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요약

여기에서는 인간 대동맥 벽에서 평활근 세포의 생체 내 생체 역학적 변형을 복제하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온 칩 모델을 개발했습니다.

초록

종래의 2차원 세포 배양 기술 및 동물 모델은 인간 흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)의 연구에 사용되어 왔다. 그러나, 인간 TAAD는 때때로 동물 모델에 의해 특성화될 수 없다. 임상 인간 연구와 동물 실험 사이에는 치료 약물의 발견을 방해 할 수있는 명백한 종 차이가 있습니다. 대조적으로, 종래의 세포 배양 모델은 생체 내 생체 역학적 자극을 시뮬레이션할 수 없다. 이를 위해 최근 몇 년 동안 미세 가공 및 미세 유체 기술이 크게 발전하여 생체 역학적 미세 환경을 복제하는 유기체 온 칩 모델을 구축하기위한 새로운 기술을 제공합니다. 이 연구에서는 TAAD에서 중요한 역할을 하는 인간 대동맥 평활근 세포(HASMC)가 경험하는 주기적 변형의 진폭 및 빈도를 포함하여 대동맥 생체역학의 병태생리학적 매개변수를 시뮬레이션하기 위해 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온어칩(HASMC-OOC) 모델을 개발했습니다. 이 모델에서 HASMC의 형태는 모양이 길어지고 변형 방향에 수직으로 정렬되었으며 정적 기존 조건보다 변형 조건에서 더 수축적인 표현형을 나타냅니다. 이것은 천연 인간 대동맥 벽의 세포 방향 및 표현형과 일치했습니다. 또한, 이첨판 대동맥판막 관련 TAAD(BAV-TAAD) 및 삼첨판 대동맥판막 관련 TAAD(TAV-TAAD) 환자 유래 1차 HASMC를 사용하여 TAAD에서 HASMC 특성을 복제하는 BAV-TAAD 및 TAV-TAAD 질환 모델을 구축했습니다. HASMC-OOC 모델은 TAAD의 발병기전을 추가로 탐구하고 치료 표적을 발견하기 위해 동물 모델을 보완하는 새로운 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.

서문

흉부 대동맥류 및 박리(TAAD)는 높은 이환율 및사망률과 관련된 대동맥벽의 국부적인 확장 또는 박리입니다1. 인간 대동맥 평활근 세포 (HASMC)는 TAAD의 발병 기전에 중요한 역할을합니다. HASMC는 말기 분화 세포가 아니며 HASMC는 높은 가소성을 유지하여 다른 자극에 반응하여 표현형을 전환 할 수 있습니다2. HASMC는 주로 생체 내에서 리드미컬한 인장 변형을 받으며, 이는 평활근 형태학적 변화, 분화 및 생리적 기능을 조절하는 핵심 요소 중 하나입니다3,4. 따라서 HASMC 연구에서 주기적 변형의 역할은 무시할 수 없습니다. 그러나 기존의 2D 세포 배양은 생체 내에서 HASMC가 경험하는 주기적 변형의 생체 역학적 자극을 복제할 수 없습니다. 또한, 동물 TAAD 모델의 구성은 이첨판 대동맥 판막 (BAV) 관련 TAAD와 같은 일부 유형의 TAAD에는 적합하지 않습니다. 또한 임상 인간 연구와 동물 실험 사이의 종 격차는 무시할 수 없습니다. 임상 실습에서 제약 번역을 방해합니다. 따라서, 대동맥 질환의 연구에서 생체 내 생체역학적 환경을 시뮬레이션하기 위한 보다 복잡하고 생리학적 시스템에 대한 절실한 요구가 존재한다.

생물 의학 연구 및 약물 개발에 사용되는 동물 실험은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 윤리적으로 의심 스럽습니다. 또한 동물 연구 결과는 인간 임상 시험 5,6에서 얻은 결과를 예측하지 못하는 경우가 많습니다. 인간 전임상 모델의 부족과 임상 시험의 높은 실패율로 인해 클리닉에 효과적인 약물이 거의 없어 의료 비용이 증가했습니다7. 따라서 동물 모델을 보완 할 다른 실험 모델을 찾는 것이 시급합니다. 미세 가공 및 미세 유체 기술은 최근 몇 년 동안 크게 발전하여 기존 2D 세포 배양 기술의 단점을 해결하고 생리 연구 및 약물 개발을 위한 보다 현실적이고 저렴하며 효율적인 체외 모델을 구축하는 오가노이드 온어칩 모델을 구축하기 위한 새로운 기술을 제공합니다. 미세 유체 장치를 사용하여 조직 또는 기관의 주요 기능을 복제하기 위해 다양한 자극을 가진 마이크로 미터 크기의 챔버에서 살아있는 세포를 배양하기 위해 장기 온 칩이 설정됩니다. 이 시스템은 단일 또는 다중 미세 유체 마이크로 채널로 구성되며, 관류 챔버에서 배양 된 한 종류의 세포가 한 조직 유형의 기능을 복제하거나 다공성 막에서 배양 된 다른 세포 유형을 사용하여 서로 다른 조직 간의 인터페이스를 재현합니다. 환자 유래 세포와 결합된 미세유체 기반 오가노이드는 마우스와 인간 질병 모델 간의 큰 종 차이를 해소하고 질병 메커니즘 연구 및 약물 발견을 위한 기존 2D 세포 배양의 단점을 극복하는 고유한 이점이 있습니다. 지난 몇 년 동안 미세 유체 공학의 급속한 발전으로 연구자들은 복잡한 생체 내 생물학적 매개 변수를 복제하는 시험관 내 장기 온 칩 (OOC) 모델의 유용성을 깨달았습니다8. 이러한 미세유체 오가노이드는 주기적 변형률, 전단 응력 및 액체 압력과 같은 체외 생체역학 환경을 시뮬레이션하여 3차원(3D) 세포 배양 환경을 제공합니다. 현재까지 폐9, 신장10, 간 11, 장 12 및 심장 13과 같은 기관에서 생체 역학적 자극을 시뮬레이션하기 위해 여러 OOC 모델이 확립되었지만 인간 대동맥 질환 연구에는 널리 적용되지 않았습니다.

이 연구에서는 TAAD 환자 유래 1차 HASMC에 적용되는 생체모방적 기계적 힘과 리듬을 제어할 수 있는 인간 대동맥 평활근 세포 장기 온어칩(HASMC-OOC) 모델을 제시합니다. 이 칩은 채널로 에칭 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 3 층 두꺼운 판과 2 개의 상용화 된 매우 유연한 PDMS 멤브레인으로 구성됩니다. HASMC는 PDMS 막에서 배양됩니다. 칩의 중간에 있는 채널은 세포 배양을 위한 배양 배지로 채워진다. 칩의 상단 및 하단 채널은 PDMS 멤브레인의 기계적 인장 변형의 리듬과 주파수를 제어 할 수있는 진공 압력 공급 시스템에 연결됩니다. HASMC가 경험하는 리드미컬한 변형은 HASMC-OOC에서 시뮬레이션할 수 있으며, 기존의 2D 배양 시스템으로는 기능적으로 달성할 수 없는 조직 또는 기관의 생체역학적 미세 환경을 복제할 수 있습니다. 고해상도, 실시간 이미징 및 생체 역학적 미세 환경의 장점으로 살아있는 세포의 생화학적, 유전 및 대사 활성을 조직 발달, 장기 생리학, 질병 병인학, 분자 메커니즘 및 바이오마커 식별, 심혈관 질환 및 대동맥 질환에 대해 연구할 수 있습니다. 조직 특이적 세포 및 환자 세포와 결합된 이 시스템은 약물 스크리닝, 개인화된 의학 및 독성 테스트에 사용할 수 있습니다. 이 HASMC-OOC 모델은 대동맥 질환의 발병기전을 연구하기 위한 새로운 시험관내 플랫폼을 제공한다.

프로토콜

인간 대동맥 검체는 중산 병원, 푸단대학교 윤리위원회(NO. B2020-158). 대동맥 표본은 푸단 대학교 중산 병원에서 상행 대동맥 수술을받은 환자로부터 수집되었습니다. 참여 전에 모든 환자로부터 서면 사전 동의를 얻었습니다.

1. 일차 인간 대동맥 평활근 세포 분리

  1. 상행 대동맥의 오른쪽 측면 부위를 멸균 PBS, 1x-2x로 씻으십시오.
  2. 두 개의 안과 겸자로 조직의 내막과 외막 층을 제거하고 배지 층을 유지하여 세포를 수확합니다.
  3. 미디어 층을 10cm 배양 접시에 놓고 가위로 작은 조각 (2-3mm)으로 자릅니다. 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 평활근 세포 배양액(SMCM) 5mL를 추가합니다.
  4. 멸균 점 적기로 작은 조직을 배양 병에 넣고 조직을 고르게 펴십시오. 배양 배지를 가능한 한 많이 버린 다음 병을 거꾸로 뒤집습니다.
  5. 거꾸로 된 배양 병에 2mL의 SMCM을 넣고 37 ° C의 인큐베이터 (5 % CO 2)에1-2 시간 동안 놓은 다음 천천히 오른쪽을 위로 돌리고 SMCM 2mL를 더 추가합니다.
  6. 5-7 일 배양 후 SMCM을 4mL의 신선한 SMCM으로 교환하십시오. 일반적으로 산발성 평활근 세포는 약 2주 후에 사라집니다.
  7. SMCM을 천천히 버리고 매체를 변경할 때 천천히 추가하십시오. 현미경 스테이션으로 이동할 때 배양 병을 천천히 운반하십시오. 그렇지 않으면 조직이 떠 다니고 세포가 천천히 자랍니다.
  8. 세포가 약 80% 컨플루언스에 도달하면 2mL의 PBS로 세척하고 2mL의 0.25% 트립신으로 분해한 다음 4mL의 신선한 SMCM이 있는 두 개의 새로운 배양 병으로 나눕니다.
  9. 평활근 세포에 대한 4가지 다른 특이적 마커(CNN1, SM22)14의 면역형광 분석을 통해 세포를 식별합니다.

2. PDMS 칩의 제조

  1. PDMS를 중합하려면 경화제 (B 성분)를베이스 (A 성분)에 A : B = 10 : 1 w / w의 중량비로 첨가하고 복합체를 5 분 동안 완전히 혼합하십시오. 볼륨은 연구의 필요성에 따라 다릅니다.
  2. 준비된 PDMS 겔을 진공 추출 탱크에 30-60 분 동안 넣고 압력을 -0.8 mPa 이하로 유지하십시오.
    알림: 높은 압력은 PDMS 젤 내부의 작은 기포의 추출이 불충분하여 칩 제조의 다음 단계에 영향을 미칩니다.
  3. CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 100mm × 40mm × 8mm 외부 프레임 구조와 70mm × 6mm × 4mm 채널로 금형을 설계합니다.
  4. 맞춤형은 고정밀 컴퓨터 수치 제어 조각 기계를 사용하여 3 층의 금형을 만듭니다. 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 플레이트를 사용하여 금형 프레임과 마이크로채널을 조각한 다음 다른 PMMA 플레이트에 붙입니다.
  5. 준비된 PDMS 젤을 100mm × 40mm × 6mm 외부 프레임 및 70mm × 6mm × 4mm 채널이 있는 몰드에 부은 다음 70°C에서 1-2시간 동안 가교결합합니다.
  6. 금형에서 가교 PDMS 슬래브를 떼어내고 상용화된 PDMS 멤브레인을 100mm × 40mm 섹션으로 절단합니다.
  7. PDMS 표면 활성화를 위해 3개의 준비된 PDMS 슬래브 및 2개의 PDMS 멤브레인을 산소 플라즈마로 5분 동안 처리합니다. 다음과 같은 특정 설정을 적용하십시오 : 공정 가스로서의 실내 공기; -100 kPa로 설정된 압력; 전류는 180--200 Ma로 설정됩니다. 200V로 설정된 전압; 처리 시간 5 분.
  8. 1mm 구멍 펀처를 사용하여 3개의 PDMS 슬래브에 구멍을 뚫어 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 입구와 출구를 만듭니다.
  9. 공기 채널 PDMS 슬래브 (최상층)-PDMS 멤브레인-중간 채널 PDMS 슬래브 (중간 층)-PDMS 멤브레인-공기 채널 PDMS 슬래브 (하단 층)의 순서로 3 개의 PDMS 슬래브와 2 개의 PDMS 멤브레인을 함께 결합합니다. 입체 현미경에서 4x로 이 단계를 수행하여 공기 마이크로채널을 중간 마이크로채널과 완전히 겹칩니다.
  10. 조립된 PDMS 칩을 70°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
  11. 내경 1mm와 길이 3cm의 라텍스 호스를 여러 개 준비하십시오. 준비된 호스의 한쪽 끝에 외경 1mm, 길이 1cm의 스테인리스 스틸 바늘을 삽입한 다음 호스의 다른 쪽 끝에 루어를 삽입하여 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널에 연결된 튜브를 만듭니다.
  12. 준비된 튜브를 PDMS 칩의 공기 및 중간 마이크로 채널의 배출구와 입구에 삽입합니다.

3. PDMS 칩 표면 처리 및 살균

  1. 2mL 주사기를 사용하여 PDMS 칩의 배지 마이크로채널에 80mg/mL 마우스 콜라겐 2mL를 주입하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 배양 후 채널에서 콜라겐을 제거하고 2mL 주사기로 다시 수집합니다. 콜라겐 코팅된 PDMS 칩을 60°C 인큐베이터에 밤새 넣는다.
  3. PDMS 칩을 UV 멸균기에 1시간 이상 넣습니다. 세포 실험을 준비하기 위해 멸균된 PDMS 칩을 울트라클린 벤치에 놓습니다.

4. PDMS 칩의 세포 파종 및 세포 연신 과정

  1. 37°C의 5%CO2 인큐베이터에서 2% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 평활근 세포 배지(SMCM)를 사용하여 환자로부터 배양 4 x 105차 인간 평활근 세포(HASMC)를 배양한다.
  2. HASMC 밀도가 80%에 도달하면 SMCM을 버리고 2mL의 PBS로 세포를 세척합니다.
  3. 0.25% 트립신 1mL를 사용하여 세포를 2분 동안 분해하고 100 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 새로운 SMCM에 재현탁시킨다. 8mL의 SMCM을 사용하여 10cm 배양 접시에서 세포를 배양합니다.
  4. 세포분석기를 사용하여 세포 수를 계산하고 2 x 105 cells/mL의 최종 농도에서 세포를 사용합니다.
  5. 콜라겐 코팅 및 멸균된 PDMS 칩 배지 마이크로채널에 2mL의 PBS를 천천히 붓고 나중에 2mL 주사기를 사용하여 버립니다.
  6. 총 2mL의 2 x 105 cells/mL HASMC 현탁액을 2mL 주사기를 사용하여 PDMS 칩의 배지 마이크로채널에 천천히 붓습니다. 그런 다음 PDMS 칩의 입구와 출구에서 Luer를 닫습니다. PDMS 칩을 37°C의 인큐베이터(5%CO2)에 1일 동안 넣는다.
  7. 셀이 PDMS 칩의 PDMS 멤브레인에 부착된 후 거의 24시간 후에 PDMS 칩의 공기 마이크로 채널 출구를 진공 컨트롤러 시스템에 연결합니다. 세포가 부착되면 부유 된 둥근 세포와 대조적으로 현미경으로 길고 정상적인 세포 형태를 볼 수 있습니다.
  8. 솔레노이드 밸브와 진공 펌프를 켭니다. 진공 조절기를 열고 압력 수준을 7.18 ± 0.44% 변형률의 경우 10kPa로, 17.28% ± 0.91% 변형률의 경우 15kPa로 조정합니다.
  9. 제어 시스템의 매개 변수가 설정된 후 PDMS 칩을 37 ° C의 인큐베이터 (5 % CO2)에 넣고 24 시간 동안 늘립니다.

5. 기계 제어 시스템의 준비

  1. 여러 솔레노이드 밸브, 진공 필터, 진공 조절기, 진공 펌프, 연동 펌프 및 솔레노이드 밸브를 제어하는 프로그래밍 가능한 로직 컨트롤러 (PLC)를 준비하십시오.
  2. PLC 컨트롤러를 프로그래밍하고 켜기/끄기 시간 간격을 1Hz로 설정합니다. 솔레노이드 밸브를 프로그래밍된 컨트롤러에 연결합니다.
  3. 진공 펌프의 입구를 진공 필터에 연결 한 다음 진공 필터의 출구를 진공 조절기에 연결합니다. 진공 조절기의 출구를 솔레노이드 밸브에 연결하고 마지막으로 솔레노이드 밸브의 출구를 PDMS 칩의 공기 마이크로 채널 출구에 연결합니다.
  4. 배양 배지 교체 및 약물 취급을 위해 연동 펌프의 출구를 PDMS 칩의 배지 마이크로 채널 입구에 연결하고 연동 펌프의 입구를 배지 마이크로 채널 PDMS 칩의 출구에 연결합니다.
  5. 레귤레이터에 의한 변형률의 진폭과 마이크로 컨트롤러에 의한 변형률 주파수를 조정합니다.

결과

HASMC-OOC 모델은 진공 제어 시스템, 순환 시스템 및 PDMS 칩과 HASMC-OOC 모델의 회로도 설계로 구성됩니다(그림 1). 진공 제어 시스템은 진공 펌프, 솔레노이드 밸브 및 PLC 컨트롤러로 구성됩니다. 순환 시스템으로 작용하기 위해 연동 펌프를 사용하여 세포 배양 배지를 새로 고치고 약물을 추가했습니다. PDMS 칩은 2개의 진공 챔버와 세포 성장을 위한 SMCM으로 채워진 중간 챔버로 ?...

토론

미세유체 기술의 급속한 발전과 함께, 시험관내에서 하나 이상의 기관의 생물학적 기능 및 구조를 복제할 수 있는 OOC 모델이 최근 몇 년 동안 생물학, 의학 및 약리학15에 응용하기 위해 등장했습니다. OOC는 질병 메커니즘을 탐구하고 전임상 약물 번역 8,16을 촉진하는 데 필수적인 인간 생리적 미세 환경의 주요 기능을 시뮬레이?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는이 작업이 상하이시 과학 기술위원회 (20ZR1411700), 중국 국립 자연 과학 재단 (81771971) 및 상하이 항해 프로그램 (22YF1406600)의 보조금으로 지원되었음을 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4% paraformaldehydeBeyotimeP0099-100mlUsed for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotimeA0408Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albuminBeyotimeST025-20g
Calcium AM/PIInvitrogenL3224
Cell culture flask Corning430639
CNN1Abcam Ab46794
Commercial flexible
PDMS membrane		Hangzhou Bald Advanced MaterialsKYQ-200
F-actinInvitrogenR415
FBSSigmaM8318
HosesRunze Fluid964101 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth
muscle cell line CRL1999		ATCCLot Number:70019189
Image JImagej.net/fiji/downloadsFree Download: https://fiji.scImaging platform that is used to identify fluorescence intensity
IncubatorThermo Fisher ScientificEnsures that the temperature,
humidity, and light exposure is
exactly the same throughout
experiment.
LuerRunze FluidRH-M016Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
MicroscopeOlympus
mouse collagenSigmaC7661
Oxygen plasma Changzhou Hongming InstrumentHM-Plasma5L
Pasteur pipetteBiologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntibiodics used to prevent bacterial
contamination of cells during culture.
peristaltic pumpKamoerF01A-STP-B046
Petri dishCorning430167
PLC controllerZhejiang Jun Teng (BenT) CNC factoryBR010-11T8X2MThe detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
SM22Abcam ab14106
SMCMScienCellCat 1101
solenoid valveSMC (China)VQZ300
SyringeBecton,Dickinson and Company300841
Triton-X 100BeyotimeST795To penetrate cell membranes
TrizolInvitrogen10296010Used for RNA extraction
trypsinSigma15400054
vacuum filterSMC (China)ZFC5-6Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pumpKamoerKVP15-KL-S
vacuum regulatorAirTACGVR-200-06
Primers
Primer NameForward (5’ to 3’)Reverse (5’ to 3’)
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA

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