בניית מודל של איבר-על-שבב של תא שריר חלק של אבי העורקים לשחזור זן ביומכני בדופן אבי העורקים

Summary

כאן פיתחנו מודל של איבר על-שבב של תאי שריר חלקים באבי העורקים כדי לשכפל את הזן הביומכני in vivo של תאי שריר חלקים בדופן אבי העורקים האנושי.

Abstract

טכניקות קונבנציונליות של תרביות תאים דו-ממדיות ומודלים של בעלי חיים שימשו במחקר של מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי האנושי (TAAD). עם זאת, TAAD אנושי לפעמים לא יכול להיות מאופיין על ידי מודלים של בעלי חיים. קיים פער מינים לכאורה בין מחקרים קליניים בבני אדם לבין ניסויים בבעלי חיים שעשויים לעכב גילוי של תרופות טיפוליות. לעומת זאת, מודל תרבית התאים הקונבנציונלי אינו מסוגל לדמות גירויים ביומכניים in vivo . לשם כך, טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המשכפלים את המיקרו-סביבה הביומכנית. במחקר זה פותח מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים (HASMC-OOC) כדי לדמות את הפרמטרים הפתופיזיולוגיים של ביומכניקה של אבי העורקים, כולל המשרעת והתדירות של מאמץ מחזורי שחווים תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) הממלאים תפקיד חיוני ב-TAAD. במודל זה, המורפולוגיה של HASMCs התארכה בצורתה, התיישרה בניצב לכיוון המתח, והציגה פנוטיפ מתכווץ יותר בתנאי מאמץ מאשר בתנאים קונבנציונליים סטטיים. זה עלה בקנה אחד עם כיוון התא והפנוטיפ בדפנות אבי העורקים האנושי המקומי. בנוסף, תוך שימוש ב-TAAD (BAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים ו-TAAD (TAV-TAAD) הקשור למסתם אבי העורקים טריקוספיד שמקורו בחולי HASMCs, הקמנו מודלים של מחלות BAV-TAAD ו-TAV-TAAD, המשכפלים את מאפייני HASMC ב-TAAD. מודל HASMC-OOC מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה המשלימה מודלים של בעלי חיים להמשך חקר הפתוגנזה של TAAD וגילוי מטרות טיפוליות.

Introduction

מפרצת ודיסקציה של אבי העורקים החזי (TAAD) היא הרחבה מקומית או דלמינציה של דופן אבי העורקים הקשורה לתחלואה גבוהה ותמותה¹. תאי שריר חלק באבי העורקים האנושי (HASMCs) ממלאים תפקיד חיוני בפתוגנזה של TAAD. HASMCs אינם תאים ממוינים באופן סופני, ו- HASMCs שומרים על פלסטיות גבוהה, מה שמאפשר להם להחליף פנוטיפים בתגובה לגירויים שונים². HASMCs נתונים בעיקר למתח מתיחה קצבי in vivo, וזהו אחד הגורמים המרכזיים המווסתים שינויים מורפולוגיים בשרירים חלקים, התמיינות ותפקודים פיזיולוגיים ^3,4. לכן, לא ניתן להתעלם מתפקידו של זן מחזורי בחקר ה- HASMCs. עם זאת, תרביות תאים דו-ממדיות קונבנציונליות אינן יכולות לשכפל את הגירוי הביומכני של זן מחזורי שחווים HASMCs in vivo. בנוסף, בניית מודל TAAD של בעלי חיים אינה מתאימה לסוגים מסוימים של TAAD, כגון TAAD הקשור לשסתום אבי העורקים הביקוספיד (BAV). יתר על כן, לא ניתן להתעלם מהפער בין מחקרים קליניים בבני אדם לניסויים בבעלי חיים. זה מעכב את התרגום הפרמצבטי בפרקטיקה הקלינית. לפיכך, יש צורך דחוף במערכות מורכבות ופיזיולוגיות יותר כדי לדמות את הסביבה הביומכנית in vivo במחקר של מחלות אבי העורקים.

ניסויים בבעלי חיים המשמשים במחקר ביו-רפואי ובפיתוח תרופות הם יקרים, גוזלים זמן ומוטלים בספק מבחינה אתית. בנוסף, התוצאות ממחקרים בבעלי חיים לעתים קרובות אינן מצליחות לחזות את התוצאות המתקבלות בניסויים קליניים בבני אדם ^5,6. היעדר מודלים פרה-קליניים אנושיים ושיעור הכישלון הגבוה בניסויים קליניים הביאו למעט תרופות יעילות למרפאה, מה שהגדיל את עלויות הטיפול הרפואי⁷. לכן, דחוף למצוא מודלים ניסיוניים אחרים כדי להשלים מודלים של בעלי חיים. טכניקות מיקרו-פבריקציה ומיקרופלואידיות התפתחו מאוד בשנים האחרונות, ומספקות טכניקות חדשניות לביסוס מודלים של אורגנואידים על שבב המתקן את החסרונות של טכניקות מסורתיות של תרביות תאים דו-ממדיות ומבססים מודל in-vitro מציאותי יותר, בעלות נמוכה ויעילה יותר למחקרים פיזיולוגיים ופיתוח תרופות. באמצעות התקנים מיקרופלואידיים, איברים על שבבים נוצרים כדי לתרבת תאים חיים בתאים בגודל מיקרומטר עם גירויים שונים כדי לשכפל את הפונקציות העיקריות של רקמה או איבר. המערכת מורכבת ממיקרו-תעלות מיקרופלואידיות בודדות או מרובות, כאשר סוג אחד של תאים מתרבית בתא משוכפל פונקציות מסוג רקמה אחד או סוגי תאים שונים בתרבית על ממברנות נקבוביות כדי ליצור מחדש ממשקים בין רקמות שונות. לאורגנואידים מבוססי מיקרופלואידיקה בשילוב עם תאים שמקורם בחולה יש יתרון ייחודי של גישור על ההבדלים בין המינים הגדולים בין מודלים של מחלות עכברים ובני אדם והתגברות על החסרונות של תרבית תאים דו-ממדית מסורתית לצורך מחקר מנגנוני מחלה וגילוי תרופות. עם ההתפתחות המהירה של מיקרופלואידיקה בשנים האחרונות, חוקרים הבינו את התועלת של מודלים של איבר על שבב (OOC) במבחנה המשכפלים פרמטרים ביולוגיים מורכבים in vivo ⁸. אורגנואידים מיקרופלואידיים אלה מדמים סביבות ביומכניות במבחנה, כגון מתח מחזורי, עקת גזירה ולחץ נוזלי, ומספקים סביבת תרבית תאים תלת-ממדית (3D). עד כה, מספר מודלים OOC הוקמו כדי לדמות גירויים ביומכניים באיברים כגון הריאה⁹, כליה 10, כבד¹¹, המעי 12, ולב ¹³, אבל אלה לא יושמו באופן נרחב על המחקר של מחלת אבי העורקים האנושי.

במחקר זה, אנו מציגים מודל של איבר-על-שבב של תאי שריר חלקים של אבי העורקים האנושי (HASMC-OOC) שיכול לשלוט בכוחות ובמקצבים המכניים הביומימטיים המופעלים על HASMCs ראשוניים שמקורם ב-TAAD. השבב מורכב מלוחות עבים תלת-שכבתיים של פולידימתילסילוקסן (PDMS) החרוטים בתעלות ושני ממברנות PDMS ממוסחרות וגמישות במיוחד. HASMCs מתורבתים על ממברנות PDMS. הערוץ במרכז השבב מלא במדיום תרבית לתרבית תאים. הערוצים העליונים והתחתונים של השבב מחוברים למערכת אספקת לחץ ואקום שיכולה לשלוט בקצב ובתדירות של מתח מתיחה מכני של ממברנות PDMS. ניתן לדמות זן קצבי שחווים HASMCs ב-HASMC-OOC, תוך שכפול המיקרו-סביבה הביומכנית של רקמה או איבר שאינם ניתנים להשגה פונקציונלית עם מערכות תרבית דו-ממדיות קונבנציונליות. עם היתרון של הדמיה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה ומיקרו-סביבה ביומכנית, ניתן לחקור את הפעילויות הביוכימיות, הגנטיות והמטבוליות של תאים חיים להתפתחות רקמות, פיזיולוגיה של איברים, אטיולוגיה של מחלות, מנגנונים מולקולריים וזיהוי סמנים ביולוגיים, מחלות לב וכלי דם ומחלות אבי העורקים. בשילוב עם תאים ספציפיים לרקמות ולמטופלים, מערכת זו יכולה לשמש לבדיקת תרופות, רפואה מותאמת אישית ובדיקות רעילות. מודל HASMC-OOC זה מספק פלטפורמה חדשנית במבחנה לחקר הפתוגנזה של מחלת אבי העורקים.

