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요약

본 프로토콜은 Caenorhabditis elegans에 대한 액체 및 온플레이트 배양에서 지질 보충 방법을 설명하고 벌크 또는 소수의 웜 및 웜 조직으로부터의 종단 연구 및 유전자 전사 분석과 결합합니다.

초록

노화는 환경 적 및 유전 적 기여로 인한 점진적인 생리적 변화를 특징으로하는 복잡한 과정입니다. 지질은 세포막의 구조적 구성 요소를 구성하고 에너지를 저장하며 신호 분자로 사용하는 데 중요합니다. 지질 대사 및 신호 전달의 조절은 뚜렷한 장수 경로를 활성화하는 데 필수적입니다. 회충 Caenorhabditis elegans 는 지질 대사의 기여와 장수 조절의 신호 전달을 해부하는 우수하고 강력한 유기체입니다. 여러 연구 연구에서 특정 지질 분자의 식단 보충제가 C. elegans 수명을 연장하는 방법을 설명했습니다. 그러나 보충 조건의 사소한 차이로 인해 다른 실험실의 과학자들 사이에서 재현성 문제가 발생할 수 있습니다. 여기에서 C. elegans 에 대한 두 가지 자세한 보충 방법은 접시에 파종 된 박테리아 또는 액체 배양에서 박테리아 현탁액으로 지질 보충을 사용하는 것으로보고되었습니다. 또한 본원에는 몇 가지 웜으로부터 유래된 전체 웜 용해물 또는 해부된 조직을 사용하여 평생 지질 보충 및 qRT-PCR 분석을 통한 수명 분석을 수행하기 위한 세부 정보가 제공된다. 지질 보충에 대한 종단 연구와 전사 조사의 조합을 사용하여 수유 분석은 지질이 수명과 건강한 노화에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 이 방법론은 또한 소수의 해부 조직 또는 소수의 동물을 사용하여 전사체의 하위 집합의 변화를 평가하기 위해 다양한 영양 스크리닝 접근법에 적용될 수 있습니다.

서문

지질
지질은 유기 용매에 용해되지만 물 1,2에는 녹지 않는 작은 소수성 또는 양친매성 분자입니다. 별개의 지질 분자는 사슬에 포함 된 탄소의 수, 위치, 이중 결합 수 및 글리세롤 또는 인산염을 포함한 결합 구조에 따라 서로 구별됩니다. 지질은 막 이중층을 구성하고, 에너지 저장을 제공하고, 신호 분자 3,4로 작용하는 것을 포함하여 유기체 기능을 조절하기 위해 별개의 세포 내에서 그리고 별개의 세포에 걸쳐 중요한 역할을 합니다.

첫째, 지질은 세포외 환경에서 내부 구획을 분할하는 원형질막과 세포내 세포하막을 포함하는 생물학적 막의 구조적 구성 요소입니다. 둘째, 지질은 척추 동물과 무척추 동물의 주요 에너지 저장 형태입니다. 트리 아실 글리세롤을 포함한 중성 지질은 지방 조직을 포함한 다양한 조직에 장기간 저장됩니다. 선충류에서 Caenorhabditis elegans, 장은 주요 대사성 지방 저장 기관입니다. 그 기능은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 포유류 간세포의 활동과 유사한 해독 과정에도 관여합니다. 다른 지방 저장 조직으로는 지질이 난 모세포 발달에 필수적인 생식선과 피부와 같은 표피 세포 3,5로 구성된 피하가 있습니다. 셋째, 최근 몇 년 동안 지질은 G 단백질 결합 및 핵 수용체를 포함한 다양한 수용체에 직접 작용하거나 막 유동성 조절 또는 번역 후 변형을 통해 간접적으로 작용하여 세포 내 및 세포 외 신호 전달에 관여하는 강력한 신호 전달 분자라는 더 많은 증거가 있습니다 6,7,8,9 . 추가 연구는 장수와 건강 수명을 촉진하는 지질 신호 전달의 기본 분자 메커니즘을 계속 밝힐 것입니다.

모델 유기체는 인간에서 연구하기에는 너무 복잡한 특정 생물학적 질문을 해결하는 데 중요합니다. 예를 들어, 회충 C. elegans는 인간의 영양 및 질병10과 관련된 생물학적 과정을 해부하기 위해 유전자 분석을 수행하기위한 훌륭한 모델입니다. 인간 생리학, 복잡한 조직, 행동 패턴 및 풍부한 유전자 조작 도구와 관련된 고도로 보존 된 분자 경로는 C. elegans를 주목할만한 모델 유기체로 만듭니다11. 예를 들어, C. elegans는 표현형 특이적 유전자를 식별하기 위한 유전자 스크리닝뿐만 아니라 RNA 간섭12를 통한 게놈 전체의 역 유전자 스크리닝을 전달하는 데 탁월합니다.

실험실에서 선충류는 대장균 박테리아의 잔디밭이 뿌려진 한천 페트리 플레이트에서 재배되어 단백질, 탄수화물, 포화 및 불포화 지방산과 같은 다량 영양소를 에너지 및 빌딩 블록의 원천으로 제공하고 보조 인자 및 비타민13과 같은 미량 영양소를 제공합니다. 포유류와 유사하게 선충류는 팔 미트 산과 스테아르 산 (각각 포화 16- 탄소 및 18- 탄소 분자)에서 지방산 분자를 합성하여 순차적으로 불포화되고 다양한 단일 불포화 지방산 (MUFA) 및 폴리 불포화 지방산 (PUFA)14,15,16,17,18. 흥미롭게도 C. elegans는 지방산 생합성, 불포화 및 신장에 관여하는 모든 필수 지방산 및 핵심 효소의 de novo 합성이 가능하여 장쇄 PUFA의 합성을 촉진합니다19. 다른 동물 종과 달리 C. elegans는 자체 ω-3 불포화 효소를 사용하여 18- 탄소 및 20- 탄소 ω-6 지방산을 ω-3 지방산으로 전환 할 수 있습니다. 또한 웜은 올레산 (OA, 18 : 1)20,21에서 리놀레산 (LA)의 형성을 촉매하는 Δ12 불포화 효소를 가지고 있습니다. 대부분의 동물이나 식물은 Δ12 및 ω-3 불포화 효소가 모두 부족하므로 PUFA를 얻기 위해 ω-6 및 ω-3의식이 섭취에 의존하는 반면 C. elegans는식이 지방산을 필요로하지 않습니다22. 기능적 불포화효소 효소가 결여된 분리된 돌연변이체는 생식, 성장, 수명 및 신경전달을 포함한 별개의 생물학적 과정에서 특정 지방산의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 특정 생물학적 경로에 대한 개별 지방산의 영향은 유전적 접근과 식이 보충제16,17,23을 모두 사용하여 해결할 수 있습니다. 현재까지 지질 연구는 신경 학적 및 발달 적 조건에서 지질 합성, 분해, 저장 및 분해에 관여하는 유전자를 특성화하는 데 중점을 두었습니다24. 그러나 장수 조절에서 지질의 역할은 이제 막 밝혀지기 시작했습니다.

수명 조절의 지질 신호 전달
지질은 별개의 조직과 세포 유형에서 세포 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 수명 조절에 중요한 역할을 합니다. 최근 연구는 지질 결합 단백질 또는 막 수용체25의 인식을 통한 전사 및 세포-세포 통신을 조절하는 지질의 적극적인 역할을 강조했습니다. 또한식이 지질 보충제는 지질 대사가 C. elegans의 수명에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 뚜렷한 MUFA와 PUFA는 전사 인자26,27을 활성화하여 수명을 촉진하는 것으로 나타났습니다.

인슐린 / IGF-1 신호 전달 및 생식선 전구체 세포의 절제를 포함한 장수 모델은 MUFA 생합성 경로와 관련이 있으며 올레산, 팔미 톨레산 및 시스-백시닉을 포함한 MUFA 보충제는 C. elegans 수명을 연장하기에 충분합니다26. MUFA 행정부가 부여한 장수 효과는 추가 조사가 필요하지만 기본 메커니즘은 산화 스트레스 반응 및 수명 조절28,29의 핵심 활성화제인 SKN-1/Nrf2 전사 인자에 의해 매개될 가능성이 높습니다. MUFA 중에서 N- 아실 에탄올 아민 (NAEs)이라고하는 특정 종류의 지방 아실 에탄올 아미드는 염증, 알레르기, 학습, 기억 및 에너지 대사를 포함한 별개의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다30. 특히, 올레 오일 에탄올 아미드 (OEA)로 알려진 지질 분자는 지질 결합 단백질 8 (LBP-8)의 핵으로의 전좌를 촉진하여 핵 호르몬 수용체 NHR-49 및 NHR-807. OEA 아날로그 KDS-5104의 보충은 수명을 연장하기에 충분하며 산화 스트레스 반응 및 미토콘드리아 β 산화 7,8에 관여하는 유전자의 발현을 유도합니다.

동시에 PUFA의 역할은 장수 규제와도 관련이 있습니다. PUFA ω-3 지방산 α- 리놀렌산 (ALA)의 투여는 NHR-49 / PPARα, SKN-1 / NRF 전사 인자를 활성화하고 미토콘드리아 β 산화31을 유도하여 장수를 촉진합니다. 흥미롭게도, 옥시리핀으로 지칭되는 ALA의 과산화 생성물은 SKN-1/NRF를 활성화시켜 PUFA와 그 산화 유도체 모두가 장수 이점을 부여할 수 있음을 시사한다23. ω-6 지방산 아라키돈산(AA)과 디호모-γ-리놀렌산(DGLA)의 보충은 자가포식 활성화를 통해 수명을 연장하고 단백질 품질 관리를 촉진하며 낭비되고 독성이 있는 단백질 응집체27,32의 분해를 초래합니다. 보다 최근에, 지질 결합 단백질 3 (LBP-3) 및 DGLA에 의해 매개되는 세포 - 비 자율 신호 조절은 말초 신호를 뉴런에 보내 수명을 촉진하는 데 중요한 것으로 나타 났으며, 이는 전신 수준에서 조직 간 통신에서 지질 분자의 장거리 역할을 시사한다33. 본 연구는 액체 배양에서 플레이트에 파종된 박테리아 또는 박테리아 현탁액으로 지질 보충을 수행하는 각 단계를 보고합니다. 이러한 방법론은 전신 내용 또는 몇 가지 벌레에서 파생된 해부 조직을 사용하여 수명 및 전사 분석을 평가하는 데 사용됩니다. 다음 기술은 다양한 영양 연구에 적용될 수 있으며 지질 대사가 수명과 건강한 노화에 어떻게 영향을 미치는지 해부하는 유효한 도구를 제공합니다.

프로토콜

그림 1 은 다양한 실험 설정을 사용한 지질 공급의 개략도를 보여줍니다.

1. 지질조절균의 제조

  1. 5.85 g의 NaCl, 1.0 g의 K2HPO4 및 6.0 g의 KH2PO4 (재료 표 참조)를 999 mL의 탈 이온수에 용해시켜 박테리아 희석식이 제한(BDR) 염기 용액을 제조한다. pH를 0.5 M KOH로 6.0으로 조정한 다음, 0.22 μm 필터를 통해 여과한다.
    알림: BDR 용액은 장기 보관을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다.
  2. BDR 염기 용액 10mL마다 5mg/mL 콜레스테롤(200프루프 에탄올에 용해됨) 10μL를 추가하여 BDR 배지를 준비합니다.
  3. OP50 박테리아( 재료 표 참조)를 -80°C 스톡에서 LB-한천 플레이트로 줄무늬로 만들고 37°C에서 밤새 배양합니다.
    알림: 37°C에서 하룻밤 배양한 후 OP50 플레이트는 안정적인 공급 결과를 위해 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  4. OP50 LB-한천 플레이트에서 OP50 박테리아를 LB 배지에 접종하고 37°C 쉐이커에서 밤새 배양합니다(16시간).
    알림: 필요한 LB 중간 부피는 실험 설정에 따라 다릅니다. 6cm 플레이트 각각에 파종 된 5x 농축 박테리아 200μL와 10cm 플레이트 각각에 대해 5x 농축 박테리아 1mL를 사용하고 액체 공급 조건의 각 복제물을 사용하는 것이 좋습니다. 따라서 각 지질 공급 배양에 대해 각각 1mL 및 5mL의 초기 LB 접종을 준비해야 합니다.
  5. 실온에서 10분 동안 4,000 x g 에서 원심분리하여 박테리아를 수집합니다. 상청액을 폐기하십시오.
  6. 박테리아 펠릿을 20mL의 BDR 염기에 현탁시키고 4,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오.
    알림: 이 단계는 박테리아 펠릿에 남은 LB 잔류물을 씻어내는 데 중요합니다.
  7. BDR 배지에 각 박테리아 펠릿을 현탁하여 20x BDR 박테리아 스톡을 만듭니다. 사용하기 전에 BDR 배지로 20x BDR 박테리아 스톡을 5x로 희석하십시오.
    알림: 원래 LB 부피의 1/20 부피의 BDR 배지를 사용하여 박테리아의 20x 농도에 도달하십시오. 20x 박테리아 스톡은 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
  8. 새로운 오토클레이브 유리 바이알에 에탄올 또는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 용매로 사용하여 지질 스톡 용액을 준비하고 유리 바이알에 아르곤 또는 질소를 채워 산화를 방지합니다.
    알림: 저장 용액 농도는 일반적으로 250mM에서 1mM 사이입니다.
  9. 지질 스톡 용액을 원하는 양의 BDR 박테리아 용액으로 옮겨 공급 조건에서 원하는 최종 농도를 달성합니다. 20 초 동안 소용돌이 치면서 철저히 혼합하십시오.
    참고: 수유 중 지질의 최종 농도는 지질 및 테스트 조건에 따라 일반적으로 1μM에서 1mM입니다. 새로운 지질로 작업하는 경우 0.1μM에서 1mM 범위의 다양한 농도를 테스트하기 위해 먼저 파일럿 실험을 실행하는 것이 좋습니다. 지질 원액을 BDR 박테리아와 혼합한 직후 플레이트에 씨를 뿌리거나 액체 벌레 배양에 넣습니다. 벌레에게 먹이를주기 전에 1 시간 이내에 지질 조절 박테리아를 준비하십시오.
  10. 동일한 부피의 여과된 에탄올 또는 DMSO(지질 공급 그룹에 사용되는 것에 따라 다름)를 BDR 박테리아와 혼합하여 비히클 대조군으로 사용합니다.

2. 지질 보충을 위한 동기화된 C. 엘레간스의 제조

  1. 22 mM KH2PO4, 22 mMNa2HPO4,85 mM NaCl, 및 2 mMMgSO4를 혼합(지정된 최종 농도를 사용하여)하여 M9 완충액을 제조한다(재료 표 참조). 멸균을 위해 완충액을 오토 클레이브하십시오.
  2. 60% 하우스 표백제(v/v, 재료 표 참조)와 1.6M NaOH의 최종 농도로 신선한 표백제를 준비합니다.
  3. 10mL의 M9 버퍼를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 중력 성인을 수집합니다.
    알림: 동기화에 필요한 웜 및 플레이트의 수는 실험 설정(예: 조건 및 반복의 수 및 공급 방법)에 따라 다릅니다. 이상적으로, 성인 벌레의 각 전체 6cm 플레이트는 동기화 후 최소 600 개의 L1 벌레를 생성 할 수 있어야합니다.
  4. 1,450 x g 에서 30초 동안 웜을 회전시킵니다. 상청액을 제거하고 10mL의 M9 완충액으로 웜을 한 번 더 헹굽니다.
  5. 1,450 x g 에서 30초 동안 웜을 회전시킵니다. 상청액을 흡인하여 원추형 튜브에 4mL 분취량을 남깁니다. 표백제 용액 2mL를 넣고 1분 동안 세게 흔듭니다.
  6. 실온에서 30초 동안 1,450 x g 로 벌레를 돌립니다.
  7. 상청액을 제거하고 4mL의 M9 완충액과 2mL의 표백제를 추가합니다. 웜 본체가 녹을 때까지 튜브를 흔듭니다.
  8. 계란을 실온에서 1,450 x g 에서 30초 동안 회전시킵니다.
  9. 상청액을 제거하고 10mL의 M9 완충액으로 계란을 씻습니다.
  10. 2.8 및 2.9 3x 단계를 반복합니다.
  11. 배아를 6mL의 M9 완충액으로 현탁시킨다. 배아를 20 ° C의 회전 장치에서 2 일 동안 흔들어 부화시키고 동기화시킵니다.
  12. L1 유충을 OP50 시드 플레이트로 옮깁니다. 20 ° C에서 48 시간 동안 배양하여 동기화 된 L4 웜을 수집하고, 1 일 성인의 경우 72 시간, 2 일 성인의 경우 96 시간 동안 배양합니다.
    참고: OP50 플레이트는 각 10cm 선충 성장 배지(NGM) 플레이트(34)에 1mL의 20x OP50 박테리아를 첨가함으로써 제조된다. L4 단계에서 웜을 수확하려는 경우 각 OP50 플레이트에 30,000 L1 웜을 시드 할 수 있으며, 현재 실험 환경에서 1 일차 성체를 수확하려는 경우 각 OP50 플레이트에 20,000 L1 웜을 시드 할 수 있습니다. 실험실 설정에 따라 다를 수 있으므로 수확하기 전에 웜에 충분한 음식이 남아 있는지 확인하기 위해 시드할 수 있는 웜 번호를 테스트하는 것이 좋습니다.
  13. M9 버퍼 10mL를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 L4, 1일차 성인 또는 2일차 성충을 수집합니다. 다른 5mL의 M9 완충액을 사용하여 접시에서 남은 벌레를 헹굽니다.
  14. 벌레를 1,450 x g 에서 30초 동안 돌리고 상층액을 버립니다. 웜 펠릿을 10mL의 BDR 배지로 세척하고 1,450 x g 에서 30초 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
  15. 액체 공급 방법의 웜의 경우 BDR 배지를 웜으로 옮겨 3,000 웜 / mL의 웜 농도를 달성하십시오. 플레이트 공급 방법의 웜의 경우 웜에 첨가되는 BDR 배지의 양을 줄여 플레이트의 건조 시간을 줄입니다.

3. C. 엘레간스를 위한 지질 보충

  1. 아래 단계에 따라 액체 배양에서 지질 보충을 수행하십시오.
    참고: 이 방법은 지질이 보충된 벌크 웜을 사용하여 전사 변화를 테스트하는 데 적합합니다.
    1. 원하는 양의 지질 또는 비히클 대조군을 12-웰 플레이트 내의 각각의 웰로 옮긴다. 생물학적 복제로 각 공급 조건에 대해 3-4 개의 우물을 준비하십시오.
    2. 2.15단계의 웜 현탁액을 5x BDR 박테리아와 1:1 비율로 혼합하여 최종 농도 1,500 웜/mL 및 박테리아의 경우 2.5x를 달성합니다.
    3. BDR 배지의 벌레-박테리아 혼합물 2mL를 12-웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
    4. 12웰 플레이트를 호일로 감싸고 원하는 배양 길이에 대해 20°C 인큐베이터에서 100rpm으로 흔들어줍니다.
      알림: 다양한 공급 조건을 테스트하려면 지질을 벌레와 함께 6시간, 12시간 및 24시간 동안 다양한 시간 동안 배양합니다. 또한 L4 또는 1 일째 성인 단계의 지질 공급을 포함하여 최적의 결과를 위해 다양한 웜 단계를 테스트 할 수 있습니다.
  2. 아래 단계에 따라 10cm NGM 한천 플레이트에 지질 보충을 수행하십시오.
    참고: 이 방법은 지질이 보충된 벌크 웜을 사용하여 전사 변화를 테스트하는 데 적합합니다.
    1. 1.9단계로부터의 지질-컨디셔닝 박테리아 1 mL를 각각의 10 cm 플레이트의 중앙에 시드한다. 많은 수의 플레이트가 준비되면 파종 사이에 최종 작업 용액을 여러 번 소용돌이합니다. 생물 안전 후드를 사용하여 어둠 속에서 플레이트를 건조시킵니다.
    2. 2.15 단계에서 3,000 개의 웜을 10cm 플레이트 각각으로 옮깁니다. 벌레가 수영 대신 지질 보충 판을 기어 다닐 수있을 때까지 생물 안전 후드에서 판을 말리십시오.
    3. 지질 조절 플레이트에서 벌레를 20°C 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양합니다. 고도 불포화 지질을 사용하는 경우 빛으로부터 보호하십시오.
      알림: 다양한 먹이 조건을 테스트하려면 지질을 벌레와 함께 6시간, 12시간 및 24시간과 같은 다양한 시간 동안 배양합니다. 또한 L4 또는 1 일째 성인 단계에서 지질 공급을 포함하여 최적의 결과를 위해 다양한 웜 단계를 테스트 할 수 있습니다.
  3. 전사 분석을 위해 6cm NGM 한천 플레이트에 지질 보충을 수행합니다.
    참고: 이 방법은 지질이 보충된 몇 가지 웜의 전사 변화를 테스트하는 데 적합합니다.
    1. 단계 1.9로부터의 지질 컨디셔닝 박테리아 300 μL를 각각의 6 cm 플레이트의 중앙에 시드한다. 많은 수의 플레이트가 준비되면 파종 사이에 최종 작업 용액을 여러 번 소용돌이합니다. 생물 안전 후드를 사용하여 어둠 속에서 플레이트를 건조시킵니다.
    2. 2.15 단계에서 최대 300 개의 웜을 6cm 플레이트 각각으로 옮깁니다. 벌레가 수영 대신 지질이 보충 된 접시를 기어 다닐 수있을 때까지 생물 안전 후드에서 판을 말리십시오.
    3. 지질 조절 플레이트에서 벌레를 20°C 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 배양합니다. 고도 불포화 지질을 사용하는 경우 빛으로부터 보호하십시오.
      알림: 다른 먹이 조건을 테스트하려면 6 시간, 12 시간 및 24 시간과 같은 다른 시점에서 지질을 벌레와 함께 배양하십시오. 또한 L4 또는 1 일째 성인 단계에서 지질 공급을 포함하여 최적의 결과를 위해 다양한 웜 단계를 테스트 할 수 있습니다.
  4. 종방향 수명 분석을 위해 6cm NGM 한천 플레이트에서 지질 보충을 수행합니다.
    1. 200μL의 지질 조절 박테리아(1x 지질 농도 및 5x 농축 박테리아 포함)를 6cm NGM 플레이트의 각 중앙에 파종합니다. 각 공급 조건에 대해 3 개의 플레이트를 준비하십시오.
      알림: 플레이트는 사용 당일에 새로 준비해야 합니다(이상적으로는 사용 직전).
    2. 생물 안전 후드에서 플레이트를 건조시킵니다. 고도 불포화 지질을 사용하는 경우 후드와 방의 조명을 끄십시오.
    3. 각 플레이트에 30-40개의 동기화된 L4 웜을 선택합니다. 벌레가있는 판을 20 °C 인큐베이터에 보관하십시오. 폴리 불포화 지질을 공급하는 경우 플레이트를 20 ° C 인큐베이터의 빛으로 보호 된 상자에 보관하십시오.
      알림: 일반 6cm 통로 플레이트(무조건 OP50)의 OP50을 웜을 픽업하기 위한 접착제로 사용할 수 있지만 분석 플레이트에 무조건 OP50을 대량으로 남기지 않는 것이 중요합니다.
    4. 벌레를 원하는 먹이 조건에 따라 매일 또는 격일로 새로 만든 지질 조절 판으로 옮깁니다. 생존율은 앞서 설명한4와 동일한 방법으로 점수가 매겨진다.

4. 전사 분석을 위한 RNA 추출

  1. 대량의 전체 웜에서 RNA 추출을 수행하십시오.
    1. 액체 배양물의 웜을 3.1단계에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. M9 버퍼를 사용하여 3.2단계의 10cm 플레이트에서 웜을 세척하고 M9 버퍼의 웜을 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    2. 탁상용 미니 원심 분리기 ( 재료 표 참조)로 10 초 동안 벌레를 간단히 원심 분리하고 상층액을 빠르게 흡인합니다.
    3. 액체 공급 우물에서 남은 벌레를 옮기거나 플레이트 공급에서 동일한 튜브로 씻고 스핀 다운하십시오. 상청액을 제거하십시오.
    4. 얼음처럼 차가운 M9 1mL로 웜 펠릿을 씻고 미니 원심분리기로 10초 동안 잠깐 회전시킨 다음 상층액을 흡인합니다. 상청액의 투명도에 따라 1x 또는 2x를 반복합니다.
    5. 미세 원심분리 튜브를 얼음 위에 2분 동안 놓고 200μL 피펫으로 가능한 한 많은 상청액을 제거하여 부피가 15μL 이하인 포장된 웜 펠릿을 남깁니다.
    6. 페놀과 구아니딘 이소티오시아네이트(재료 표)를 함유한 RNA 추출 용액 15μL를 각 미세 원심분리 튜브에 옮기고 온전한 웜이 보이지 않을 때까지 모터 그라인더로 약 30초 동안 웜을 분쇄합니다.
      주의 : RNA 추출 용액은 독성과 가연성이 있으며이 시약이 포함 된 열린 용기와 관련된 모든 단계는 화학 후드에서 작동해야합니다.
    7. 285μL의 RNA 추출 용액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 모터 그라인더 팁에서 웜 함량을 미세 원심분리 튜브로 헹굽니다. 소용돌이가 철저히 섞입니다.
      참고: 이것은 일시 중지 지점입니다. 샘플은 -80 ° C에서 몇 달 동안 RNA 추출 용액에 보관할 수 있습니다. -80°C에서 꺼내어낼 때, 샘플을 실온에서 해동시킨다.
    8. 60μL의 클로로포름을 각 샘플에 옮기고 격렬하게 와동시킵니다. 샘플을 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오.
      주의 : 클로로포름은 독성이 있으므로 화학 후드에서 취급해야합니다.
    9. 21,000 x g 에서 4 °C에서 20 분 동안 원심 분리합니다. 200μL 피펫을 사용하여 상단에 있는 140μL의 수층을 RNase가 없는 새로운 마이크로원심분리 튜브로 조심스럽게 옮기고 매번 70μL로 2x 옮깁니다.
      참고: 이 단계부터 샘플과 직접 접촉하는 모든 피펫 팁과 용기는 RNase가 없어야 합니다. 또한 RNase 오염 제거 용액을 사용하여 모든 장비와 작업 공간을 닦는 것이 좋습니다.
    10. 140 μL의 이소프로판올을 샘플 튜브로 옮깁니다. 격렬하게 와동시키고 샘플을 실온에서 10분 동안 침전시킵니다. 4°C에서 20분 동안 21,000 x g 에서 원심분리하고, 모든 상청액을 조심스럽게 제거하였다.
    11. 0.5mL의 얼음처럼 차가운 80% 에탄올(v/v)을 RNA 펠릿이 있는 샘플 튜브로 옮깁니다. RNA 펠릿이 튜브 바닥을 떠나 에탄올 용액에 떠 다닐 때까지 격렬하게 소용돌이칩니다. 4°C에서 10분 동안 21,000 x g 에서 원심분리하고 상청액을 제거하였다.
    12. 미니 원심분리기에서 샘플 튜브를 15초 동안 간단히 원심분리하여 튜브 벽에 부착된 용매를 스핀다운한 다음 피펫으로 가능한 한 많은 에탄올 용액을 제거합니다.
    13. RNA 펠릿을 건조시키기 위해 튜브 캡을 열어 두십시오. 펠릿을 에탄올 용액으로 철저히 세척 한 경우 건조 단계는 10 분 미만이 소요됩니다.
      참고: 이것은 일시 중지 지점입니다. 건조된 RNA 펠릿은 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
    14. 건조 RNA 펠릿을 40μL의 뉴클레아제가 없는 물에 녹이고 제조업체 지침에 따라 DNA 제거 키트로 처리합니다( 재료 표 참조).
      참고: RNA를 먼저 뉴클레아제가 없는 물에 녹이는 것이 좋습니다. RNA 튜브로 옮기기 전에 40μL의 물을 10x DNase 버퍼와 혼합하면 RNA 펠릿이 완전히 용해되지 않습니다. RNA 펠릿을 물에 녹일 때 RNA 샘플을 얼음 위에 보관해야 합니다. 동결-해동 주기는 RNA 품질을 저하시킵니다. 따라서, DNase 처리 당일에 역전사 단계를 진행한다.
  2. 소수의 전체 웜에서 RNA 추출.
    1. 박테리아 잔디밭에서 15-20 마리의 벌레를 신선한 파종되지 않은 NGM 플레이트로 선택하여 벌레에서 박테리아를 제거합니다.
    2. qRT-PCR 2단계 키트( 재료 표 참조) 제조업체에 따르면 PCR 튜브에서 0.2μL의 DNase와 19.8μL의 용해 용액을 혼합하여 각 샘플에 대해 20μL의 최종 용해 용액을 준비합니다. 5x 위아래로 피펫팅하여 용해 용액을 혼합합니다.
    3. 파종되지 않은 NGM 플레이트에서 15-20개의 웜을 최소 박테리아 수로 20μL의 최종 용해 용액이 들어 있는 PCR 튜브로 옮깁니다. 용해 반응을 실온에서 5분 동안 배양한다.
    4. 프로브 - 초음파 처리 ( 재료 표 참조) 다음 프로그램을 사용하여 30 % 진폭으로 웜: 5 초 동안 초음파 처리, 5 초 동안 일시 중지, 20 초의 총 초음파 처리 시간으로 4x 반복. 초음파 처리 중에 얼음처럼 차가운 수조에 샘플을 보관하십시오.
    5. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
      참고: NO-RT 음성 대조군이 관련 수준에서 DNA 오염을 보이는 경우 배양 전에 DNase를 더 추가하십시오.
    6. 2 μL의 정지 용액을 용해 반응물에 옮기고 부드럽게 두드려 혼합합니다. 실온에서 2 분 동안 배양 한 다음 얼음 위에 놓습니다.
      알림: 샘플은 역전사 단계로 진행하기 전에 최대 2시간 동안 얼음 위에 둘 수 있습니다.
  3. 아래 단계에 따라 벌레 조직에서 RNA 추출을 수행합니다.
    1. 박테리아 잔디밭에서 약 20 마리의 벌레를 골라 신선한 씨를 뿌리지 않은 NGM 플레이트에 올려 박테리아를 제거하십시오.
    2. 20 개의 벌레 (가능한 한 적은 박테리아 포함)를 500μM levamisole을 함유 한 9μL M4 용액이 들어있는 시계 유리로 옮깁니다 ( 재료 표 참조). 고정화는 몇 초 안에 발생합니다.
    3. 벌레가 고정되면 1mL 주사기에 부착할 수 있는 25G 바늘을 사용하여 생식세포 또는 장을 해부합니다.
      1. 해부 범위 아래에서 장과 생식계열의 자연 압출을 허용하기 위해 두 번째 인두 전구의 위치에서 절단을 수행합니다. 두 조직은 형태와 다른 대비에 따라 쉽게 구별 할 수 있습니다. 핀셋이나 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 분리하여 손상을 피하십시오.
        알림: 5-10분 이내에 해부하는 것이 좋습니다. 절단이 좋은 조직 압출을 생성하지 않으면 다음 벌레로 이동하여 10분 이내에 가능한 한 많이 해부하는 것이 좋습니다. 이 절차에는 환경의 전사적 변경을 방지하기 위해 짧은 시간이 필요합니다.
    4. qRT-PCR 2단계 키트 제조업체에 따르면 PCR 튜브에서 0.2μL의 DNase I과 19.8μL의 용해 용액을 혼합하여 각 샘플에 대해 20μL의 최종 용해 용액을 준비합니다. 5x 위아래로 피펫팅하여 용해 용액을 혼합합니다.
    5. 오토클레이브 유리 피펫을 사용하여 해부된 조직을 PCR 튜브로 옮깁니다. 바닥에 물질이 침착될 수 있도록 PCR 튜브를 얼음에 2분 동안 정착시킵니다. 상청액을 제거하고 최종 용해 용액 20μL를 PCR 튜브에 넣고 두드려 혼합합니다.
    6. 용해 반응을 실온에서 5분 동안 배양한다. 그런 다음 2μL의 정지 용액을 용해 반응으로 옮기고 탭핑하여 혼합합니다. 실온에서 2 분 동안 배양하십시오.
      알림: 샘플은 역전사 단계로 진행하기 전에 최대 2시간 동안 얼음 위에 둘 수 있습니다.

5. 역전사 및 qRT-PCR

  1. 벌크 웜에서 역전사 및 qRT-PCR을 수행합니다.
    1. RNA 농도를 측정하고 역전사를 위해 총 RNA 5μg을 준비합니다.
    2. 각 샘플에서 동일한 양의 RNA를 혼합하고 최종 RNA 농도를 0.556g/L(5μg/9μL)로 조정하여 풀링된 RNA 샘플을 준비합니다. qRT-PCR 표준 곡선 및 RT 음성 대조군에 풀링된 RNA 샘플을 사용합니다.
    3. 제조업체 지침에 따라 역전사를 수행합니다( 재료 표 참조). 개별 RNA 샘플과 함께 다음 품질 관리 역전사 반응을 실행합니다.
      1. 풀링된 RNA 샘플을 템플릿으로 사용하여 역전사를 수행합니다(qRT-PCR 표준 곡선의 경우).
      2. 역전사효소 없이 풀링된 RNA 샘플을 주형으로 사용하여 역전사를 수행합니다(RT 음성 대조군, 잠재적인 게놈 DNA 오염에 대한 품질 관리).
      3. 뉴클레아제가 없는 물을 주형으로 사용하여 역전사를 수행합니다(RT 음성 대조군, 시약의 잠재적인 RNA 오염에 대한 품질 관리).
        참고: 이것은 일시 중지 지점입니다. 샘플은 열순환기에 밤새 방치하거나 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 풀링된 RNA 샘플에서 생성된 cDNA를 qRT-PCR 표준 곡선을 위해 뉴클레아제가 없는 물로 4배, 20배, 100배 및 500배로 희석합니다.
    5. 각 RNA 샘플에서 생성된 cDNA를 20-100배 희석하여 qRT-PCR 반응을 위한 주형으로 사용합니다.
      참고: 희석 비율은 관심 유전자의 풍부도에 따라 다릅니다. 이 연구에 사용 된 하우스 키핑 유전자 또는 egl-3 및 egl-21과 같은 고 발현 유전자의 경우 100x 희석이 권장됩니다. lbp-8과 같은 저발현 유전자의 경우 20x 희석이 권장됩니다.
    6. 다음과 같이 제조업체 지침에 따라 qRT-PCR 시약으로 qRT-PCR을 수행합니다: 95°C에서 10분, 95°C에서 15초 동안 40회, 60°C에서 1분 동안 반복한 다음 기본 용융 곡선 프로그램을 수행하고 8°C에서 무기한 유지합니다.
  2. 몇 가지 웜 또는 웜 조직에서 역전사 및 qRT-PCR을 수행합니다.
    1. qPCR 2단계 키트( 재료 표 참조)에서 25μL의 RT 버퍼와 2.5μL의 20x RT 효소 혼합물을 4.2.6단계 또는 4.3.6단계의 웜 용해물이 들어 있는 각 튜브로 옮깁니다.
      참고: RT 음성 대조군은 몇 가지 웜의 qRT-PCR에 중요합니다. 각 실험은 샘플의 DNA 오염을 검사하기 위해 RT 버퍼가 있지만 RT 효소가 없는 웜 용해물 샘플(4.2.6단계에서)을 포함해야 합니다. DNA 오염이 문제인 경우 용해 완충액에 더 많은 DNase를 추가하거나 웜이 용해된 후 샘플에 더 많은 DNase를 추가하는 것을 고려하십시오. 대안적으로, 정상 RT 반응에서 용해물의 절반을 사용하고 역전사효소가 없는 RT 반응에서 나머지 절반을 사용하여 각 샘플에 대해 RT 음성 대조군을 수행할 수 있습니다.
    2. 가볍게 두드려 섞습니다. 미니 원심분리기를 사용하여 10초 동안 회전시킵니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 샘플을 열순환기 기계에 로드합니다: 37분 동안 60°C, 5분 동안 95°C, 무기한 8°C.
      참고: 이것은 일시 중지 지점입니다. 샘플은 열순환기에 밤새 방치하거나 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 모든 시약과 샘플을 얼음 위에 보관하고 qRT-PCR 시약을 빛으로부터 보호하십시오.
    5. 96웰 qPCR 플레이트를 준비하고, 각 웰에서 6μL의 뉴클레아제가 없는 물, 10μL의 qRT-PCR 시약, 2μL의 5μM 프라이머 믹스(정방향 및 역방향) 및 2μL의 cDNA를 혼합합니다. 96웰 qPCR 플레이트 표면을 보호 광학 필름으로 덮고 아래로 눌러 밀봉합니다.
    6. 다음과 같이 제조업체의 지침에 따라 열 순환기에서 qRT-PCR 프로그램을 실행하십시오 : 50 ° C에서 2 분, 95 ° C에서 2 분, 95 ° C에서 3 초 동안 60 ° C로 40 회 반복 한 다음 무기한 8 ° C를 반복합니다.

결과

지질 보충 시 몇 가지 전체 벌레를 사용한 전사 변화의 검증
몇몇 전체 웜에서 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사하는 프로토콜이 재현 가능하고 벌크 웜의 데이터와 비교할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 장에서 리소좀 산 리파아제 lipl-4를 과발현하는 수명이 긴 웜 균주를 사용했습니다 7,8,33,35.

토론

지질 보충제는 건강한 노화에 대한 특정 지질 종의 직접적인 영향을 설명하기 위해 노화 연구에 사용되었습니다 6,7,23,26,27,31. 그러나 지질 보충 절차는 어려울 수 있으며 실험 간의 불일치로 인해 재현 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다. 여기에?...

공개

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

유지 보수 지원에 대해 P. Svay에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), 마치 오브 다임스 재단 (MCW), 웰치 재단 (MCW), HHMI 조사관 (MCW) 및 NIH T32 ES027801 박사 전 학생 펠로우 (MS). 일부 균주는 NIH 연구 인프라 프로그램 사무소 (P40 OD010440)가 자금을 지원하는 CGC에서 제공했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL PestleGenesee Scientific93-165P15For worm grinding with Trizol
AgaroseSigmaA9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master MixGenDEPOTR5600For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCRThermoFisherA28567For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 MicrocentrifugeBenchmark ScientificC1248For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tipBranson Ultrasonic Corporation100-132-888R
ChloroformFisher ScientificC298-500
CholesterolSigmaC8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifugeEppendorf22620444RFor RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler proEppendorf950030010For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W PlateNeta Scientific66518012-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mmNeta Scientific664161For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mmNeta Scientific628161For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free waterThermoFisherAM9937
IsoproanolSigmaPX1835-2
Levamisole hydrochlorideVWRSPCML1054
lipl-4TgMCW LabN/ATransgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22)MCW LabN/ATransgenic C. elegans
Luria Broth BaseThermoFisher12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4)SigmaM2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with BarcodeThermoFisher448335496-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied BioSystem4311971For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification SystemSigmaZ00Q0V0WWDeionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2Caenorhabditis Genetics CenterN/AC. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 SpectrophotometerThermoFisherN/AFor measuring RNA concentration
OP50Caenorhabditis Genetics CenterN/ABacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O)SigmaP5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)SigmaP0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kitThermoFisher4402953For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master MixThermoFisher4367659For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach KIK International LLC.596472101436% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressionsSigmaCLS722085-18EAWatch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination SolutionThermoFisherAM9780
Sodium cloride (NaCl)SigmaS7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH)SigmaSX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O)SigmaS9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R CentrifugeThermo7500-4337For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifugeThermo7500-7200For worm egg preparation
TRIzol ReagentTheroFisher15596018RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kitThermoFisherAM1907For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59Denville Scientific INVS7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless MotorVWR47747-370For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115VWRN/AFor worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm pickerWormStuff59-AWP

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