique el área de la célula seleccionada por la fluorescencia promedio de las lecturas de fondo y reste la suma de la densidad integrada para calcular la fluorescencia celular total corregida (CTCF). Repita los pasos anteriores para todas las imágenes de interés, mientras mantiene los registros en una hoja de cálculo o paquete de software estadístico (consulte Tabla de materiales).

3. Viabilidad celular de NEC en un plato apical

1. Tratamientos enteroides
   1. Establezca el modelo NEC-in-a-dish apical-out durante 24 h, como en el Paso 1.
   2. Reactivo del ensayo de viabilidad celular de descongelación durante la noche a 4 °C. El día del ensayo, lleve el reactivo a RT 30 min antes de usarlo. Invierta el reactivo para mezclar.
   3. Antes de realizar el ensayo, retire 100 μL de medio de cada pocillo, dejando los 400 μL restantes. Agregue 400 μL de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.
   4. Mezclar vigorosamente bien el contenido en un agitador de placas a RT durante 5 min a 200 rpm para inducir la lisis celular. Después de agitar, incubar el plato en RT durante 25 minutos adicionales.
   5. Después de 25 minutos de incubación, mezclar el contenido de un pocillo mediante pipeteo y transferir 200 μL de los 800 μL a un solo pocillo de una placa de 96 pocillos, opaca, de poliestireno y fondo transparente. Repita para los 600 μL restantes, creando cuatro réplicas técnicas por pozo. Transfiera el contenido restante de cada pocillo de la placa de 24 pocillos a una placa de 96 pocillos de esta manera.
   6. Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 ms de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. Alternativamente, compare la luminiscencia del tratamiento con un estándar de trifosfato de adenosina (ATP).

Resultados

El uso de enteroides para modelar la inflamación intestinal, incluso en el contexto de la enterocolitis necrosante, es ahora común. Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados actualmente carecen de acceso a la superficie apical de los enteroides, negando la relevancia fisiológica de los compuestos destinados a su uso eventual como terapéutica oral, o son técnicamente difíciles y requieren mucho tiempo, como con las monocapas derivadas de enteroides. Para aumentar la utilidad de los modelos enteroides i...

Discusión

El reciente desarrollo de modelos enteroides derivados de criptas epiteliales intestinales permite un tejido in vitro fisiológicamente más relevante en el que estudiar la patogénesis necrosante de la enterocolitis. A pesar de incluir todos los principales tipos de células diferenciadas del epitelio intestinal, los enteroides 3D todavía están sujetos a varias limitaciones significativas. Los enteroides convencionales basolaterales están suspendidos en domos de hidrogel 3D ECM, cuya composición y densidad ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5