Protocol

דגימות אבי העורקים האנושיות נוצלו לבידוד ראשוני של HASMC באישור בית החולים ז'ונגשאן, ועדת האתיקה של אוניברסיטת פודאן (NO. B2020-158). דגימות אבי העורקים נאספו מחולים שעברו ניתוח אבי העורקים בבית החולים ז'ונגשאן, אוניברסיטת פודאן. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות.

1. בידוד תאי שריר חלק אבי העורקים האנושי העיקרי

1. לשטוף את האזור הצדדי הימני של אבי העורקים העולה עם PBS סטרילי, 1x-2x.
2. הסר את שכבות האינטימה והאדוונטיטיה של הרקמה עם שני מלקחיים אופתלמיים ולשמור על שכבת המדיה כדי לקצור את התאים.
3. מניחים את שכבת המדיה על צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ וחותכים אותה לחתיכות קטנות (2-3 מ"מ) בעזרת מספריים. הוסף 5 מ"ל של תרבית תאי שריר חלק (SMCM) המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
4. מעבירים את הרקמה הקטנה לבקבוק התרבית עם טפטפת סטרילית, ומפזרים את הרקמה באופן שווה. השליכו את מדיום התרבית ככל האפשר, ואז הפכו את הבקבוק הפוך.
5. הוסיפו 2 מ"ל של SMCM לבקבוק התרבית ההפוך והכניסו אותו לחממה (5% CO 2) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות, ואז סובבו אותו באיטיות לצד ימין למעלה והוסיפו עוד₂ מ"ל של SMCM.
6. לאחר 5-7 ימים של דגירה, להחליף את SMCM עם 4 מ"ל של SMCM טרי. באופן כללי, תאי שריר חלקים ספורדיים מטפסים החוצה תוך כשבועיים.
7. השליכו באיטיות את ה-SMCM והוסיפו אותו באיטיות בעת החלפת המדיום. להעביר את בקבוק התרבית באיטיות בעת מעבר לתחנת מיקרוסקופ; אחרת, הרקמות יצופו, והתאים יגדלו לאט.
8. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, יש לשטוף עם 2 מ"ל של PBS, לעכל עם 2 מ"ל של 0.25% טריפסין, ולחלק אותם לשני בקבוקי תרבית חדשים עם 4 מ"ל של SMCM טרי.
9. זהה את התאים באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי של ארבעה סמנים ספציפיים שונים לתאי שריר חלק (CNN1, SM22)¹⁴.

2. הכנת שבב PDMS

1. כדי להתפלמר PDMS, הוסף חומר ריפוי (רכיב B) לבסיס (רכיב A) ביחס משקל של A: B = 10:1 w/w וערבב את הקומפלקס לחלוטין במשך 5 דקות; הנפח תלוי בצורך של המחקר.
2. מניחים את ג'ל PDMS המוכן במיכל מיצוי ואקום למשך 30-60 דקות ושומרים על הלחץ מתחת ל-0.8 mPa.
   הערה: לחץ גבוה יוביל למיצוי לא מספיק של בועות קטנות בתוך ג'ל PDMS שישפיע על השלב הבא של ייצור השבבים.
3. באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD), תכנן את התבנית עם מבנה מסגרת חיצונית של 100 מ"מ × 40 מ"מ × 8 מ"מ ותעלה של 70 מ"מ × 6 מ"מ × 4 מ"מ.
4. הכינו בהתאמה אישית את התבניות של שלוש השכבות באמצעות מכונת חריטה ממוחשבת בעלת בקרה נומרית ברמת דיוק גבוהה. גלפו את מסגרת התבניות והמיקרו-ערוצים באמצעות לוחות פולימתיל מתקרילט (PMMA), ולאחר מכן הדביקו אותם על צלחת PMMA אחרת.
5. יוצקים את ג'ל PDMS מוכן על תבנית עם 100 מ"מ × 40 מ"מ × מסגרת חיצונית 6 מ"מ ו 70 מ"מ × 6 מ"מ × ערוץ 4 מ"מ, ולאחר מכן להצליב ב 70 °C במשך 1-2 שעות.
6. יש לקלף את לוחות ה-PDMS הצולבים מהתבנית ולחתוך את ממברנות ה-PDMS הממוסחרות למקטעים של 100 מ"מ × 40 מ"מ.
7. טפלו בשלושת לוחות ה-PDMS שהוכנו ובשני ממברנות PDMS באמצעות פלזמת חמצן למשך 5 דקות להפעלת פני השטח של PDMS. החל את ההגדרות הספציפיות הבאות: אוויר החדר כגז התהליך; לחץ מוגדר ל -100 kPa; הנוכחי מוגדר ל 180--200 Ma; מתח מוגדר ל 200 V; זמן תהליך עד 5 דקות.
8. נקב חורים בשלושת לוחות PDMS באמצעות מנקב חורים בקוטר 1 מ"מ כדי ליצור את הכניסה והיציאה של האוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים בשבב PDMS.
9. חברו שלושה לוחות PDMS ושני ממברנות PDMS יחד לפי הסדר: לוח PDMS של ערוץ אוויר (שכבה עליונה) - קרום PDMS - לוח PDMS של ערוץ בינוני (שכבה אמצעית) - ממברנת PDMS - לוח PDMS של ערוץ אוויר (שכבה תחתונה). בצע שלב זה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ב-4x כדי לחפוף באופן מלא את המיקרו-ערוצים של האוויר עם המיקרו-ערוצים הבינוניים.
10. מניחים את שבב PDMS המורכב באינקובטור של 70 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
11. הכינו מספר צינורות לטקס בקוטר פנימי של 1 מ"מ ובאורך 3 ס"מ. הכנס מחט נירוסטה בקוטר חיצוני של 1 מ"מ ובאורך 1 ס"מ לקצה אחד של הצינור המוכן, ולאחר מכן הכנס Luer לקצה השני של הצינור כדי ליצור את הצינור המחובר לאוויר ולמיקרו-ערוצים בינוניים של שבב PDMS.
12. הכנס את הצינורות המוכנים לתוך שקעים וכניסות של האוויר ומיקרו-ערוצים בינוניים על שבב PDMS.

3. טיפול משטח שבב PDMS ועיקור

1. יש להחדיר 2 מ"ל של קולגן עכברי 80 מ"ג/מ"ל למיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS באמצעות מזרק של 2 מ"ל ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2. לאחר הדגירה, להסיר את הקולגן מן הערוץ להיזכר עם מזרק 2 מ"ל. הניחו את שבבי ה-PDMS המצופים בקולגן באינקובטור של 60°C למשך הלילה.
3. הניחו את שבבי ה-PDMS במעקר UV למשך יותר משעה. הניחו את שבבי ה-PDMS המעוקרים על ספסל אולטרה-נקי כהכנה לניסוי בתא.

4. זריעת תאים על שבב PDMS ותהליך מתיחת תאים

1. תרבית 4 x 10 5 תאי שריר חלק אנושיים ראשוניים (HASMCs) מחולים המשתמשים במדיום תאי שריר חלק (SMCM) המכילים 2% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור⁵ % CO₂ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. כאשר צפיפות HASMC מגיע 80%, להשליך את SMCM ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS.
3. לעכל את התאים באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין במשך 2 דקות צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו להשעות את גלולת התא ב 1 מ"ל של SMCM טרי. השתמש ב-8 מ"ל של SMCM כדי לתרבת את התאים על צלחת תרבית בגודל 10 ס"מ.
4. חשב את מספר התא באמצעות ציטומטר והשתמש בתאים בריכוז סופי של 2 x 10^{5 תאים} למ"ל.
5. יש לשפוך באיטיות 2 מ"ל של PBS לתוך שבב PDMS בינוני מצופה קולגן ומעוקר, ולאחר מכן להשליך באמצעות מזרק של 2 מ"ל.
6. יש לשפוך באיטיות סך של 2 מ"ל של 2 x 10^{5 תאים} / מ"ל HASMC ההשעיה לתוך המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS באמצעות מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, סגור את Luer בכניסה ויציאה של שבב PDMS. מניחים את שבב PDMS באינקובטור (5% CO₂) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד.
7. לאחר שהתאים מחוברים לממברנת PDMS בשבב PDMS, כמעט לאחר 24 שעות, חבר את יציאת המיקרו-ערוץ האוויר בשבב PDMS למערכת בקר הוואקום. כאשר התא מחובר, ניתן לראות מתחת למיקרוסקופ צורה תאית מוארכת ונורמלית, בניגוד לתאים העגולים המרחפים.
8. הפעל את שסתום הסולנואיד ואת משאבת הוואקום. פתחו את וסת הוואקום והתאימו את רמת הלחץ ל-10 kPa עבור זן של 7.18 ± 0.44% ו-15 kPa עבור זן של 17.28 ± 0.91%.
9. לאחר הגדרת הפרמטרים של מערכת הבקרה, מניחים את שבבי PDMS באינקובטור (5% CO₂) ב 37 °C ומותחים במשך 24 שעות.

5. הכנת מערכת הבקרה המכנית

1. הכן מספר שסתומי סולנואיד, מסנני ואקום, וסתי ואקום, משאבת ואקום, משאבה פריסטלטית ובקר לוגי ניתן לתכנות (PLC) השולט בשסתום הסולנואיד.
2. תכנת את בקר ה- PLC והגדר את מרווח זמן ההפעלה/כיבוי ל- 1 Hz. חבר את שסתומי הסולנואיד לבקר המתוכנת.
3. חבר את כניסת משאבת הוואקום למסנני הוואקום ולאחר מכן חבר את השקע של מסנני הוואקום לווסתי הוואקום. חבר את השקע של וסתי הוואקום לשסתומי סולנואיד, ולבסוף, חבר את השקע של שסתומי הסולנואיד לשקעים של מיקרו-ערוצי האוויר של שבבי PDMS.
4. חבר את היציאה של המשאבה הפריסטלטית לכניסה של המיקרו-ערוץ הבינוני של שבב PDMS ואת הכניסה של המשאבה הפריסטלטית לשקע של שבב PDMS מיקרו-ערוצי בינוני להחלפת תרבית בינונית וטיפול בתרופות.
5. התאם את המשרעת של המתח על ידי הרגולטור ואת תדר המתח על ידי המיקרו-בקר.

תוצאות

מודל HASMC-OOC מורכב ממערכת בקרת ואקום, מערכת מחזור ושבבי PDMS, והתכנון הסכמטי של מודל HASMC-OOC (איור 1). מערכת בקרת הוואקום מורכבת ממשאבת ואקום, שסתומי סולנואיד ובקר PLC. כדי לפעול כמערכת המחזור, נעשה שימוש במשאבה פריסטלטית כדי לרענן את מדיום תרבית התאים ולהוסיף תרופות. שבב ה-PDMS הורכב מ...

Discussion

עם ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה מיקרופלואידית, מודלים של OOC שיכולים לשכפל את התפקוד הביולוגי והמבנה של איבר אחד או יותר במבחנה התפתחו בשנים האחרונות ליישומים בביולוגיה, רפואה ופרמקולוגיה¹⁵. OOC יכול לדמות תפקודים מרכזיים של המיקרו-סביבה הפיזיולוגית האנושית, החיוניים לחקר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0099-100ml	Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0408	Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025-20g
Calcium AM/PI	Invitrogen	L3224
Cell culture flask	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
Commercial flexible PDMS membrane	Hangzhou Bald Advanced Materials	KYQ-200
F-actin	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
Hoses	Runze Fluid	96410	1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth muscle cell line CRL1999	ATCC	Lot Number:70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download: https://fiji.sc	Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Luer	Runze Fluid	RH-M016	Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope	Olympus
mouse collagen	Sigma	C7661
Oxygen plasma	Changzhou Hongming Instrument	HM-Plasma5L
Pasteur pipette	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
peristaltic pump	Kamoer	F01A-STP-B046
Petri dish	Corning	430167
PLC controller	Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory	BR010-11T8X2M	The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	Cat 1101
solenoid valve	SMC (China)	VQZ300
Syringe	Becton,Dickinson and Company	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	To penetrate cell membranes
Trizol	Invitrogen	10296010	Used for RNA extraction
trypsin	Sigma	15400054
vacuum filter	SMC (China)	ZFC5-6	Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump	Kamoer	KVP15-KL-S
vacuum regulator	AirTAC	GVR-200-06
Primers
Primer Name	Forward (5’ to 3’)	Reverse (5’ to 3’)
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA