秀丽隐杆线虫长寿的脂质补充和基因转录分析

摘要

本协议描述了 秀丽隐杆线虫液体和平板培养物中的脂质补充方法，以及来自大量或少数蠕虫和蠕虫组织的纵向研究和基因转录分析。

摘要

衰老是一个复杂的过程，其特征是由环境和遗传贡献引起的渐进式生理变化。脂质在构成细胞膜的结构成分、储存能量和作为信号分子方面至关重要。脂质代谢和信号传导的调节对于激活不同的长寿途径至关重要。 秀丽隐杆线虫 是一种优秀而强大的生物体，可以剖析脂质代谢和信号传导对长寿调节的贡献。多项研究描述了特定脂质分子的饮食补充如何延长 秀丽隐杆线虫 的寿命;然而，补充条件的微小差异可能会导致不同实验室的科学家之间的可重复性问题。在这里，报道了秀 丽隐杆线虫 的两种详细补充方法，采用脂质补充，将细菌接种在平板上或在液体培养物中细菌悬浮液。本文还提供了使用全蠕虫裂解物或来自少数蠕虫的解剖组织进行终身脂质补充和qRT-PCR分析的寿命测定的详细信息。结合纵向研究和脂质补充转录研究，喂养测定提供了可靠的方法来剖析脂质如何影响长寿和健康老龄化。该方法还可以适用于各种营养筛查方法，以使用少量解剖组织或少数动物来评估转录本子集的变化。

引言

血脂
脂质是可溶于有机溶剂但不溶于水的小疏水性或两亲性分子^1，2。不同的脂质分子根据其链中所含的碳数量、位置、双键数量和结合结构（包括甘油或磷酸盐）相互区分。脂质在不同细胞内和跨不同细胞发挥关键作用，以调节生物体功能，包括构成膜双层、提供能量储存和充当信号分子^3，4。

首先，脂质是生物膜的结构成分，包括将内部隔室与细胞外环境分开的质膜和细胞内亚细胞膜。其次，脂质是脊椎动物和无脊椎动物能量储存的主要形式。中性脂质，包括三酰基甘油，在各种组织中长时间储存，包括脂肪组织。在线虫秀丽隐杆线虫中，肠道是主要的代谢脂肪储存器官;它的功能不仅参与营养物质的消化和吸收，还参与解毒过程，类似于哺乳动物肝细胞的活性。其他脂肪储存组织包括种系，其中脂质对卵母细胞发育至关重要，以及由皮肤样表^{皮细胞组成的}皮下组织3^，5。第三，近年来，越来越多的证据表明，脂质是参与细胞内和细胞外信号传导的强大信号分子，通过直接作用于多种受体，包括G蛋白偶联和核受体，或通过膜流动性调节或翻译

研究方案

图1 描述了使用不同实验设置的脂质喂养示意图。

1. 脂质条件细菌的制备

1. 通过将 5.85 g NaCl、1.0 g K 2 HPO 4 和 6.0 g KH₂PO₄（参见材料表）溶解在 999 mL 去离子水中来制备细菌稀释饮食限制 （BDR）碱溶液。用0.5M KOH将pH调节至6.0，然后通过0.22μm过滤器过滤。
   注意：BDR溶液可以在室温下储存，以便长期储存。
2. 通过向每 10 mL BDR 碱溶液中加入 10 μL 5 mg/mL 胆固醇（溶解在 200 度乙醇中）来制备 BDR 培养基。
3. 将OP50细菌（参见 材料表）从-80°C原液划线到LB-琼脂平板上，并在37°C孵育过夜。
   注意：在37°C孵育过夜后，OP50板可以在4°C下储存长达1周，以获得稳定的进料结果。
4. 将OP50细菌从OP50 LB-琼脂平板接种到LB培养基中，并在37°C振荡器中孵育过夜（16小时）。
   注意：所需的LB培养基体积取决于实验设置。建议使用 200 μL 的 5 倍浓缩细菌接种到每个 6 cm 平板上，每个 10 cm 平板和每次重复液体喂....

结果

在补充脂质时使用一些全虫验证转录变化
为了研究从几个全蠕虫中提取和逆转录RNA到cDNA的方案是否可重现并与来自散装蠕虫的数据进行比较^{，采用了一种}在肠道中过表达溶酶体酸性脂肪酶lipl-4的长寿命蠕虫菌株7，⁸，^33，35。先前研究⁷，⁸

讨论

脂质补充剂已被用于衰老研究，以阐明某些脂质物种对健康衰老的直接影响⁶，^7，23，^26，27，31。然而，脂质补充过程可能具有挑战性，实验之间的任何不一致都可能导致不可重复的结果。在这里，记录了第一个详细的分步协议，以指导新科学家避?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Pestle	Genesee Scientific	93-165P15	For worm grinding with Trizol
Agarose	Sigma	A9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix	GenDEPOT	R5600	For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCR	ThermoFisher	A28567	For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 Microcentrifuge	Benchmark Scientific	C1248	For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tip	Branson Ultrasonic Corporation	100-132-888R
Chloroform	Fisher Scientific	C298-500
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifuge	Eppendorf	22620444R	For RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler pro	Eppendorf	950030010	For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W Plate	Neta Scientific	665180	12-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mm	Neta Scientific	664161	For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mm	Neta Scientific	628161	For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free water	ThermoFisher	AM9937
Isoproanol	Sigma	PX1835-2
Levamisole hydrochloride	VWR	SPCML1054
lipl-4Tg	MCW Lab	N/A	Transgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22)	MCW Lab	N/A	Transgenic C. elegans
Luria Broth Base	ThermoFisher	12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma	M2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with Barcode	ThermoFisher	4483354	96-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied BioSystem	4311971	For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System	Sigma	Z00Q0V0WW	Deionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2	Caenorhabditis Genetics Center	N/A	C. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer	ThermoFisher	N/A	For measuring RNA concentration
OP50	Caenorhabditis Genetics Center	N/A	Bacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O)	Sigma	P5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma	P0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kit	ThermoFisher	4402953	For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master Mix	ThermoFisher	4367659	For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach	KIK International LLC.	59647210143	6% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressions	Sigma	CLS722085-18EA	Watch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination Solution	ThermoFisher	AM9780
Sodium cloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma	SX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O)	Sigma	S9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R Centrifuge	Thermo	7500-4337	For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifuge	Thermo	7500-7200	For worm egg preparation
TRIzol Reagent	TheroFisher	15596018	RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kit	ThermoFisher	AM1907	For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59	Denville Scientific INV	S7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless Motor	VWR	47747-370	For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115	VWR	N/A	For worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm picker	WormStuff	59-AWP