Costruzione di un modello organ-on-a-chip di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per ricapitolare la tensione biomeccanica nella parete aortica

Riepilogo

Qui, abbiamo sviluppato un modello organ-on-a-chip di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per replicare il ceppo biomeccanico in vivo delle cellule muscolari lisce nella parete aortica umana.

Abstract

Tecniche convenzionali di coltura cellulare bidimensionale e modelli animali sono stati utilizzati nello studio dell'aneurisma e della dissezione dell'aorta toracica umana (TAAD). Tuttavia, il TAAD umano a volte non può essere caratterizzato da modelli animali. C'è un apparente divario di specie tra gli studi clinici sull'uomo e gli esperimenti sugli animali che può ostacolare la scoperta di farmaci terapeutici. Al contrario, il modello di coltura cellulare convenzionale non è in grado di simulare stimoli biomeccanici in vivo . A tal fine, le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che replicano il microambiente biomeccanico. In questo studio, è stato sviluppato un modello di organ-on-a-chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell'aorta umana per simulare i parametri fisiopatologici della biomeccanica aortica, compresa l'ampiezza e la frequenza della tensione ciclica sperimentata dalle cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) che svolgono un ruolo vitale nella TAAD. In questo modello, la morfologia degli HASMC è diventata di forma allungata, allineata perpendicolarmente alla direzione della deformazione e ha presentato un fenotipo più contrattile in condizioni di deformazione rispetto alle condizioni convenzionali statiche. Ciò era coerente con l'orientamento e il fenotipo cellulare nelle pareti aortiche umane native. Inoltre, utilizzando TAAD (BAV-TAAD) correlati alla valvola aortica bicuspide e HASMC primari derivati dal paziente TAAD (TAV-TAAD) correlati alla valvola aortica tricuspide, abbiamo stabilito modelli di malattia BAV-TAAD e TAV-TAAD, che replicano le caratteristiche HASMC in TAAD. Il modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro complementare ai modelli animali per esplorare ulteriormente la patogenesi della TAAD e scoprire bersagli terapeutici.

Introduzione

L'aneurisma e la dissezione dell'aorta toracica (TAAD) sono una dilatazione localizzata o delaminazione della parete aortica associata ad elevata morbilità e mortalità¹. Le cellule muscolari lisce aortiche umane (HASMC) svolgono un ruolo vitale nella patogenesi della TAAD. Gli HASMC non sono cellule differenziate terminalmente e gli HASMC mantengono un'elevata plasticità, consentendo loro di cambiare fenotipo in risposta a stimoli diversi². Gli HASMC sono principalmente sottoposti a tensione ritmica di trazione in vivo, e questo è uno dei fattori chiave che regolano i cambiamenti morfologici della muscolatura liscia, la differenziazione e le funzioni fisiologiche ^3,4. Pertanto, il ruolo della deformazione ciclica nello studio degli HASMC non può essere ignorato. Tuttavia, le colture cellulari 2D convenzionali non possono replicare la stimolazione biomeccanica del ceppo ciclico sperimentato dagli HASMC in vivo. Inoltre, la costruzione di un modello TAAD animale non è adatta per alcuni tipi di TAAD, come il TAAD correlato alla valvola aortica bicuspide (BAV). Inoltre, il divario di specie tra studi clinici sull'uomo e esperimenti sugli animali non può essere ignorato. Ostacola la traduzione farmaceutica nella pratica clinica. Pertanto, vi è un urgente bisogno di sistemi più complessi e fisiologici per simulare l'ambiente biomeccanico in vivo nella ricerca delle malattie aortiche.

Gli esperimenti sugli animali utilizzati nella ricerca biomedica e nello sviluppo di farmaci sono costosi, dispendiosi in termini di tempo ed eticamente discutibili. Inoltre, i risultati degli studi sugli animali spesso non riescono a prevedere i risultati ottenuti nelle sperimentazioni cliniche sull'uomo ^5,6. La mancanza di modelli preclinici umani e l'alto tasso di fallimento negli studi clinici hanno portato a pochi farmaci efficaci per la clinica, il che ha aumentato i costi dell'assistenza sanitaria⁷. Pertanto, è urgente trovare altri modelli sperimentali per integrare i modelli animali. Le tecniche di microfabbricazione e microfluidica si sono sviluppate notevolmente negli ultimi anni, fornendo nuove tecniche per stabilire modelli organoidi-on-a-chip che rimediano agli inconvenienti delle tradizionali tecniche di coltura cellulare 2D e stabiliscono un modello in vitro più realistico, a basso costo ed efficiente per studi fisiologici e sviluppo di farmaci. Utilizzando dispositivi microfluidici, gli organi su chip vengono stabiliti per coltivare cellule viventi in camere di dimensioni micrometriche con stimoli diversi per replicare le funzioni chiave di un tessuto o organo. Il sistema è costituito da microcanali microfluidici singoli o multipli, con un tipo di cellula coltivata in una camera perfusa che replica le funzioni di un tipo di tessuto o diversi tipi di cellule coltivate su membrane porose per ricreare interfacce tra diversi tessuti. Gli organoidi a base microfluidica combinati con cellule derivate dal paziente hanno il vantaggio unico di colmare la grande differenza di specie tra modelli di malattie muniche e umane e superare gli svantaggi della tradizionale coltura cellulare 2D per la ricerca sui meccanismi della malattia e la scoperta di farmaci. Con il rapido sviluppo della microfluidica negli ultimi anni, i ricercatori hanno compreso l'utilità di modelli in vitro organ-on-a-chip (OOC) che replicano complessi parametri biologici in vivo ⁸. Questi organoidi microfluidici simulano ambienti biomeccanici in vitro, come la deformazione ciclica, lo sforzo di taglio e la pressione del liquido, fornendo un ambiente di coltura cellulare tridimensionale (3D). Ad oggi, sono stati stabiliti diversi modelli OOC per simulare stimoli biomeccanici in organi come il polmone⁹, il rene 10, il fegato¹¹, l'intestino 12 e il cuore ^13, ma questi non sono stati ampiamente applicati allo studio della malattia dell'aorta umana.

In questo studio, presentiamo un modello di organo su chip (HASMC-OOC) di cellule muscolari lisce dell'aorta umana in grado di controllare le forze e i ritmi meccanici biomimetici applicati agli HASMC primari derivati dal paziente TAAD. Il chip è costituito da piastre spesse a tre strati di polidimetilsilossano (PDMS) incise con canali e due membrane PDMS altamente flessibili commercializzate. Gli HASMC sono coltivati sulle membrane PDMS. Il canale al centro del chip è riempito con un terreno di coltura per la coltura cellulare. I canali superiore e inferiore del chip sono collegati a un sistema di alimentazione a pressione del vuoto in grado di controllare il ritmo e la frequenza della deformazione meccanica di trazione delle membrane PDMS. La deformazione ritmica sperimentata dagli HASMC può essere simulata in HASMC-OOC, replicando il microambiente biomeccanico di tessuti o organi non funzionalmente realizzabili con i sistemi di coltura 2D convenzionali. Con il vantaggio dell'imaging ad alta risoluzione e in tempo reale e del microambiente biomeccanico, le attività biochimiche, genetiche e metaboliche delle cellule viventi possono essere studiate per lo sviluppo dei tessuti, la fisiologia degli organi, l'eziologia della malattia, i meccanismi molecolari e l'identificazione dei biomarcatori, le malattie cardiovascolari e le malattie aortiche. In combinazione con cellule tessuto-specifiche e pazienti, questo sistema può essere utilizzato per lo screening farmacologico, la medicina personalizzata e i test di tossicità. Questo modello HASMC-OOC fornisce una nuova piattaforma in vitro per lo studio della patogenesi della malattia aortica.

Protocollo

Campioni di aorta umana sono stati utilizzati per l'isolamento primario di HASMC sotto l'approvazione dell'ospedale Zhongshan, del comitato etico dell'Università di Fudan (NO. B2020-158). Sono stati raccolti campioni aortici da pazienti sottoposti a chirurgia dell'aorta ascendente presso l'ospedale Zhongshan, Università di Fudan. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti prima della partecipazione.

1. Isolamento primario delle cellule muscolari lisce aortiche umane

1. Lavare la regione laterale destra dell'aorta ascendente con PBS sterile, 1x-2x.
2. Rimuovere gli strati intimi e avventizi del tessuto con due pinze oftalmiche e mantenere lo strato di media per raccogliere le cellule.
3. Posizionare lo strato di supporto su un piatto di coltura di 10 cm e tagliarlo a pezzetti (2-3 mm) con le forbici. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura per cellule muscolari lisce (SMCM) contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
4. Spostare il piccolo tessuto nella bottiglia di coltura con un contagocce sterile, distribuendo il tessuto in modo uniforme. Scartare il terreno di coltura il più possibile, quindi capovolgere la bottiglia.
5. Aggiungere 2 mL di SMCM nel flacone di coltura invertito e metterlo nell'incubatore (5% CO 2) a 37 °C per 1-2 ore, quindi ruotarlo lentamente verso l'alto e aggiungere altri₂ mL di SMCM.
6. Dopo 5-7 giorni di incubazione, sostituire l'SMCM con 4 ml di SMCM fresco. Generalmente, le cellule muscolari lisce sporadiche si arrampicano in circa 2 settimane.
7. Scartare lentamente l'SMCM e aggiungerlo lentamente quando si cambia il supporto. Trasportare lentamente la bottiglia di coltura quando ci si sposta verso una stazione di microscopio; Altrimenti, i tessuti galleggeranno e le cellule cresceranno lentamente.
8. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, lavare con 2 ml di PBS, digerire con 2 ml di tripsina allo 0,25% e dividerli in due nuovi flaconi di coltura con 4 ml di SMCM fresco.
9. Identificare le cellule attraverso un'analisi di immunofluorescenza di quattro diversi marcatori specifici per cellule muscolari lisce (CNN1, SM22)¹⁴.

2. Preparazione del chip PDMS

1. Per polimerizzare PDMS, aggiungere l'agente di polimerizzazione (componente B) alla base (componente A) con un rapporto di peso di A: B = 10: 1 w / w / p e mescolare completamente il complesso per 5 minuti; Il volume dipende dalla necessità dello studio.
2. Posizionare il gel PDMS preparato in un serbatoio di estrazione sottovuoto per 30-60 minuti e mantenere la pressione al di sotto di -0,8 mPa.
   NOTA: L'alta pressione porterà a un'estrazione insufficiente di piccole bolle all'interno del gel PDMS che influenzeranno la fase successiva della fabbricazione del chip.
3. Utilizzando un software CAD (computer-aided design), progettare lo stampo con una struttura esterna del telaio da 100 mm × 40 mm × 8 mm e un canale da 70 mm × 6 mm × 4 mm.
4. Su misura realizza gli stampi dei tre strati utilizzando una macchina per incisione a controllo numerico computerizzato ad alta precisione. Ritagliare il telaio degli stampi e dei microcanali utilizzando lastre di polimetilmetacrilato (PMMA), quindi incollarle su un'altra lastra di PMMA.
5. Versare il gel PDMS preparato su uno stampo con un telaio esterno da 100 mm × 40 mm × 6 mm e un canale da 70 mm × 6 mm × 4 mm, quindi reticolare a 70 °C per 1-2 ore.
6. Staccare le lastre PDMS reticolate dallo stampo e tagliare le membrane PDMS commercializzate in sezioni da 100 mm × 40 mm.
7. Trattare le tre lastre PDMS preparate e le due membrane PDMS con plasma di ossigeno per 5 minuti per l'attivazione superficiale PDMS. Applicare le seguenti impostazioni specifiche: aria ambiente come gas di processo; pressione impostata a -100 kPa; corrente impostata su 180--200 Ma; tensione impostata su 200 V; Tempo di elaborazione a 5 min.
8. Fori di punzonatura sulle tre lastre PDMS utilizzando un perforatore da 1 mm per rendere l'ingresso e l'uscita dell'aria e microcanali medi sul chip PDMS.
9. Incollare tre lastre PDMS e due membrane PDMS insieme nell'ordine: lastra PDMS canale aria (strato superiore) - membrana PDMS - lastra PDMS a canale medio (strato intermedio) - membrana PDMS - lastra PDMS canale aria (strato inferiore). Eseguire questo passaggio al microscopio stereoscopico a 4x per sovrapporre completamente i microcanali dell'aria con i microcanali medi.
10. Posizionare il chip PDMS assemblato in un incubatore a 70 °C per 1 ora.
11. Preparare diversi tubi in lattice di diametro interno di 1 mm e lunghezza 3 cm. Inserire un ago in acciaio inossidabile di 1 mm di diametro esterno e 1 cm di lunghezza in un'estremità del tubo preparato, quindi inserire un Luer nell'altra estremità del tubo per creare il tubo collegato all'aria e ai microcanali medi del chip PDMS.
12. Inserire i tubi preparati nelle uscite e nelle prese dell'aria e dei microcanali medi sul chip PDMS.

3. Trattamento superficiale e sterilizzazione dei trucioli PDMS

1. Infondere 2 mL di collagene di topo da 80 mg/mL nel microcanale medio del chip PDMS utilizzando una siringa da 2 mL e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Dopo l'incubazione, rimuovere il collagene dal canale e raccogliere con una siringa da 2 ml. Posizionare i chip PDMS rivestiti di collagene in un'incubatrice a 60 °C durante la notte.
3. Mettere i chip PDMS in uno sterilizzatore UV per più di 1 ora. Posizionare i chip PDMS sterilizzati su un banco ultraclean in preparazione per l'esperimento cellulare.

4. Semina cellulare sul chip PDMS e processo di allungamento delle cellule

1. Coltura 4 x 10 5 cellule muscolari lisce umane primarie (HASMC) da pazienti che utilizzano terreno di coltura liscia (SMCM) contenenti il 2% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina in un incubatore al⁵ % di CO₂ a 37 °C.
2. Quando la densità HASMC raggiunge l'80%, scartare l'SMCM e lavare le cellule con 2 ml di PBS.
3. Digerire le cellule usando 1 ml di tripsina allo 0,25% per 2 minuti e centrifugare a 100 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di SMCM fresco. Utilizzare 8 ml di SMCM per coltivare le cellule su un piatto di coltura da 10 cm.
4. Calcolare il numero di cellule utilizzando un citometro e utilizzare le cellule ad una concentrazione finale di 2 x 10⁵ cellule / ml.
5. Versare lentamente 2 ml di PBS nel microcanale medio del chip PDMS rivestito di collagene e sterilizzato e successivamente scartare utilizzando una siringa da 2 ml.
6. Versare lentamente un totale di 2 mL di 2 x 10⁵ celle/mL di sospensione HASMC nel microcanale medio del chip PDMS utilizzando una siringa da 2 ml. Quindi, chiudere il Luer all'ingresso e all'uscita del chip PDMS. Posizionare il chip PDMS in un incubatore (5% CO₂) a 37 °C per 1 giorno.
7. Dopo che le celle sono state attaccate alla membrana PDMS nel chip PDMS, quasi dopo 24 ore, collegare l'uscita del microcanale dell'aria sul chip PDMS al sistema di controllo del vuoto. Quando la cellula è attaccata, una forma cellulare allungata e normale può essere vista al microscopio, in contrasto con le cellule rotonde sospese.
8. Accendere l'elettrovalvola e la pompa per vuoto. Aprire il regolatore del vuoto e regolare il livello di pressione a 10 kPa per una deformazione del 7,18 ± dello 0,44% e 15 kPa per una deformazione del 17,28 ± dello 0,91%.
9. Dopo aver impostato i parametri del sistema di controllo, posizionare i chip PDMS in un incubatore (5% CO₂) a 37 °C e allungare per 24 ore.

5. Preparazione del sistema di controllo meccanico

1. Preparare diverse elettrovalvole, filtri per vuoto, regolatori di vuoto, una pompa per vuoto, una pompa peristaltica e un controllore logico programmabile (PLC) che controlla l'elettrovalvola.
2. Programmare il controllore PLC e impostare l'intervallo di accensione/spegnimento su 1 Hz. Collegare le elettrovalvole al controller programmato.
3. Collegare l'ingresso della pompa per vuoto ai filtri per vuoto, quindi collegare l'uscita dei filtri per vuoto ai regolatori del vuoto. Collegare l'uscita dei regolatori del vuoto alle elettrovalvole e, infine, collegare l'uscita delle elettrovalvole alle uscite dei microcanali dell'aria dei chip PDMS.
4. Collegare l'uscita della pompa peristaltica all'ingresso del microcanale medio del chip PDMS e l'ingresso della pompa peristaltica all'uscita del chip PDMS a microcanale medio per la sostituzione del terreno di coltura e la manipolazione del farmaco.
5. Regolare l'ampiezza della deformazione dal regolatore e la frequenza di deformazione dal microcontrollore.

Risultati

Il modello HASMC-OOC è costituito da un sistema di controllo del vuoto, un sistema di circolazione e chip PDMS e il design schematico del modello HASMC-OOC (Figura 1). Il sistema di controllo del vuoto è costituito da una pompa per vuoto, elettrovalvole e un controller PLC. Per agire come sistema circolante, è stata utilizzata una pompa peristaltica per rinfrescare il terreno di coltura cellulare e aggiungere farmaci. Il chip PDMS era composto da due camere a vuoto e una camera centrale r...

Discussione

Con il rapido sviluppo della tecnologia microfluidica, negli ultimi anni sono emersi modelli OOC in grado di replicare la funzione biologica e la struttura di uno o più organi in vitro per applicazioni in biologia, medicina e farmacologia¹⁵. L'OOC può simulare funzioni chiave del microambiente fisiologico umano, essenziali per esplorare i meccanismi della malattia e promuovere la traduzione preclinica dei farmaci ^8,16. Sebbene l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0099-100ml	Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0408	Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin	Beyotime	ST025-20g
Calcium AM/PI	Invitrogen	L3224
Cell culture flask	Corning	430639
CNN1	Abcam	Ab46794
Commercial flexible PDMS membrane	Hangzhou Bald Advanced Materials	KYQ-200
F-actin	Invitrogen	R415
FBS	Sigma	M8318
Hoses	Runze Fluid	96410	1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth muscle cell line CRL1999	ATCC	Lot Number:70019189
Image J	Imagej.net/fiji/downloads	Free Download: https://fiji.sc	Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator	Thermo Fisher Scientific		Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment.
Luer	Runze Fluid	RH-M016	Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope	Olympus
mouse collagen	Sigma	C7661
Oxygen plasma	Changzhou Hongming Instrument	HM-Plasma5L
Pasteur pipette	Biologix	30-0138A1
PBS	Beyotime	C0221A
Pen-Strep	Sigma	P4458-100ml	Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture.
peristaltic pump	Kamoer	F01A-STP-B046
Petri dish	Corning	430167
PLC controller	Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory	BR010-11T8X2M	The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
SM22	Abcam	ab14106
SMCM	ScienCell	Cat 1101
solenoid valve	SMC (China)	VQZ300
Syringe	Becton,Dickinson and Company	300841
Triton-X 100	Beyotime	ST795	To penetrate cell membranes
Trizol	Invitrogen	10296010	Used for RNA extraction
trypsin	Sigma	15400054
vacuum filter	SMC (China)	ZFC5-6	Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump	Kamoer	KVP15-KL-S
vacuum regulator	AirTAC	GVR-200-06
Primers
Primer Name	Forward (5’ to 3’)	Reverse (5’ to 3’)
SM22	CCGTGGAGATCCCAACTGG	CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1	CTCCATTGACTCGAACGACTC	CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA