需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
* 这些作者具有相同的贡献
本协议描述了 秀丽隐杆线虫液体和平板培养物中的脂质补充方法,以及来自大量或少数蠕虫和蠕虫组织的纵向研究和基因转录分析。
衰老是一个复杂的过程,其特征是由环境和遗传贡献引起的渐进式生理变化。脂质在构成细胞膜的结构成分、储存能量和作为信号分子方面至关重要。脂质代谢和信号传导的调节对于激活不同的长寿途径至关重要。 秀丽隐杆线虫 是一种优秀而强大的生物体,可以剖析脂质代谢和信号传导对长寿调节的贡献。多项研究描述了特定脂质分子的饮食补充如何延长 秀丽隐杆线虫 的寿命;然而,补充条件的微小差异可能会导致不同实验室的科学家之间的可重复性问题。在这里,报道了秀 丽隐杆线虫 的两种详细补充方法,采用脂质补充,将细菌接种在平板上或在液体培养物中细菌悬浮液。本文还提供了使用全蠕虫裂解物或来自少数蠕虫的解剖组织进行终身脂质补充和qRT-PCR分析的寿命测定的详细信息。结合纵向研究和脂质补充转录研究,喂养测定提供了可靠的方法来剖析脂质如何影响长寿和健康老龄化。该方法还可以适用于各种营养筛查方法,以使用少量解剖组织或少数动物来评估转录本子集的变化。
血脂
脂质是可溶于有机溶剂但不溶于水的小疏水性或两亲性分子1,2。不同的脂质分子根据其链中所含的碳数量、位置、双键数量和结合结构(包括甘油或磷酸盐)相互区分。脂质在不同细胞内和跨不同细胞发挥关键作用,以调节生物体功能,包括构成膜双层、提供能量储存和充当信号分子3,4。
首先,脂质是生物膜的结构成分,包括将内部隔室与细胞外环境分开的质膜和细胞内亚细胞膜。其次,脂质是脊椎动物和无脊椎动物能量储存的主要形式。中性脂质,包括三酰基甘油,在各种组织中长时间储存,包括脂肪组织。在线虫秀丽隐杆线虫中,肠道是主要的代谢脂肪储存器官;它的功能不仅参与营养物质的消化和吸收,还参与解毒过程,类似于哺乳动物肝细胞的活性。其他脂肪储存组织包括种系,其中脂质对卵母细胞发育至关重要,以及由皮肤样表皮细胞组成的皮下组织3,5。第三,近年来,越来越多的证据表明,脂质是参与细胞内和细胞外信号传导的强大信号分子,通过直接作用于多种受体,包括G蛋白偶联和核受体,或通过膜流动性调节或翻译
图1 描述了使用不同实验设置的脂质喂养示意图。
1. 脂质条件细菌的制备
在补充脂质时使用一些全虫验证转录变化
为了研究从几个全蠕虫中提取和逆转录RNA到cDNA的方案是否可重现并与来自散装蠕虫的数据进行比较,采用了一种在肠道中过表达溶酶体酸性脂肪酶lipl-4的长寿命蠕虫菌株7,8,33,35。先前研究7,8
脂质补充剂已被用于衰老研究,以阐明某些脂质物种对健康衰老的直接影响6,7,23,26,27,31。然而,脂质补充过程可能具有挑战性,实验之间的任何不一致都可能导致不可重复的结果。在这里,记录了第一个详细的分步协议,以指导新科学家避?.......
作者没有利益冲突。
我们感谢 P. Svay 的维护支持。这项工作得到了NIH资助R01AG045183(MCW),R01AT009050(MCW),R01AG062257(MCW),DP1DK113644(MCW),March of Dimes基金会(MCW),韦尔奇基金会(MCW),HHMI研究员(MCW)和NIH T32 ES027801博士前学生研究员(MS)的支持。一些菌株由CGC提供,CGC由NIH研究基础设施计划办公室(P40 OD010440)资助。
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Pestle | Genesee Scientific | 93-165P15 | For worm grinding with Trizol |
Agarose | Sigma | A9639-500G | |
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix | GenDEPOT | R5600 | For reverse transcription from bulk worm samples |
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR | ThermoFisher | A28567 | For qRT-PCR |
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1248 | For spin down PCR tubes |
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip | Branson Ultrasonic Corporation | 100-132-888R | |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
Cholesterol | Sigma | C8503-25G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-100ML | |
Eppendorf 5424 R centrifuge | Eppendorf | 22620444R | For RNA extraction |
Eppendorf vapo protect mastercycler pro | Eppendorf | 950030010 | For reverse transcription |
Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate | Neta Scientific | 665180 | 12-well plates for licuid feeding |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm | Neta Scientific | 664161 | For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates |
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm | Neta Scientific | 628161 | For worm6-cm NGM plates |
Invitrogen nuclease-free water | ThermoFisher | AM9937 | |
Isoproanol | Sigma | PX1835-2 | |
Levamisole hydrochloride | VWR | SPCML1054 | |
lipl-4Tg | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
lipl-4Tg;fat-3(wa22) | MCW Lab | N/A | Transgenic C. elegans |
Luria Broth Base | ThermoFisher | 12795-084 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643-500G | |
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode | ThermoFisher | 4483354 | 96-well qPCR plate |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied BioSystem | 4311971 | For sealing the 96-well qPCR plate |
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System | Sigma | Z00Q0V0WW | Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol |
N2 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | C. elegans wild isolate |
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | ThermoFisher | N/A | For measuring RNA concentration |
OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | N/A | Bacteria used as C. elegans food |
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O) | Sigma | P5504-1KG | |
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P0662-2.5KG | |
Power SYBR Green cells-to-Ct kit | ThermoFisher | 4402953 | For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue |
Power SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4367659 | For qPCR from bulk worm samples |
Pure Bright germicidal ultra bleach | KIK International LLC. | 59647210143 | 6% house bleach For worm egg preparation |
Pyrex spot plate with nine depressions | Sigma | CLS722085-18EA | Watch glass for dissecting the worms |
RNaseZap RNase Decontamination Solution | ThermoFisher | AM9780 | |
Sodium cloride (NaCl) | Sigma | S7653-1KG | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | SX0590-3 | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Sigma | S9390-1KG | |
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge | Thermo | 7500-4337 | For bacteria collection |
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge | Thermo | 7500-7200 | For worm egg preparation |
TRIzol Reagent | TheroFisher | 15596018 | RNA extraction reagent |
Turbo DNA-free kit | ThermoFisher | AM1907 | For removing DNA contamination in RNA extractions |
Vortexer 59 | Denville Scientific INV | S7030 | |
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor | VWR | 47747-370 | For worm grinding with Trizol |
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115 | VWR | N/A | For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064 |
Worm picker | WormStuff | 59-AWP |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可探索更多文章
This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。