АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает методы добавления липидов в жидких и пластинчатых культурах для Caenorhabditis elegans в сочетании с продольными исследованиями и анализом транскрипции генов из объемных или нескольких червей и тканей червей.

Аннотация

Старение является сложным процессом, характеризующимся прогрессирующими физиологическими изменениями, возникающими в результате как экологического, так и генетического вклада. Липиды имеют решающее значение для создания структурных компонентов клеточных мембран, хранения энергии и в качестве сигнальных молекул. Регуляция липидного обмена и передачи сигналов необходима для активации различных путей долголетия. Круглый червь Caenorhabditis elegans является отличным и мощным организмом для препарирования вклада липидного обмена и передачи сигналов в регуляцию долголетия. Многочисленные исследования описывали, как пищевые добавки специфических молекул липидов могут продлить продолжительность жизни C. elegans ; однако незначительные различия в условиях приема добавок могут вызвать проблемы воспроизводимости у ученых в разных лабораториях. Здесь сообщается о двух подробных методах добавок для C. elegans, использующих липидные добавки либо с бактериями, посеянными на пластинах, либо с бактериальной суспензией в жидкой культуре. Также в настоящем описании приведены сведения для выполнения анализов продолжительности жизни с пожизненным приемом липидных добавок и qRT-PCR-анализа с использованием целого лизата червя или рассеченных тканей, полученных от нескольких червей. Используя комбинацию продольных исследований и транскрипционных исследований при приеме липидных добавок, анализы кормления обеспечивают надежные подходы к анализу того, как липиды влияют на долголетие и здоровое старение. Эта методология также может быть адаптирована для различных подходов к скринингу питания для оценки изменений в подмножестве транскриптов с использованием либо небольшого количества рассеченных тканей, либо нескольких животных.

Введение

Липидов
Липиды представляют собой небольшие гидрофобные или амфипатические молекулы, растворимые в органических растворителях, но нерастворимые в воде 1,2. Различные липидные молекулы дифференцируются друг от друга на основе количества атомов углерода, содержащихся в их цепях, расположения, количества двойных связей и связанных структур, включая глицерин или фосфаты. Липиды играют решающую роль внутри и между отдельными клетками для регулирования функций организма, включая создание мембранных бислоев, обеспечение накопления энергии и действие в качестве сигнальных молекул 3,4.

Во-первых, липиды являются структурными компонентами биологических мембран, включая плазматическую мембрану и внутриклеточные субклеточные мембраны, которые отделяют внутренние компартменты от внеклеточной среды. Во-вторых, липиды являются основной формой накопления энергии у позвоночных и беспозвоночных животных. Нейтральные липиды, в том числе триацилглицерины, хранятся в течение длительного периода в различных тканях, в том числе в жировой ткани. У нематоды Caenorhabditis elegans кишечник является основным метаболическим органом хранения жира; его функция заключается не только в переваривании и усвоении питательных веществ, но и в процессе детоксикации, что напоминает активность гепатоцитов млекопитающих. Другие жиросохраняющие ткани включают зародышевую линию, в которой липиды необходимы для развития ооцитов, и гиподерму, которая состоит из кожистых клеток эпидермиса 3,5. В-третьих, в последние годы появилось больше доказательств того, что липиды являются мощными сигнальными молекулами, участвующими во внутри- и внеклеточной сигнализации, непосредственно воздействуя на различные рецепторы, включая рецепторы, связанные с G-белком, и ядерные рецепторы, или косвенно через модуляцию текучести мембраны или посттрансляционные модификации 6,7,8,9 . Дальнейшие исследования будут продолжать выяснять основные молекулярные механизмы передачи липидных сигналов в целях содействия долголетию и здоровью.

Модельные организмы важны для решения конкретных биологических вопросов, которые слишком сложны для изучения на людях. Например, круглый червь C. elegans является отличной моделью для проведения генетического анализа для препарирования биологических процессов, имеющих отношение к питанию человека и болезням10. Высоко консервативные молекулярные пути, относящиеся к физиологии человека, сложным тканям, поведенческим паттернам и обильным инструментам генетических манипуляций делают C. elegans замечательным модельным организмом11. Например, C. elegans отлично справляется с передачей генетических скринингов для идентификации генов, специфичных для фенотипа, а также в геномных обратных генетических скринингах с помощью РНК-интерференции12.

В лабораториях нематоды выращивают на агаровых пластинах Петри, засеянных газоном бактерий Escherichia coli, обеспечивающих макроэлементы, такие как белки, углеводы, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты в качестве источников энергии и строительных блоков, а также микроэлементы, такие как кофакторы и витамины13. Подобно млекопитающим, нематоды синтезируют молекулы жирных кислот как из пальмитиновой кислоты, так и из стеариновой кислоты (насыщенные 16-углеродные и 18-углеродные молекулы соответственно), которые последовательно денасыщены и удлинены до различных мононенасыщенных жирных кислот (MUFA) и полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК)14,15,16,17,18. Интересно, что C. elegans способен de novo синтезировать все необходимые жирные кислоты и основные ферменты, участвующие в биосинтезе жирных кислот, десатурации и удлинении, облегчая синтез длинноцепочечных ПНЖК19. В отличие от других видов животных, C. elegans может превращать 18-углеродные и 20-углеродные ω-6 жирные кислоты в ω-3 жирные кислоты с помощью собственных ферментов ω-3 десатуразы. Кроме того, черви обладают Δ12 десатуразой, которая катализирует образование линолевой кислоты (LA) из олеиновой кислоты (OA, 18: 1) 20,21. Большинство животных или растений испытывают недостаток как Δ12, так и ω-3 десатураз и, таким образом, полагаются на диетическое потребление ω-6 и ω-3 для получения своих ПНЖК, тогда как C. elegans не требует диетических жирных кислот22. Изолированные мутанты, лишенные функциональных ферментов десатуразы, использовались для изучения функций конкретных жирных кислот в различных биологических процессах, включая размножение, рост, долголетие и нейротрансмиссию. Влияние отдельных жирных кислот на конкретные биологические пути может быть рассмотрено с использованием как генетического подхода, так и пищевых добавок 16,17,23. На сегодняшний день исследования липидов сосредоточены на характеристике генов, участвующих в синтезе, деградации, хранении и разрушении липидов в неврологических условиях и условиях развития24. Однако роль липидов в регуляции долголетия только начинает раскрываться.

Липидная сигнализация в регуляции долголетия
Липиды играют решающую роль в регуляции долголетия, активируя клеточные сигнальные каскады в различных тканях и типах клеток. Недавние исследования подчеркнули активную роль липидов в модуляции транскрипции и клеточно-клеточной коммуникации через липидсвязывающие белки или распознавание мембранных рецепторов25. Кроме того, диетические липидные добавки предлагают отличный инструмент для анализа того, как липидный обмен влияет на продолжительность жизни у C. elegans. Было показано, что различные МУФА и ПНЖК способствуют долголетию путем активации факторов транскрипции26,27.

Модели долголетия, включая передачу сигналов инсулина / ИФР-1 и абляцию клеток-предшественников зародышевой линии, связаны с путем биосинтеза MUFA, и добавки MUFA, включая олеиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту и цис-вацценовую кислоту, достаточны для продления продолжительности жизни C. elegans 26. Хотя эффект долголетия, предоставляемый введением MUFA, требует дальнейшего изучения, основной механизм, вероятно, будет опосредован фактором транскрипции SKN-1 / Nrf2, который является ключевым активатором реакции на окислительный стресс и регуляции долголетия28,29. Среди MUFAs определенный класс жирных ацилэтаноламидов, называемых N-ацилэтаноламинами (NAE), играет решающую роль в различных механизмах, включая воспаление, аллергию, обучение, память и энергетический метаболизм30. В частности, липидная молекула, известная как олеоилэтаноламид (OEA), была идентифицирована как положительный регулятор долголетия, способствуя транслокации липидсвязывающего белка 8 (LBP-8) в ядро для активации рецепторов ядерного гормона NHR-49 и NHR-807. Добавление аналога OEA KDS-5104 является достаточным для продления продолжительности жизни и индуцирует экспрессию генов, участвующих в реакциях окислительного стресса и митохондриальной β окислении 7,8.

В то же время роль ПНЖК также связана с регулированием продолжительности жизни. Введение ПНЖК ω-3 жирных кислот α-линоленовой кислоты (ALA) способствует долголетию путем активации факторов транскрипции NHR-49/PPARα, SKN-1/NRF и индуцирования митохондриального β-окисления31. Интересно, что перекисные продукты ALA, называемые оксилипинами, активируют SKN-1 / NRF, предполагая, что как ПНЖК, так и их окислительные производные могут придавать преимущества долголетия23. Добавление ω-6 жирных кислот арахидоновой кислоты (АА) и дигомо-γ-линоленовой кислоты (DGLA) продлевает продолжительность жизни за счет активации аутофагии, способствуя контролю качества белка и приводя к деградации расточительных и токсичных белковых агрегатов27,32. Совсем недавно было показано, что клеточная неавтономная сигнальная регуляция, опосредованная липид-связывающим белком 3 (LBP-3) и DGLA, имеет решающее значение для содействия долголетию путем отправки периферических сигналов нейронам, предполагая долгосрочную роль липидных молекул в межткановой коммуникации на системных уровнях33. В настоящем исследовании сообщается о каждом шаге для выполнения липидных добавок с бактериями, посеянными на пластинах или бактериальной суспензией в жидкой культуре. Эти методологии используются для оценки продолжительности жизни и транскрипционного анализа, используя содержимое всего тела или рассеченные ткани, полученные от нескольких червей. Следующие методы могут быть адаптированы к различным исследованиям в области питания и предлагают действительный инструмент для анализа того, как липидный обмен влияет на долголетие и здоровое старение.

протокол

На рисунке 1 показана схема кормления липидами с использованием различных экспериментальных установок.

1. Получение липидных бактерий

  1. Приготовьте базовый раствор для ограничения рациона бактерий (BDR), растворив 5,85 г NaCl, 1,0 г K2HPO4 и 6,0 г KH2PO4 (см. Таблицу материалов) в 999 мл деионизированной воды. Отрегулируйте рН до 6,0 с 0,5 М КОН, а затем отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор BDR можно хранить при комнатной температуре для длительного хранения.
  2. Приготовьте среду BDR, добавив 10 мкл холестерина 5 мг/мл (растворенного в 200-стойком этаноле) на каждые 10 мл базового раствора BDR.
  3. Распределите бактерии OP50 (см. Таблицу материалов) от -80 °C до пластин LB-агара и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После ночной инкубации при 37 °C пластину OP50 можно хранить при 4 °C в течение 1 недели для стабильных результатов кормления.
  4. Инокулируют бактерии OP50 из пластины OP50 LB-агара в среду LB и инкубируют в шейкере 37 °C в течение ночи (16 ч).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый средний объем LB зависит от экспериментальных настроек. Рекомендуется использовать 200 мкл 5x концентрированных бактерий, посеянных на каждую из 6 см пластин и 1 мл 5x концентрированных бактерий для каждой из 10 см пластин и каждой реплики условий жидкого кормления. Таким образом, 1 мл и 5 мл начальной прививки LB должны быть подготовлены для каждой культуры, питающейся липидами, соответственно.
  5. Собирайте бактерии центрифугированием при 4000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Выбросьте супернатант.
  6. Суспендировать бактериальную гранулу в 20 мл основания BDR и центрифугу при 4000 х г в течение 10 мин. Выбросьте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для смывания остатков LB в бактериальной грануле.
  7. Суспендируйте каждую бактериальную гранулу в среде BDR, чтобы сделать 20-кратный запас бактерий BDR. Разбавьте 20x BDR бактерий со средой BDR до 5x перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 1/20 объема среды BDR исходного объема LB, чтобы достичь 20-кратной концентрации для бактерий. 20-кратный запас бактерий может храниться при температуре 4 °C до 1 недели.
  8. Приготовьте раствор липидного сырья, используя этанол или диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве растворителя в новом автоклавном стеклянном флаконе, и заполните стеклянный флакон аргоном или азотом для предотвращения окисления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация исходного раствора обычно составляет от 250 мМ до 1 мМ.
  9. Переведите раствор липидного сырья в нужное количество раствора бактерий BDR для достижения желаемой конечной концентрации в условиях кормления. Тщательно перемешайте путем вихря в течение 20 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация липидов при кормлении обычно составляет от 1 мкМ до 1 мМ, в зависимости от липидов и условий тестирования. Рекомендуется сначала провести пилотный эксперимент для проверки различных концентраций в диапазоне от 0,1 мкМ до 1 мМ при работе с новыми липидами. Смешайте раствор липидного сырья с бактериями BDR непосредственно перед посевом его на тарелку или помещением в жидкие культуры червей. Подготавливайте липидные бактерии не дольше, чем за 1 ч до кормления глистов.
  10. Смешайте те же объемы фильтрованного этанола или ДМСО (в зависимости от того, какой из них используется для группы подачи липидов) с бактериями BDR, чтобы служить в качестве контроля транспортного средства.

2. Подготовка синхронизированных C. elegans для липидных добавок

  1. Получают буфер М9 путем смешивания (с использованием указанных конечных концентраций) 22 мМ KH2PO4, 22 мМ Na2HPO4, 85 мМ NaCl и 2 мМ MgSO4 (см. Таблицу материалов). Автоклавируйте буфер для стерилизации.
  2. Готовят свежий отбеливающий раствор с 60% домашним отбеливателем (v/v, см. Таблицу материалов) и конечной концентрацией 1,6 М NaOH.
  3. Соберите гравидных взрослых особей в коническую трубку объемом 15 мл, используя 10 мл буфера M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество червей и пластин, необходимых для синхронизации, зависит от экспериментальных настроек (т.е. количества условий и реплик и методов кормления). В идеале, каждая полная 6 см пластина взрослых червей должна быть в состоянии дать не менее 600 червей L1 после синхронизации.
  4. Вращайте червей при 1 450 х г в течение 30 с. Удалите супернатант и промыть червей еще раз 10 мл буфера M9.
  5. Вращайте червей при 1 450 х г в течение 30 с. Аспирировать супернатант, оставляя 4 мл аликвоты в конической трубке. Добавить 2 мл отбеливающего раствора и энергично встряхнуть в течение 1 мин.
  6. Открутите червей при 1 450 х г в течение 30 с при комнатной температуре.
  7. Удалите супернатант и добавьте 4 мл буфера M9 и 2 мл отбеливающего раствора. Встряхните трубку до тех пор, пока тела червей не растворятся.
  8. Открутите яйца при 1 450 х г в течение 30 с при комнатной температуре.
  9. Удалите надосадочное вещество и вымойте яйца 10 мл буфера M9.
  10. Повторите шаги 2.8 и 2.9 3x.
  11. Приостанавливать эмбрионы с 6 мл буфера M9. Качайте эмбрионы на ротаторе при 20 °C в течение 2 дней, чтобы они вылупились и синхронизировались.
  12. Перенесите личинки L1 на пластины OP50. Инкубировать при 20 °C в течение 48 ч, чтобы собрать синхронизированных червей L4, 72 ч для взрослых на 1 день и 96 ч для взрослых на 2-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины OP50 получают путем добавления 1 мл 20 бактерий OP50 к каждой 10-сантиметровой пластине34 среды роста нематод (NGM). 30 000 червей L1 могут быть посеяны на каждую из пластин OP50, если они нацелены на сбор червей на стадии L4, и 20 000 червей L1 могут быть посеяны на каждую из пластин OP50, если цель состоит в том, чтобы собрать урожай взрослых особей дня 1 в нынешних экспериментальных условиях. Это может быть по-разному для разных лабораторных условий, поэтому рекомендуется проверить количество червей, которые могут быть посеяны, чтобы убедиться, что у червей осталось достаточно пищи до сбора урожая.
  13. Соберите L4, дневного-1 взрослого или дневного-2 взрослого червя в коническую трубку 15 мл, используя 10 мл буфера M9. Используйте еще 5 мл буфера M9, чтобы смыть оставшиеся черви с пластин.
  14. Открутите червей при 1 450 х г в течение 30 с и выбросьте супернатант. Промыть червячную гранулу 10 мл среды BDR, центрифугу при 1 450 х г в течение 30 с и выбросить супернатант.
  15. Для червей в жидком методе кормления перенесите среду BDR к червям для достижения концентрации червя 3000 червей / мл. Для червей в методах кормления на тарелке уменьшите объем среды BDR, добавляемой к червям, чтобы уменьшить время сушки на пластине.

3. Липидные добавки для C. elegans

  1. Выполняйте добавки липидов в жидкой культуре, следуя приведенным ниже шагам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод подходит для тестирования транскрипционных изменений с использованием объемных червей, дополненных липидами.
    1. Перенесите желаемое количество липидов или контроля транспортного средства на каждую из скважин в 12-луночной плите. Подготовьте три-четыре лунки для каждого условия кормления в качестве биологической репликации.
    2. Смешайте суспензию червя со стадии 2.15 с 5 бактериями BDR в соотношении 1:1 для достижения конечной концентрации 1 500 червей / мл и 2,5x для бактерий.
    3. Перенесите 2 мл смеси червячно-бактерий в среде BDR в каждую лунку 12-луночной пластины.
    4. Оберните 12-луночную пластину фольгой и встряхните в инкубаторе при температуре 20 °C при 100 об/мин для желаемой длины инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить различные условия кормления, инкубируйте липиды с червями в течение разных промежутков времени, например, в течение 6 ч, 12 ч и 24 ч. Кроме того, различные стадии червя могут быть протестированы для достижения оптимальных результатов, включая липидное питание с стадии L4 или day-1 adult.
  2. Выполняйте липидные добавки на 10 см агаровых пластинах NGM, следуя приведенным ниже шагам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод подходит для тестирования транскрипционных изменений с использованием объемных червей, дополненных липидами.
    1. Посейте 1 мл липидных бактерий со стадии 1,9 на центр каждой из 10 см пластин. Когда будет подготовлено большое количество пластин, вращайте конечный рабочий раствор несколько раз между посевом. Высушите пластины в темноте с помощью вытяжки биобезопасности.
    2. Перенесите 3000 червей с шага 2,15 на каждую из 10 см пластин. Высушите пластины в вытяжке биобезопасности, пока черви не смогут ползать по пластинам, дополненным липидами, вместо того, чтобы плавать.
    3. Инкубируйте червей на липидных пластинах в инкубаторе при температуре 20 °C в течение желаемого периода времени. Защитите от света при использовании полиненасыщенных липидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить различные условия кормления, инкубируйте липиды с червями в течение различных периодов времени, таких как 6 ч, 12 ч и 24 ч. Кроме того, различные стадии червя могут быть проверены для достижения оптимальных результатов, включая липидное питание на стадии L4 или day-1 adult.
  3. Выполняйте липидные добавки на агаровых пластинах NGM 6 см для транскрипционного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод подходит для тестирования транскрипционных изменений у нескольких червей, дополненных липидами.
    1. Посейте 300 мкл липидных бактерий со стадии 1,9 на центр каждой пластины размером 6 см. Когда будет подготовлено большое количество пластин, вращайте конечный рабочий раствор несколько раз между посевом. Высушите пластины в темноте с помощью вытяжки биобезопасности.
    2. Перенесите до 300 червей с шага 2.15 на каждую из пластин размером 6 см. Высушите пластины в вытяжке биобезопасности, пока черви не смогут ползать по пластинам, дополненным липидами, вместо того, чтобы плавать.
    3. Инкубируйте червей на липидных пластинах в инкубаторе при температуре 20 °C в течение желаемого периода времени. Защитите от света при использовании полиненасыщенных липидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить различные условия кормления, инкубируйте липиды с червями в разные моменты времени, такие как 6 ч, 12 ч и 24 ч. Кроме того, различные стадии червя могут быть проверены для достижения оптимальных результатов, включая липидное питание на стадии L4 или day-1 adult.
  4. Выполняйте липидные добавки на 6 см агаровых пластинах NGM для продольного анализа продолжительности жизни.
    1. Посейте 200 мкл липидных бактерий (с 1x концентрацией липидов и 5x концентрированными бактериями) в центр каждой из 6 см NGM пластин. Подготовьте по три тарелки для каждого условия кормления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тарелки должны быть приготовлены свежими в день использования (в идеале непосредственно перед использованием).
    2. Высушите пластины в вытяжке биобезопасности. Держите свет в вытяжке и комнате выключенным, если используете полиненасыщенные липиды.
    3. Подберите 30-40 синхронизированных червей L4 на каждую из пластин. Храните пластины с червями в инкубаторе при температуре 20 °C. При кормлении полиненасыщенными липидами храните пластины в защищенном от света боксе в инкубаторе с температурой 20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать OP50 из обычной проходной пластины 6 см (безусловный OP50) в качестве клея для сбора червей, но крайне важно не оставлять объемное количество безусловного OP50 в пробирной пластине.
    4. Переносите червей на новые, свежеприготовленные липидные пластины ежедневно или через день, в зависимости от желаемых условий кормления. Выживаемость оценивается так же, как описано ранее4.

4. Извлечение РНК для транскрипционного анализа

  1. Выполняют экстракцию РНК из массового числа целых червей.
    1. Перенесите червей в жидкую культуру со стадии 3,1 на 1,5 мл микроцентрифужных трубок. Смойте червей с пластин размером 10 см с шага 3.2 с помощью буфера M9 и перенесите червей в буфер M9 в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл.
    2. Кратковременно центрифугируйте червей с помощью настольной мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) в течение 10 с и быстро аспирируйте супернатант.
    3. Переложите остатки червей из жидких питательных колодцев или смойте с пластинчатых кормов в ту же трубку и открутите вниз. Удалите супернатант.
    4. Промыть гранулы червя 1 мл ледяного M9, ненадолго вращать в течение 10 с мини-центрифугой и аспирировать супернатант. Повторите 1x или 2x в зависимости от прозрачности супернатанта.
    5. Установите микроцентрифужные трубки на лед на 2 мин и удалите как можно больше супернатанта пипеткой объемом 200 мкл, оставив упакованную червячную гранулу объемом не более 15 мкл.
    6. Переложите 15 мкл экстракционного раствора РНК, содержащего фенол и гуанидинизотиоцианат (Таблица материалов), в каждую из микроцентрифужных трубок и измельчите червей с помощью моторной шлифовальной машины в течение примерно 30 с, пока не будут видны неповрежденные черви.
      ВНИМАНИЕ: Раствор для экстракции РНК является токсичным и легковоспламеняющимся, и любой этап, связанный с открытым контейнером с этим реагентом, должен эксплуатироваться в химической вытяжке.
    7. Перенесите 285 мкл экстракционного раствора РНК в трубку микроцентрифуги при смывании любого содержимого червя с наконечника моторной шлифовальной машины в трубку микроцентрифуги. Вихрь тщательно перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы. Образцы могут храниться в растворе для экстракции РНК при -80 °C в течение нескольких месяцев. При извлечении из -80 °C дайте образцам оттаять при комнатной температуре.
    8. Перенесите 60 мкл хлороформа в каждый образец и энергично вихрь. Дайте образцам отстояться при комнатной температуре в течение 10 мин.
      ВНИМАНИЕ: Хлороформ токсичен и должен обрабатываться в химической вытяжке.
    9. Центрифуга при 21 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Осторожно переложите 140 мкл водного слоя сверху в новую и не содержащую РНКазы микроцентрифужную трубку с помощью пипетки объемом 200 мкл, каждый раз передавая 2x с 70 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага вперед, все наконечники пипеток и контейнеры, которые имеют прямой контакт с образцом, должны быть свободны от RNase. Также рекомендуется использовать раствор для обеззараживания РНКазы для протирания всего оборудования и рабочего пространства.
    10. Перенесите 140 мкл изопропанола в пробирку. Энергично вихрь и дайте образцу отстояться при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга при 21 000 х г в течение 20 мин при 4 °C и аккуратно удалите все супернатанты.
    11. Перенесите 0,5 мл ледяного 80% этанола (v/v) в пробоотборник с гранулой РНК. Энергично вихрьте до тех пор, пока гранула РНК не покинет дно трубки и не будет плавать в растворе этанола. Центрифуга при 21 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и удалите супернатант.
    12. Кратковременно центрифугируйте пробирки в мини-центрифуге в течение 15 с, чтобы раскрутить любой растворитель, прилипший к стенке трубки, а затем удалите как можно больше раствора этанола пипеткой.
    13. Оставьте крышку трубки открытой, чтобы высушить гранулу РНК. Если гранулу тщательно промыли раствором этанола, этап сушки должен занять менее 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы. Высушенная гранула РНК может храниться при -80 °C до 1 месяца.
    14. Растворите сухую гранулу РНК 40 мкл воды без нуклеазы и обработайте с помощью набора для удаления ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сначала растворить РНК в воде, свободной от нуклеаз. Если 40 мкл воды смешать с 10-кратным буфером ДНКазы перед переносом в трубку РНК, гранула РНК не растворится полностью. Образцы РНК необходимо хранить на льду при растворении гранулЫ РНК в воде. Циклы замораживания-оттаивания снижают качество РНК; поэтому переходите к этапу обратной транскрипции в тот же день лечения ДНКазой.
  2. Извлечение РНК из небольшого количества целых червей.
    1. Соберите 15-20 червей с их бактериального газона в свежую несеянную пластину NGM, чтобы удалить бактерии из червя.
    2. По словам производителя 2-ступенчатого набора qRT-PCR (см. Таблицу материалов), для каждого образца готовят 20 мкл окончательного раствора лизиса путем смешивания 0,2 мкл ДНКазы с 19,8 мкл раствора лизиса в пробирках ПЦР. Перемешайте раствор лизиса, пипетируя вверх и вниз 5 раз.
    3. Переложить 15-20 глистов из несеянной пластины NGM в ПЦР-трубку, содержащую 20 мкл окончательного раствора лизиса с минимальным количеством бактерий. Инкубируют реакцию лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Зонд-соникатор (см. Таблицу материалов) червей с амплитудой 30% использует следующую программу: обработка ультразвуком в течение 5 с, пауза на 5 с и повторение 4x с общим временем обработки ультразвуком 20 с. Храните образцы в ледяной водяной бане во время обработки ультразвуком.
    5. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте больше ДНКазы перед инкубацией, если отрицательный контроль без RT показывает загрязнение ДНК на соответствующем уровне.
    6. Переведите 2 мкл стоп-раствора в реакцию лизиса и перемешайте, осторожно постукивая. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре, а затем поставить на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно оставить на льду на срок до 2 ч, прежде чем перейти к этапу обратной транскрипции.
  3. Выполните извлечение РНК из тканей червя, выполнив следующие действия.
    1. Соберите около 20 червей с их бактериального газона и поместите их на свежую несеянную пластину NGM, чтобы удалить бактерии из них.
    2. Переместите 20 червей (с как можно меньшим количеством бактерий) в часовое стекло, содержащее 500 мкл раствора M9, содержащего 4 мкМ левамизола (см. Таблицу материалов). Иммобилизация произойдет в течение нескольких секунд.
    3. Когда черви обездвижены, рассекните зародышевую линию или кишечник с помощью иглы 25 г, которая может быть прикреплена к шприцу 1 мл.
      1. Под областью рассечения выполните разрез в положении второй глоточной луковицы, чтобы обеспечить естественную экструзию кишечника и зародышевой линии. Эти две ткани можно легко отличить по их морфологии и различному контрасту. Используйте пинцет или иглы, чтобы аккуратно отделить ткани, избегая их повреждения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется рассечь в течение 5-10 мин. Если срез не производит хорошей экструзии тканей, предлагается перейти к следующему червю и рассечь как можно больше в течение 10 мин. Эта процедура требует коротких временных рамок, чтобы избежать транскрипционных изменений из среды.
    4. Согласно производителю 2-ступенчатого набора qRT-PCR, готовят 20 мкл окончательного раствора лизиса для каждого образца путем смешивания 0,2 мкл ДНКазы I до 19,8 мкл раствора лизиса в пробирках ПЦР. Перемешайте раствор лизиса, пипетируя вверх и вниз 5 раз.
    5. Используйте автоклавную стеклянную пипетку для переноса рассеченных тканей в ПЦР-трубку. Уложите трубки ПЦР на лед в течение 2 мин, чтобы материал осаждался на дно. Удалите надосадочное вещество, добавьте 20 мкл окончательного раствора лизиса в трубку ПЦР и перемешайте путем постукивания.
    6. Инкубируют реакцию лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем переложить 2 мкл стоп-раствора в реакцию лизиса и перемешать постукиванием. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно оставить на льду на срок до 2 ч, прежде чем перейти к этапу обратной транскрипции.

5. Обратная транскрипция и qRT-ПЦР

  1. Выполняйте обратную транскрипцию и qRT-PCR от объемных червей.
    1. Измерьте концентрацию РНК и подготовьте 5 мкг общей РНК для обратной транскрипции.
    2. Подготовьте объединенный образец РНК, смешивая равные количества РНК из каждого образца и корректируя конечную концентрацию РНК до 0,556 г/л (5 мкг/9 мкл). Используйте объединенный образец РНК для стандартной кривой qRT-PCR и ОТ-отрицательного контроля.
    3. Выполнять обратную транскрипцию в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Запустите следующие реакции обратной транскрипции контроля качества вместе с отдельными образцами РНК.
      1. Выполните обратную транскрипцию с объединенным образцом РНК в качестве шаблона (для стандартной кривой qRT-PCR).
      2. Выполните обратную транскрипцию с объединенным образцом РНК в качестве шаблона, без обратной транскриптазы (RT-отрицательный контроль; контроль качества потенциального загрязнения ДНК генома).
      3. Выполнять обратную транскрипцию с водой без нуклеаз в качестве шаблона (RT-отрицательный контроль; контроль качества потенциального загрязнения РНК в реагентах).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы. Образцы можно оставить в термоциклере на ночь или хранить при -20 °C в течение нескольких месяцев.
    4. Разбавить кДНК, полученную из объединенных образцов РНК, четыре раза, 20 раз, 100 раз и 500 раз водой без нуклеазы для стандартных кривых qRT-PCR.
    5. Разбавляют кДНК, генерируемую из каждого образца РНК, 20-100 раз для использования в качестве шаблонов для реакций qRT-PCR.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления зависит от обилия интересующего гена. Для высокоэкспрессированных генов, таких как гены домашнего хозяйства или egl-3 и egl-21 , используемые в этом исследовании, рекомендуется 100-кратное разведение. Для генов с низкой экспрессией, таких как lbp-8, рекомендуется 20-кратное разведение.
    6. Выполняют qRT-PCR с реагентами qRT-PCR в соответствии с инструкциями производителя следующим образом: 95 °C в течение 10 мин, повторяйте 40 раз с 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 мин, за которым следует программа кривой плавления по умолчанию, и держите при 8 °C в течение неопределенного времени.
  2. Выполняйте обратную транскрипцию и qRT-ПЦР из нескольких червей или тканей червей.
    1. Перенос 25 мкл буфера RT и 2,5 мкл 20-кратной смеси ферментов RT из 2-ступенчатого набора qPCR (см. Таблицу материалов) в каждую трубку, содержащую червячный лизат, из стадии 4.2.6 или стадии 4.3.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ОТ-отрицательный контроль имеет решающее значение для qRT-PCR от нескольких червей. Каждый эксперимент должен включать образец червячного лизата (из шага 4.2.6) с буфером RT, но без фермента RT для изучения загрязнения ДНК в образцах. Если загрязнение ДНК является проблемой, рассмотрите возможность добавления большего количества ДНКазы в буфер лизиса или большего количества ДНКазы в образец после лизирования червей. Альтернативно, можно выполнить RT-отрицательный контроль для каждого образца, используя половину лизата в нормальной реакции RT и другую половину в реакции RT без обратной транскриптазы.
    2. Перемешайте, аккуратно постукивая. Открутите вниз с помощью мини-центрифуги в течение 10 с.
    3. Загрузите образцы в термоциклерную машину в соответствии с инструкциями завода-изготовителя: 37 °C в течение 60 мин, 95 °C в течение 5 мин и 8 °C в течение неопределенного времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы. Образцы можно оставить в термоциклере на ночь или хранить при -20 °C в течение нескольких месяцев.
    4. Храните все реагенты и образцы на льду и защищайте реагенты qRT-PCR от света.
    5. Приготовьте 96-луночную пластину qPCR и в каждой скважине смешайте 6 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл реагента qRT-PCR, 2 мкл 5 мкМ праймерной смеси (прямой и обратной) и 2 мкл кДНК. Покрыть поверхность пластины qPCR с 96 лунками защитной оптической пленкой и прижать к уплотнению.
    6. Запустите программу qRT-PCR на термоциклере, следуя инструкциям производителя следующим образом: 50 °C в течение 2 мин, 95 °C в течение 2 мин, повторите 40 раз с 95 °C в течение 3 с и 60 °C в течение 30 с, а затем 8 °C в течение неопределенного времени.

Результаты

Валидация транскрипционных изменений с использованием нескольких целых червей при приеме липидных добавок
Чтобы исследовать, является ли протокол извлечения и ретротранскрибирования РНК в кДНК от нескольких целых червей воспроизводимым и сопоставимым с данными объемных ...

Обсуждение

Липидные добавки были использованы в исследованиях старения, чтобы прояснить прямое влияние некоторых видов липидов на здоровое старение 6,7,23,26,27,31. Тем не менее, процедура добав...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Благодарим. Свая за техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами NIH R01AG045183 (MCW), R01AT009050 (MCW), R01AG062257 (MCW), DP1DK113644 (MCW), March of Dimes Foundation (MCW), Welch Foundation (MCW), HHMI investigator (M.C.W.) и NIH T32 ES027801 pre-doctoral student fellow (M.S.). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL PestleGenesee Scientific93-165P15For worm grinding with Trizol
AgaroseSigmaA9639-500G
AmfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master MixGenDEPOTR5600For reverse transcription from bulk worm samples
Applied Biosystems QuanStudio 3 Real-Time PCRThermoFisherA28567For qRT-PCR
Benchmark Scientific StripSpin 12 MicrocentrifugeBenchmark ScientificC1248For spin down PCR tubes
Branson 450 Digital Sonifier, w/ 1/8" tipBranson Ultrasonic Corporation100-132-888R
ChloroformFisher ScientificC298-500
CholesterolSigmaC8503-25G
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-100ML
Eppendorf 5424 R centrifugeEppendorf22620444RFor RNA extraction
Eppendorf vapo protect mastercycler proEppendorf950030010For reverse transcription
Ethanol, Absolute (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-500
Greiner Bio-One CELLSTAR, 12 W PlateNeta Scientific66518012-well plates for licuid feeding
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 100 x 20 mmNeta Scientific664161For bacterial LB plates and worm 10-cm NGM plates
Greiner Bio-One Petri Dish, Ps, 60 x 15 mmNeta Scientific628161For worm6-cm NGM plates
Invitrogen nuclease-free waterThermoFisherAM9937
IsoproanolSigmaPX1835-2
Levamisole hydrochlorideVWRSPCML1054
lipl-4TgMCW LabN/ATransgenic C. elegans
lipl-4Tg;fat-3(wa22)MCW LabN/ATransgenic C. elegans
Luria Broth BaseThermoFisher12795-084
Magnesium sulfate (MgSO4)SigmaM2643-500G
MicroAmp EnduraPlate Optical 96-Well Fast Clear Reaction Plate with BarcodeThermoFisher448335496-well qPCR plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied BioSystem4311971For sealing the 96-well qPCR plate
Milli-Q Advantage A10 Water Purification SystemSigmaZ00Q0V0WWDeionized water used to make all reagents, including buffer and cultural media, unless specified as nuclease-free water in the protocol
N2Caenorhabditis Genetics CenterN/AC. elegans wild isolate
NanoDrop ND-1000 SpectrophotometerThermoFisherN/AFor measuring RNA concentration
OP50Caenorhabditis Genetics CenterN/ABacteria used as C. elegans food
Potasium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4·3H2O)SigmaP5504-1KG
Potasium phosphate monobasic (KH2PO4)SigmaP0662-2.5KG
Power SYBR Green cells-to-Ct kitThermoFisher4402953For reverse transcription and qPCR from a few worms or worm tissue
Power SYBR Green Master MixThermoFisher4367659For qPCR from bulk worm samples
Pure Bright germicidal ultra bleach KIK International LLC.596472101436% house bleach For worm egg preparation
Pyrex spot plate with nine depressionsSigmaCLS722085-18EAWatch glass for dissecting the worms
RNaseZap RNase Decontamination SolutionThermoFisherAM9780
Sodium cloride (NaCl)SigmaS7653-1KG
Sodium hydroxide (NaOH)SigmaSX0590-3
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O)SigmaS9390-1KG
Thermo Sorvall Legend Mach 1.6R CentrifugeThermo7500-4337For bacteria collection
Thermo Sorvall ST 8 centrifugeThermo7500-7200For worm egg preparation
TRIzol ReagentTheroFisher15596018RNA extraction reagent
Turbo DNA-free kitThermoFisherAM1907For removing DNA contamination in RNA extractions
Vortexer 59Denville Scientific INVS7030
VWR Disposable Pellet Mixers and Cordless MotorVWR47747-370For worm grinding with Trizol
VWR Kinetic Energy 26 Joules Mini Centrifuge C1413 V-115VWRN/AFor worm collection. Discontinued model, a similar one available at VWR with Cat# 76269-064
Worm pickerWormStuff59-AWP

Ссылки

  1. Fahy, E., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids 1. Journal of Lipid Research. 50, 9-14 (2009).
  2. Liebisch, G., et al. Update on LIPID MAPS classification, nomenclature, and shorthand notation for MS-derived lipid structures. Journal of Lipid Research. 61 (12), 1539-1555 (2020).
  3. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Developmental Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  4. Kimura, T., Jennings, W., Epand, R. M. Roles of specific lipid species in the cell and their molecular mechanism. Progress in Lipid Research. 62, 75-92 (2016).
  5. Duffy, J., Mutlu, A. S., Wang, M. C., Olsen, A., Gill, M. Lipid Metabolism, Lipid Signalling and Longevity. Ageing: Lessons from C. elegans. Healthy Ageing and Longevity. , 307-329 (2017).
  6. Lesa, G. M., et al. Long chain poly-unsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans. Journal of Cell Science. 116 (24), 4965-4975 (2003).
  7. Folick, A., et al. Lysosomal signaling molecules regulate longevity in Caenorhabditis elegans. Science. 347 (6217), 83-86 (2015).
  8. Ramachandran, P. V., et al. Lysosomal signaling promotes longevity by adjusting mitochondrial activity. Developmental Cell. 48 (5), 685-696 (2019).
  9. Byrne, E. F. X., et al. Structural basis of Smoothened regulation by its extracellular domains. Nature. 535 (7613), 517-522 (2016).
  10. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A. Transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  11. Nigon, V. M., Félix, M. -. A. History of research on C. elegans and other free-living nematodes as model organisms. WormBook. , 1-84 (2017).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PloS ONE. 4 (10), 7545 (2009).
  14. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (2), 865-875 (2007).
  15. Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans. PloS Genetics. 2 (7), 108 (2006).
  16. Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. Deficiencies in C20 poly-unsaturated fatty acids cause behavioral and developmental defects in Caenorhabditis elegans fat-3 mutants. Genetics. 163 (2), 581-589 (2003).
  17. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of poly-unsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (9), 5854-5859 (2002).
  18. Watts, J. L., Browse, J. A. Palmitoyl-CoA-specific Δ9 fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 263-269 (2000).
  19. Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends in Endocrinology & Metabolism. 20 (2), 58-65 (2009).
  20. Peyou-Ndi, M. M., Watts, J. L., Browse, J. Identification and characterization of an animal Δ12 fatty acid desaturase gene by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Biochemistry and Biophysics. 376 (2), 399-408 (2000).
  21. Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. Identification of an animal ω-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (4), 1142-1147 (1997).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Isolation and characterization of a Δ5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Archives of Biochemistry and Biophysics. 362 (1), 175-182 (1999).
  23. Deline, M. L., Vrablik, T. L., Watts, J. L. Dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (81), e50879 (2013).
  24. Estes, R. E., Lin, B., Khera, A., Davis, M. Y. Lipid metabolism influence on neurodegenerative disease progression: is the vehicle as important as the cargo. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 788695 (2021).
  25. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Current Opinion in Lipidology. 28 (5), 408-413 (2017).
  26. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  27. O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. ω-6 Poly-unsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy. Genes & Development. 27 (4), 429-440 (2013).
  28. Steinbaugh, M. J., et al. Lipid-mediated regulation of SKN-1/Nrf in response to germ cell absence. eLife. 4, 07836 (2015).
  29. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 88, 290-301 (2015).
  30. Ezzili, C., Otrubova, K., Boger, D. L. Fatty acid amide signaling molecules. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 20 (20), 5959-5968 (2010).
  31. Qi, W., et al. The ω-3 fatty acid α-linolenic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan via NHR-49/PPARα and oxidation to oxylipins. Aging Cell. 16 (5), 1125-1135 (2017).
  32. Shemesh, N., Meshnik, L., Shpigel, N., Ben-Zvi, A. Dietary-induced signals that activate the gonadal longevity pathway during development regulate a proteostasis switch in Caenorhabditis elegans adulthood. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 254 (2017).
  33. Savini, M., et al. Lysosome lipid signalling from the periphery to neurons regulates longevity. Nature Cell Biology. 24 (6), 906-916 (2022).
  34. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  35. Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322 (5903), 957-960 (2008).
  36. Jacob, T. C., Kaplan, J. M. The EGL-21 carboxypeptidase E facilitates acetylcholine release at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscience. 23 (6), 2122-2130 (2003).
  37. Kass, J., Jacob, T. C., Kim, P., Kaplan, J. M. The EGL-3 proprotein convertase regulates mechanosensory responses of Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9265-9272 (2001).
  38. Bael, S. V., et al. Mass spectrometric evidence for neuropeptide-amidating enzymes in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 293 (16), 6052-6063 (2018).
  39. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены