可视化印度家庭空气污染干预网络试验的暴露和生物标志物评估的现场数据收集程序

摘要

在一项大型随机对照试验中，我们详细介绍了印度野外现场的空气和生物采样过程中使用的一致、高质量的程序。从对创新技术应用的监督中收集的见解，适用于农村地区的暴露评估，使更好的现场数据收集做法和更可靠的结果成为可能。

摘要

在这里，我们展示了标准程序的可视化表示，以收集来自印度泰米尔纳德邦资源受限环境中的两个不同研究地点的个人暴露于家庭空气污染（HAP）的人口水平数据。在4年内的不同时间测量了孕妇（M），其他成年妇女（OAW）和儿童（C）的颗粒物PM 2.5（空气动力学直径小于_2.5 微米的颗粒），一氧化碳（CO）和黑碳（BC）。此外，还进行了带有数据记录温度计的炉灶使用情况监测（SUM）和空气污染的环境测量。此外，还成功证明了在现场从研究参与者那里收集生物样本（尿液和干血斑[DBSs]）的可行性。基于这项研究和早期研究的结果，这里使用的方法提高了数据质量，避免了资源有限情况下家庭空气污染和生物样本收集的问题。对于在印度和其他低收入和中等收入国家（LMICs）进行类似空气污染和健康研究的研究人员来说，建立的程序可能是宝贵的教育工具和资源。

引言

在全球范围内，暴露于家庭空气污染（HAP），主要来自固体燃料烹饪，是发病率和死亡率的主要原因¹，^2，3。使用固体燃料（生物质，如木材、粪便、作物残渣和煤炭）烹饪和取暖在低收入和中等收入国家 （LMIC） 很普遍，带来了各种健康、环境和经济问题。PM_2.5是一种"无声杀手"，发生在室内和室外4^，5。印度的室内空气质量通常比室外空气质量差得多，并且已经获得了足够的关注，被视为主要的环境健康^危害4。缺乏基于测量的定量暴露数据阻碍了与HAP^6，7相关的全球疾病负担（GBD）评估。

目前的研究往往忽略了HAP暴露的测量是复杂的，并且取决于许多因素，包括燃料类型，炉子类型以及许多清洁和不清洁炉灶的混合使用，这种现象被称为"炉堆"。对暴露的其他影响包括燃料消耗量、厨房通风水平、靠近炉灶的时间长短、年龄和性别⁸.最广泛测量的，可以说是HAP暴露的最佳指标是PM_2.5;然而，由于缺乏经济实惠、用户友好且可靠的仪器，测量细颗粒物（PM_2.5）特别困难。

各种研究报告了使用不同方法测量单个或多个空气污染物的水平⁸，^9，10，^11，12。近年来，能够在室内和周围环境中测量这些污染物的相对低成本的传感器已经出现。然而，由于各种原因，并非所有这些传感器都可用于现场工作，包括维护成本、部署挑战、与传统测量方法的可比性问题、根据参考方法验证这些传感器的人力资源有限、定期数据质量检查（通过云）的困难，以及分散的故障排除设施有限或没有。许多具有这些类型测量的研究已将它们用作暴露的代理，或者通过使用时间^{活动评估将}环境测量与暴露重建相结合8，^9，12，^13，14。

个人监控 - 其中监视器由个人携带或由个人通过空间和时间 - 可以更好地捕捉他们的"真实"总暴露。测量个人暴露的研究通常只简要地传达其确切的方案，通常在科学手稿⁹，^{12，13，14，15}的补充材料中。尽管这些研究中详述的技术提供了扎实的一般抽样方法，但通常缺乏现场数据收集阶段的细节^12，16。

除了污染物浓度外，还可以监测这些住宅的许多其他特征。炉灶使用监测是一种评估家用能源器具使用时间和强度的方法，是最近许多影响和暴露评估的主要部分¹⁶，¹⁷，^18，19。其中许多监测器专注于测量炉灶燃烧点或附近的温度。虽然使用了热电偶和热敏电阻，但显示器缺乏操作协议，包括如何最好地将它们放在炉灶上以捕获炉灶使用模式的变化。

同样，生物监测是评估环境暴露的有效工具，尽管有几个因素会影响最佳生物基质的选择²⁰。在理想情况下，样本采集必须是非侵入性或微创的。所采用的方法应确保易于处理，不受限制的运输和储存，拟议的生物标志物和生物基质之间的良好匹配，相对较低的成本，并且没有伦理问题。

尿液样本采集在生物监测方面具有一些主要优势。与其他样品收集技术一样，存在一系列潜在的方法。对于参与者来说，收集 24 小时排尿可能很麻烦，导致样本采集不依从性^20，21。在这种情况下，建议使用现场样本、第一天早上的空隙或其他"方便"的采样。收集斑点样本时，收集的尿液量可能是一个主要缺点，导致内源性和外源性化学物质浓度的变化。在这种情况下，使用尿肌酐浓度进行调整是稀释校正的常用方法²²。

另一种常见的生物标本是静脉血。静脉血样通常难以获得用于生物监测;它们是侵入性的，令人恐惧的，需要适当的样品处理，储存和运输。使用干血斑（DBS）的替代方法可用于收集成人和儿童的样本以进行生物监测²³。

在现场方法的简单描述与发布详细的、可复制的关于监测仪使用和部署的说明之间存在巨大的文献差距，这些说明反映了有质量保证的样品现场数据收集的真正复杂性^24，25。一些研究概述了测量空气污染物（室内和环境）和监测炉灶使用的标准操作程序（SOP）。

然而，现场测量、实验室支持以及监测仪器和样品运输背后的基本步骤^{很少被描述}8，^11，25。在资源匮乏和资源匮乏的环境中进行实地监测的挑战和局限性可以通过视频适当地捕捉到，这可以补充书面作业程序，并提供一种更直接的方法来显示如何进行装置以及取样和分析技术。

在家庭空气污染干预网络（HAPIN）随机对照试验中，我们使用视频和书面协议来描述测量三种污染物（PM_2.5，CO和BC），炉灶使用监测和生物标本收集的程序。HAPIN涉及使用统一的方案，要求严格遵守SOP，以最大限度地提高在四个研究地点（秘鲁，卢旺达，危地马拉和印度）跨多个时间点收集的样本的数据质量。

研究设计、研究中心选择和招募的标准在前面有描述^24，26。HAPIN试验在四个国家进行;Clasen等人详细描述了研究环境²⁶。每个研究地点招募了800个家庭（400个干预和400个对照），这些家庭的孕妇年龄在18至35岁之间，怀孕9至20周，在家使用生物质做饭，并且不吸烟。在这些家庭的一个子集中（每个国家~120个），其他成年女性也参加了这项研究。

招募后，共进行了八次访问。第一次，在基线（BL）发生，发生在随机化之前。接下来的七个按出生前（妊娠24-28周[P1]，妊娠32-36周[P2]），出生时（B0）和出生后（3个月[B1]，6个月[B2]，9个月[B3]和12个月[B4]）分开。对于M，进行了三项评估（BL，P1和P2），对于OAW，进行了六项评估（BL，P1，P2，B1，B2和B4），对于C，进行了四项评估（B0，B1，B2和B4）。在B0，进行了生物标志物和健康评估，而在B3访问中仅进行了健康评估。

所有四个国家都遵循相同的协议。在本手稿中，我们描述了在印度采取的步骤。该研究在泰米尔纳德邦的两个地点进行:Kallakurichi（KK）和Nagapattinam（NP）。这些地点距离印度金奈斯里拉马钱德拉高等教育与研究所（SRIHER）环境卫生工程系的核心研究机构250至500公里。外地数据收集协议的复杂性要求部署许多具有不同技能和背景的人员。

我们提供了估计孕妇 （M）、其他/老年妇女 （OAW） 和儿童 （C） 对细颗粒物、一氧化碳 （CO） 和黑碳 （BC） 的微观环境和个人暴露样本所涉及的步骤的书面和视觉描述。还介绍了用于 （1） 使用参考级监测器和低成本传感器监测环境空气质量的现场协议，（2） 传统和液化石油气炉的长期炉灶使用监测，以及 （3） 用于生物监测的生物样本收集（尿液和 DBS）。这包括运输、储存和存档环境和生物样品的方法。

研究方案

斯里拉马钱德拉高等教育与研究所的机构伦理委员会（IEC-N1/16/JUL/54/49）、埃默里大学机构审查委员会（00089799）和印度医学研究理事会-卫生部筛选委员会（5/8/4-30/（Env）/Indo-US/2016-NCD-I）批准了HAPIN试验。HAPIN试验在 clinicaltrials.gov 上被确定为NCT02944682。在参与研究参与者之前，从他们那里收集了书面知情同意书，并根据伦理准则进行研究。

注意:在采样和数据收集期间管理的病例报告表（CRF）可在RedCap数据库中获得，存储在埃默里大学，并通过所有合作者之间的数据共享协议进行维护，该协议可根据要求提供给读者。

1. 仪器和材料

1. 使用以下仪器进行空气污染监测:用于滤纸称量的微量天平，用于微环境/个人采样 - 用于PM 2.5的增强型儿童MicroPEM （ECM），用于黑碳（BC）测量的光学透射仪，用于CO和基于蓝牙的信标的数据记录仪，用于间接测量PM 2.5的信标记录仪（每次访问期间 - BL，P1，P2，B1，B2和B4），用于环境PM_2.5的组合重量和浊度监测仪 测量和温度记录器，用于监控炉灶使用情况。
2. 使用以下仪器进行生物监测:用于运输生物样本的冷却器和疫苗袋、蛋白质保护卡、湿度指示卡、成人采血针、婴儿安全采血针和毛细管 （40 μL）。

2. 滤纸调节和称重

1. 使用干净、无粉的手套处理过滤器。使用灯箱检查过滤器（2μm孔径，15和47mm直径）是否有任何损坏，并将检查过的过滤器放在空调房间（19-23°C和35%-45%相对湿度[RH]）的清洁过滤器保持器中24小时。
2. 将一块干净的箔纸放在桌子上，然后打开微量天平。将缩放单位设置为毫克 （0.001 mg） 并遵循内部校准。
3. 在数据输入表中记录日期/时间、技术人员姓名、相对湿度、温度、过滤器批号、过滤器尺寸和过滤器 ID。
4. 取条件过滤器并去离子10秒。将滤纸小心地放在称量托盘上，并在CRF中将重量记录为"重量1"（补充图1）。
5. 取下过滤器，将其放入培养皿/过滤器保持器中，等待秤恢复到零，然后再称量下一个过滤器。
6. 重复步骤2.4和2.5，并在通用报告格式中将其输入为"权重2"。

3. 微环境/个人空气采样

注:微环境/个人空气采样所涉及的仪器和步骤的详细概述见 补充图2。

1. 对于个人监测，将仪器放在背心中（图1 Ai），并建议参与者佩戴24小时，洗澡和睡觉时除外。
2. 在洗澡和睡觉时，指导参与者将背心放在<1米外的现场团队提供的定制金属支架（图1Aii）上。
3. 对于微环境监测，选择合适的位置并将金属支架与仪器一起放置（图1C，D;补充表1）在离地面1.5米处，如果可能的话，远离门窗1米，距离主炉灶的燃烧区1米（放置在厨房中时）。
4. 在监测区域执行5分钟的演练，在相应的CRF中记录所有监测仪器（PM_2.5，BC，CO以及时间和位置监测器）的开始和结束时间。
5. 在移除当天（第2天，24小时后），收集并用铝箔包裹仪器，并将其放入可重新密封的盖子中，以便运送到现场办公室。在取下过滤器之前，将 ECM 采样器放入冷却箱中（以保持冷链）。
6. PM_2.5 测量
   注意:使用 ECM，由于其体积小（高度:12 厘米;宽度:6.7 厘米）和重量（~150 克），因此非常适合此应用。ECM 通过连接到装有 15 毫米聚四氟乙烯过滤器的盒式¹⁹，²⁶，²⁷ 的冲击器吸入空气^，以 0.3 L/min（长达 48 小时）的速度收集浊度和重量样品。
   1. 使用酒精棉签（70%异丙醇）清洁所有ECM部件（入口头，冲击器部件，U形盒锁），并使用ECM软件（例如MicroPEM扩展坞）启动采样器。
   2. 将校准盖放在 ECM 的入口上，并将带有 HEPA 过滤器的流量计连接到校准盖。
   3. 设置校准组件后，按 "开始" 按钮并等待 5 分钟使其稳定下来。调整流速（0.3升/分钟的5%以内）并在CRF-H48中记录。
   4. 将HEPA过滤器直接连接到ECM入口，调整浊度计偏移，直到值读数为0.0，并以CRF-H48记录读数。
   5. 将程序设置为24小时，然后按 提交校准值 按钮;ECM 现已准备好进行采样。
   6. 采样后，将采样的ECM在室温下放置至少20分钟，并在CRF-H48中记录采样后流速。使用文件名约定下载并保存 ECM 数据。
   7. 取出过滤器，将其放入过滤器保持器中，然后将其储存在-20°C。
7. 黑碳 （BC） 测量
   1. 使用透射仪测量通过滤光片在 880 nm 波长^19、26、27 处的光衰减。
   2. 打开并稳定 15 分钟。确保 BC 仪器的空白槽和样品槽中均有正确尺寸的墨盒（即 15 和 47 mm 小柱）。
   3. 对中性密度（ND）和具有分配ID的空白滤光片执行扫描（补充图3 和 补充表2）。
   4. 扫描空白滤光片后，将实验室空白放入样品扩散器上方的样品盒插槽中，然后插入仪器位置 2 的插槽中。
   5. 取出实验室空白，然后继续使用测试过滤器和样品过滤器进行扫描。
   6. 完成过滤器扫描后，取下过滤器并将其放回培养皿/过滤器保持器。选择扫描的数据，单击" 接受 "按钮，然后单击 "保存 数据"。
8. 一氧化碳 （CO） 测量
   注意:CO仪器很小（大约是一个大笔的大小），可以连续记录~32，000个点，范围为0-1，000 ppm，并已用于评估各种其他监测工作中的风险和HAP¹⁹，^26，27。
   1. 使用该软件启动并设置 CO 数据记录仪 1 分钟。屏幕显示"已成功配置 CO 记录器"。仪器已准备好进行采样。
   2. 采样后，使用软件打开CO记录仪，按停止 停止 USB数据记录仪，下载后保存数据。
   3. 校准一氧化碳记录仪
      1. 以 1 分钟采样率设置 CO 记录仪并将其放入校准盒中，传感器的入口面向校准盒的进气口。
      2. 5分钟，将零级空气或室内空气的流速设置为2升/分钟。记下开始和结束时间。将气流降低到 1 升/分钟。再次记下开始和结束时间。
      3. 用跨度气体（零级空气中 50-150 ppm 标准的 CO）重复该过程，然后按照上一步所述对零级空气重复该过程。
      4. 将校准数据下载到特定文件夹。打开校准数据文件，将CO记录仪监测仪的数据输入CRF-H47。
9. 时间和位置记录器 （TLL）
   注意:使用两种类型的蓝牙仪器来监控孩子的时间和位置。让孩子穿一件背心，里面有两个硬币大小的时间和位置监视器（TLM），连接到位于ECM和母亲采样背心附近的记录器，如图1Aiii所示。通过整合在该位置花费的时间的相应区域浓度来计算孩子的暴露量¹⁹，^26，27。
   1. 为移动电源充电，并通过连接确保记录器正常工作。
   2. 时间和位置监视器 （TLM）
      1. 将 CR2032 电池插入显示器（如果电池电量充足，指示灯应闪烁几次）。
      2. 对于"O"型TLM，按下软盖听到咔嗒声，绿灯应闪烁，表示TLM现在处于"打开"状态并传输其信号。对于"EM"型号TLM，按下软盖打开第一种模式（指示灯应闪烁绿色）。再次按下可进入中间模式（指示灯应再次闪烁绿色）。
      3. 采样后，从记录仪SD卡中显示的"启动"驱动器下载数据。从指定的"TLL"文件夹中复制并保存文件。

4. 炉具使用监控

1. 通过调查和部署基于传感器的客观措施收集有关炉灶使用模式的详细信息。在液化石油气和生物质炉上放置温度记录仪 18，^19，28。补充图4详细概述了中心实验室，现场实验室和现场活动数据收集的炉灶使用监测所涉及的仪器和步骤。
2. 将热电偶探头靠近炉灶的繁琐区域，如 补充图5所示，并安装点。
3. 打开 Geocene 应用程序并输入任务名称、采样间隔、家庭 ID、炉灶类型、随机化详细信息、活动、标签和注释。按 开始新任务。在CRF-H40中记录安装详细信息。
4. 每 2 周，使用应用程序下载数据，并通过蓝牙从 Dot 传输到云服务器。在CRF-H40中记录信息。

5. 环境监测

注意:环境 PM 2.5 仪器记录实时机载 PM 2.5，并具有内置的 47 毫米过滤器，可以收集 PM_2.5 以进行重量评估 19、^26、29。补充图6详细概述了中心实验室、现场实验室和现场活动数据收集的环境监测所涉及的仪器和步骤。

1. 遵循美国 EPA 关于仪器和入口放置的准则³⁰ :a） 距离墙壁 >2 米;b） 距离树木>10米;c） 离地面2-7米;d） 距离道路 >2 米。
2. 将环境 PM_2.5 仪器安装在带接地的混凝土平台上。确保没有环境背景空气污染，并在CRF-H46中输入采样详细信息。
   1. 从菜单选项中，将采样间隔设置为 5 分钟。记下开始时间并使用空过滤器执行流量校准。收集 6 天的实时数据。
   2. 在重量法采样开始的当天，下载并保存实时数据。
   3. 拆下先前安装的空过滤器，并使用实验室组织清洁过滤器支架。放置预先称重的过滤器并填充CRF-H46。
   4. 24小时后，停止采样器并下载实时数据。在CRF-H46中记录采样信息。取下过滤器，用铝箔包裹，并在冷链运输过程中将其放入可重新密封的袋子中。

6. 生物监测

1. 尿液样本采集、处理和储存
   注意:根据美国 CDC 指南^19，31，^32，按照在参与者家中收集晨尿样本所涉及的步骤进行操作。从孕妇（BL、P1 和 P2 就诊）和其他成年女性（BL、P1、P2、B1、B2 和 B4 就诊）收集尿液样本;在儿童（B1，B2和B4访问）中，在第2天施用相应的CRF-B10。补充图7提供了中心实验室、现场实验室和现场活动中生物监测所涉及的步骤的详细概述。
   1. 对于尿液样本采集，请在第 1 天提供尿液采集杯（M 和 OAW）。同样，指导母亲第二天早上将孩子的尿样收集在尿袋中或直接放入杯中并储存在疫苗袋中。
   2. 在现场实验室，将收集的尿液样品储存在1-8°C之间。 在分装之前，解冻尿杯。
   3. 要等分，一次处理一个尿液样本。吸出 2 mL 样品并加入两个 4 mL 冷冻管中，5 mL 加入两个 10 mL 冷冻管中，15 mL 加入档案管中，并储存在 -20 °C。
   4. 对现场空白样品（水）遵循相同的等分程序。
2. DBS 收集、干燥和储存
   注意:按照世卫组织建议³³，34，培训调查员通过孕妇（BL，P1和P2访问）和其他成年妇女（BL，P1，P2，B1，B2和B4访问）的手指刺收集DBS，以及儿童（B0，B1^，B2和^B4访问）的脚跟点刺或手指刺。从M和OAW收集DBS的详细程序载于补充文件的附件H。
   1. 对于孩子，根据世卫组织指南，使用适当的采血针收集足跟点刺DBS。
   2. 选择左脚跟或右脚跟，然后用酒精棉签擦拭穿刺部位。
   3. 将采血针保持在皮肤穿刺位置的水平位置并刺破。刺破后，用无菌棉布擦去第一滴血。
   4. 将毛细管靠近穿刺部位的血液层，让血液通过毛细血管作用流入管中。
   5. 在毛细血管中填充足够的血容量后，立即将血液涂抹在蛋白质保护卡的圆圈内。
   6. 让试样在室温下水平方向风干（过夜）。
   7. 确保血斑呈深褐色，没有可见的红色区域。
   8. 干燥后，将DBS卡放入装有干燥剂（至少两袋）的可重新密封的生物标本袋中，并储存在-20°C。

7. 采样滤波器的监管链 （COC）

1. 有关详细步骤，请参阅补充文件。解释过滤器调节的步骤在 附录A中描述，_PM2.5 的微环境/个人空气采样在附件 B中描述，BC测量在附件 C中描述，CO测量在 附件D中描述，时间和位置监测在附件 E中描述，炉灶使用监测在附件 F中描述，环境监测在附件 G中，生物监测在附件 H中，样品运输在附件 I中描述.使用的通用报告格式清单见 补充表3。
   注意: 图2A 显示了采样后收集并用铝箔包裹的ECM。将包裹好的过滤器包装在单独的生物样本袋中，并放置在装有预冷冻凝胶包的疫苗袋中。取样过滤器被运送到现场实验室（图2B）。如图2C所示，从现场运输的过滤器储存在现场实验室的深冰箱（- 20°C）中，并保持不受干扰，直到运输到中心实验室。每15至30天，样本通过陆路运往中心实验室;将采样过滤器包装在干冰和含有COC的凝胶包装上。从外地办事处收到样品后，与COC交叉检查样品，并在深冰箱（-20°C）中存档。

结果

微环境/个人空气采样方法:
图1Ai 显示了在24小时采样期间穿着定制背心的孕妇。背心包括ECM，CO记录器以及带有移动电源的时间和位置记录器。确保参与者在整个采样期间都穿着背心，除了洗澡和睡觉时。用于将背心悬挂在睡眠外围的支架如图 1Aii 所示。

图1Bi显示了采样前和采样?...

讨论

我们在多国HAPIN试验^19，24中演示并直观地表示了收集个人暴露于家庭空气污染的人口水平数据的标准程序。这里描述的基于现场的环境和生物标志物采样方法是适当和可行的，特别是在资源有限环境中的脆弱人群中，_PM2.5暴露量比世卫组织空气质量指南（AQG）值高几个数量级（年平均值为5μg/^m 3和24小时平均值为15μg/m³）37^，

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD adult lancet	BD Biosciences	366594	DBS collection from finger
BD Quikheek infant safety lancet	BD Biosciences	368100 & 368101	Heel prick DBS collection
Beacon	Roximity	O/EM	Time and location monitor [TLM] (Personal monitor)
Beacon Logger	Berkley Air Monitoring group	xxxx	Time and location logger [TLL] (Indirect measurement)
Crdo ProMed Pelican Bag	Peli Biothermal USA		Cooler bag
Enhanced Children MicroPEM (ECM)	RTI International, Durham, NC, US	xxxx	Personal monitor of PM2.5
E-sampler	Met One Instruments	9800	Indirect measurement of ambient PM2.5
Geocene	Geocene Inc., Vallejo,CA	xxxx	for stove use monitoring
Humidity indicating card	DESSICARE, INC.	04BV14C10	Sample integrity indicator
Lascar	Lascar Electronics	EL-USB-300	Carbon monoxide (CO) data logger
PTS collect capillary tubes- 40 µL	PTS collect	2866	To collect heel prick DBS from children
Sartorius	Sartorius Lab Instruments, GmbH & Co, Germany	MSA6-6S-000-DF	Microbalance (Weighing filters)
SootScanTM	Magee Scientific Co, Berkeley, USA	OT21	Black carbon measurement
Vaccine Bag	Apex International, India	AIVC-46	Vaccine Bag
Whatman 903 Protein Saver card	GE Healthcare Life Sciences	10534612	Collection of capillary blood samples (Dried Blood Spot)