构建人主动脉平滑肌细胞器官芯片模型，用于概括主动脉壁中的生物力学应变

摘要

在这里，我们开发了一种人主动脉平滑肌细胞器官芯片模型，以复制人主动脉壁中平滑肌细胞的 体内 生物力学应变。

摘要

传统的二维细胞培养技术和动物模型已用于人胸主动脉瘤和夹层（TAAD）的研究。然而，人类TAAD有时不能用动物模型来表征。临床人体研究和动物实验之间存在明显的物种差距，这可能会阻碍治疗药物的发现。相比之下，传统的细胞培养模型无法模拟 体内 生物力学刺激。为此，微细加工和微流体技术近年来有了长足的发展，为建立复制生物力学微环境的芯片类器官模型提供了新技术。在这项研究中，开发了人主动脉平滑肌细胞器官芯片（HASMC-OOC）模型来模拟主动脉生物力学的病理生理参数，包括人主动脉平滑肌细胞（HASMC）经历的周期性应变的幅度和频率在TAAD中起至关重要的作用。在该模型中，HASMC的形态在形状上变得细长，垂直于应变方向对齐，并且在应变条件下呈现比静态常规条件下更具收缩性的表型。这与天然人主动脉壁中的细胞取向和表型一致。此外，使用二叶式主动脉瓣相关TAAD（BAV-TAAD）和三尖瓣主动脉瓣相关TAAD（TAV-TAAD）患者来源的原发性HASMC，我们建立了BAV-TAAD和TAV-TAAD疾病模型，这些模型复制了TAAD中的HASMC特征。HASMC-OOC模型提供了一个与动物模型互补的新型 体外 平台，用于进一步探索TAAD的发病机制和发现治疗靶点。

引言

胸主动脉瘤和夹层 （TAAD） 是主动脉壁的局部扩张或分层，与高发病率和死亡率有关¹。人主动脉平滑肌细胞（HASMC）在TAAD的发病机制中起着至关重要的作用。HASMC不是终末分化的细胞，HASMC保持高可塑性，允许它们响应不同的刺激切换表型²。HASMCs在 体内主要受到节律性拉伸应变，这是调节平滑肌形态变化、分化和生理功能的关键因素之一^3，4。因此，循环应变在HASMCs研究中的作用不容忽视。然而，传统的2D细胞培养物无法复制HASMC在 体内经历的循环菌株的生物力学刺激。此外，动物TAAD模型的构建不适用于某些类型的TAAD，例如二叶式主动脉瓣（BAV）相关的TAAD。此外，临床人体研究与动物实验之间的物种差距也不容忽视。它阻碍了临床实践中的药物翻译。因此，在主动脉疾病的研究中迫切需要更复杂的生理系统来模拟 体内 生物力学环境。

用于生物医学研究和药物开发的动物实验成本高昂，耗时且在道德上存在问题。此外，动物研究的结果经常无法预测在人体临床试验中获得的结果^5，6。缺乏人类临床前模型和临床试验中的高失败率导致临床有效药物很少，这增加了医疗保健成本⁷。因此，迫切需要寻找其他实验模型来补充动物模型。近年来，微细加工和微流控技术得到了长足的发展，为建立类器官芯片模型提供了新技术，弥补了传统2D细胞培养技术的缺点，并为生理研究和药物开发建立了更现实、低成本和高效的体外模型。使用微流体装置，建立器官芯片，在具有不同刺激的微米大小的腔室中培养活细胞，以复制组织或器官的关键功能。该系统由单个或多个微流体微通道组成，其中一种细胞在灌注室中培养，复制一种组织类型的功能，或者在多孔膜上培养不同的细胞类型以重建不同组织之间的界面。基于微流控的类器官与患者来源的细胞相结合，具有弥合小鼠和人类疾病模型之间巨大物种差异的独特优势，并克服了传统2D细胞培养在疾病机制研究和药物发现方面的缺点。随着过去几年微流控技术的快速发展，研究人员已经意识到体外器官芯片（OOC）模型复制复合体内生物学参数的有用性⁸。这些微流体类器官模拟体外生物力学环境，如循环应变、剪切应力和液体压力，提供三维 （3D） 细胞培养环境。迄今为止，已经建立了几个OOC模型来模拟肺⁹，肾脏10，肝脏11，肠^{12和心脏13}等器官的生物力学刺激^，但这些模型尚未广泛应用于人类主动脉疾病的研究。

在这项研究中，我们提出了一种人主动脉平滑肌细胞器官芯片（HASMC-OOC）模型，该模型可以控制应用于TAAD患者来源的原发性HASMC的仿生机械力和节律。该芯片由蚀刻有通道的三层聚二甲基硅氧烷（PDMS）厚板和两个商业化的高柔性PDMS膜组成。HASMC在PDMS膜上培养。芯片中间的通道充满了用于细胞培养的培养基。芯片的顶部和底部通道连接到真空压力供应系统，该系统可以控制PDMS膜机械拉伸应变的节奏和频率。HASMC所经历的节律应变可以在HASMC-OOC中模拟，复制传统2D培养系统无法实现的组织或器官的生物力学微环境。利用高分辨率、实时成像和生物力学微环境的优势，可以研究活细胞的生化、遗传和代谢活性，用于组织发育、器官生理学、疾病病因、分子机制和生物标志物鉴定、心血管疾病和主动脉疾病。结合组织特异性和患者细胞，该系统可用于药物筛选、个性化医疗和毒性测试。该HASMC-OOC模型为研究主动脉疾病的发病机制提供了一个新颖的 体外 平台。

研究方案

经复旦大学伦理委员会中山医院批准，采用人主动脉标本进行原发性HASMC分离。B2020-158）。从复旦大学附属中山医院行升主动脉手术的患者中采集主动脉标本。参与前获得所有患者的书面知情同意。

1.原发性人主动脉平滑肌细胞分离

1. 用无菌PBS清洗升主动脉的右侧区域，1x-2x。
2. 用两个眼科镊子去除组织的内膜和外膜层，并保留培养基层以收获细胞。
3. 将培养基层放在10厘米的培养皿上，用剪刀将其切成小块（2-3毫米）。加入含有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 5 mL 平滑肌细胞培养基 （SMCM）。
4. 用无菌滴管将小组织移动到培养瓶中，均匀地铺开组织。尽可能丢弃培养基，然后将瓶子倒置。
5. 将2mL SMCM加入倒置培养瓶中，并将其置于37°C的培养箱（5%CO 2）中_1-2小时，然后缓慢将其右侧朝上并加入另外2mL SMCM。
6. 孵育 5-7 天后，将 SMCM 与 4 mL 新鲜 SMCM 交换。一般来说，散发的平滑肌细胞在大约 2 周内爬出来。
7. 慢慢丢弃SMCM，并在更换介质时缓慢添加。移动到显微镜站时缓慢运输培养瓶;否则，组织会漂浮，细胞会缓慢生长。
8. 当细胞达到约80%汇合时，用2mL PBS洗涤，用2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，并将它们分成两个装有4 mL新鲜SMCM的新培养瓶中。
9. 通过对平滑肌细胞（CNN1，SM22）的四种不同特异性标记物进行免疫荧光分析来鉴定细胞¹⁴。

2. PDMS芯片的制备

1. 为了聚合PDMS，以A:B = 10:1w / w的重量比将固化剂（B组分）添加到碱（A组分）中，并将络合物完全混合5分钟;数量取决于研究的需要。
2. 将制备好的PDMS凝胶置于真空提取罐中30-60分钟，并将压力保持在-0.8mPa以下。
   注意:高压将导致PDMS凝胶内部的小气泡提取不足，这将影响芯片制造的下一步。
3. 使用计算机辅助设计 （CAD） 软件，使用 100 mm × 40 mm × 8 mm 外部框架结构和 70 mm × 6 mm × 4 mm 通道设计模具。
4. 使用高精度计算机数控雕刻机定制制作三层模具。使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板雕刻出模具的框架和微通道，然后将它们粘在另一个PMMA板上。
5. 将制备好的PDMS凝胶倒入具有100毫米×40毫米×6毫米外框和70毫米×6毫米×4毫米通道的模具上，然后在70°C下交联1-2小时。
6. 从模具上剥离交联的PDMS板，并将商业化的PDMS膜切割成100毫米×40毫米的部分。
7. 用氧等离子体处理三个制备的PDMS板和两个PDMS膜5分钟以进行PDMS表面活化。应用以下特定设置:室内空气作为工艺气体;压力设置为 -100 kPa;电流设置为 180--200 mA;电压设置为 200 V;处理时间达 5 分钟。
8. 使用1毫米的打孔机在三个PDMS板上打孔，以在PDMS芯片上制作空气和介质微通道的入口和出口。
9. 按顺序将三个PDMS板和两个PDMS膜粘合在一起:空气通道PDMS板（顶层）-PDMS膜-中通道PDMS板（中间层）-PDMS膜-空气通道PDMS板（底层）。在4倍的立体显微镜下执行此步骤，以使空气微通道与介质微通道完全重叠。
10. 将组装好的PDMS芯片置于70°C培养箱中1小时。
11. 准备几根内径为1毫米，长度为3厘米的乳胶软管。将外径为1毫米，长1厘米的不锈钢针插入准备好的软管的一端，然后将鲁尔插入软管的另一端，以形成连接到PDMS芯片的空气和介质微通道的管子。
12. 将准备好的管插入PDMS芯片上的空气和介质微通道的出口和入口。

3. PDMS芯片表面处理和灭菌

1. 使用 2 mL 注射器将 2 mL 的 80 mg/mL 小鼠胶原蛋白注入 PDMS 芯片的培养基微通道中，并在室温下孵育 30 分钟。
2. 孵育后，从通道中取出胶原蛋白，并用2mL注射器回忆。将涂有胶原蛋白的PDMS芯片放入60°C培养箱中过夜。
3. 将PDMS芯片放入紫外线灭菌器中超过1小时。将灭菌的PDMS芯片放在超洁净工作台上，为细胞实验做准备。

4. PDMS芯片上的细胞接种和细胞拉伸过程

1. 使用含有2%胎牛血清（FBS）和1%青霉素 - 链霉素的平滑肌细胞培养基（SMCM）在37°C的5%CO₂培养箱中培养4 x 10⁵原代人平滑肌细胞（HASMC）。
2. 当HASMC密度达到80%时，丢弃SMCM并用2mL PBS洗涤细胞。
3. 使用 1 mL 的 0.25% 胰蛋白酶消化细胞 2 分钟，并以 100 x g 离心 5 分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL新鲜SMCM中。使用 8 mL SMCM 在 10 cm 培养皿上培养细胞。
4. 使用细胞仪计算细胞数，并以2 x 10⁵ 个细胞/ mL的终浓度使用细胞。
5. 将 2 mL PBS 缓慢倒入涂有胶原蛋白包衣和灭菌的 PDMS 芯片培养基微通道中，然后使用 2 mL 注射器丢弃。
6. 使用 2 mL 注射器将总共 2 mL 的 2 x 10⁵ 细胞/mL HASMC 悬浮液缓慢倒入 PDMS 芯片的培养基微通道中。然后，关闭 PDMS 芯片入口和出口处的鲁尔。将PDMS芯片置于37°C的培养箱（5%CO₂）中1天。
7. 将细胞附着在PDMS芯片中的PDMS膜上后，近24小时后，将PDMS芯片上的空气微通道出口连接到真空控制器系统。当细胞附着时，在显微镜下可以看到细长的正常细胞形式，与悬浮的圆形细胞形成鲜明对比。
8. 打开电磁阀和真空泵。打开真空调节器，将压力水平调节为 10 kPa（对于 7.18 ± 0.44% 应变）和 15 kPa（对于 17.28 ± 0.91% 应变）。
9. 设置控制系统的参数后，将PDMS芯片置于37°C的培养箱（5%CO₂）中并拉伸24小时。

5. 机械控制系统的准备

1. 准备几个电磁阀、真空过滤器、真空调节器、真空泵、蠕动泵和一个控制电磁阀的可编程逻辑控制器 （PLC）。
2. 对 PLC 控制器进行编程，并将开/关时间间隔设置为 1 Hz。 将电磁阀连接到编程控制器。
3. 将真空泵的入口连接到真空过滤器，然后将真空过滤器的出口连接到真空调节器。将真空调节器的出口连接到电磁阀，最后将电磁阀的出口连接到PDMS芯片的空气微通道的出口。
4. 将蠕动泵的出口连接到PDMS芯片的培养基微通道的入口，蠕动泵的入口连接到培养基微通道PDMS芯片的出口，用于培养基更换和药物处理。
5. 通过调节器调整应变幅度，通过微控制器调整应变频率。

结果

HASMC-OOC模型由真空控制系统、循环系统和PDMS芯片以及HASMC-OOC模型的原理图设计组成（图1）。真空控制系统由真空泵、电磁阀和 PLC 控制器组成。为了充当循环系统，使用蠕动泵来更新细胞培养基并添加药物。PDMS芯片由两个真空室和一个充满SMCM的中间室组成，用于细胞生长。根据芯片结构设计，制备PMMA模具，将3块PDMS板坯倒入模具中，在70 °C交联2 h。用血浆处理后，将三个P...

讨论

随着微流控技术的快速发展，近年来出现了可以在体外复制一个或多个器官的生物学功能和结构的OOC模型，用于生物学，医学和药理学¹⁵。OOC可以模拟人体生理微环境的关键功能，对于探索疾病机制和促进临床前^{药物翻译至关重要}8^，16。虽然OOC仍处于早期阶段，需要更多的投入来优化OOC的设计，但近年来已经取得了很大进展

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0099-100ml	Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0408	Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025-20g
Calcium AM/PI	Invitrogen	L3224
Cell culture flask	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
Commercial flexible PDMS membrane	Hangzhou Bald Advanced Materials	KYQ-200
F-actin	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
Hoses	Runze Fluid	96410	1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth muscle cell line CRL1999	ATCC	Lot Number:70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download: https://fiji.sc	Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Luer	Runze Fluid	RH-M016	Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope	Olympus
mouse collagen	Sigma	C7661
Oxygen plasma	Changzhou Hongming Instrument	HM-Plasma5L
Pasteur pipette	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
peristaltic pump	Kamoer	F01A-STP-B046
Petri dish	Corning	430167
PLC controller	Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory	BR010-11T8X2M	The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	Cat 1101
solenoid valve	SMC (China)	VQZ300
Syringe	Becton,Dickinson and Company	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	To penetrate cell membranes
Trizol	Invitrogen	10296010	Used for RNA extraction
trypsin	Sigma	15400054
vacuum filter	SMC (China)	ZFC5-6	Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump	Kamoer	KVP15-KL-S
vacuum regulator	AirTAC	GVR-200-06
Primers
Primer Name	Forward (5’ to 3’)	Reverse (5’ to 3’)
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA