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摘要

提出了一种荧光流式细胞术定量由细胞培养或小鼠肿瘤模型中化疗药物诱导的衰老癌细胞的方案。可选程序包括共免疫染色、便于大批量或时间点分析的样品固定，以及通过流式细胞术分选富集活衰老细胞。

摘要

细胞衰老是由生物损伤引起的增殖性停滞状态，通常在衰老细胞中累积多年，但也可能在肿瘤细胞中迅速出现，作为对各种癌症治疗诱导的损伤的反应。肿瘤细胞衰老通常被认为是不可取的，因为衰老细胞对死亡产生抵抗力并阻止肿瘤缓解，同时加剧肿瘤恶性肿瘤和治疗耐药性。因此，衰老肿瘤细胞的鉴定是癌症研究界持续关注的问题。存在各种衰老测定，许多基于众所周知的衰老标志物，衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性。

通常，SA-β-Gal测定是在固定细胞上使用显色底物（X-Gal）进行的，通过光学显微镜缓慢而主观地计数"蓝色"衰老细胞。使用细胞渗透性荧光SA-β-Gal底物（包括C12-FDG（绿色）和DDAO-半乳糖苷（DDAOG;远红色））的改进检测能够分析活细胞，并允许使用高通量荧光分析平台，包括流式细胞仪。C12-FDG是SA-β-Gal的有据可查的探针，但其绿色荧光发射与衰老期间由于脂褐素聚集体的积累而产生的固有细胞自发荧光（AF）重叠。通过使用远红SA-β-Gal探针DDAOG，绿色细胞自发荧光可用作确认衰老的次要参数，从而增加测定的可靠性。其余荧光通道可用于细胞活力染色或可选的荧光免疫标记。

使用流式细胞术，我们证明了使用DDAOG和脂褐素自发荧光作为双参数测定来鉴定衰老肿瘤细胞。进行活衰老细胞百分比的定量。如果需要，可以包括可选的免疫标记步骤来评估感兴趣的细胞表面抗原。鉴定出的衰老细胞也可以进行流式细胞术分选和收集以进行下游分析。收集的衰老细胞可以立即裂解（例如，用于免疫测定或"组学分析"）或进一步培养。

引言

衰老细胞通常在正常的生物衰老过程中在生物体内积累多年，但也可能在肿瘤细胞中迅速发展，作为对各种癌症治疗（包括放疗和化疗）引起的损伤的反应。虽然不再增殖，但治疗诱导的衰老（TIS）肿瘤细胞可能有助于治疗耐药性并导致复发1，2，3。TIS细胞分泌的因子可以通过促进免疫逃避或转移来加剧肿瘤恶性肿瘤4，5。TIS细胞产生复杂的，上下文特异性表型，改变的代谢谱和独特的免疫反应6，7，8。因此，各种癌症治疗方法诱导的TIS肿瘤细胞的鉴定和表征是癌症研究界持续关注的课题。

为了检测TIS肿瘤细胞，常规衰老测定被广泛使用，主要基于检测衰老标志酶溶酶体β-半乳糖苷酶GLB19的活性增加。在接近中性（而不是酸性）溶酶体 pH 下检测可以特异性检测衰老相关的 β-半乳糖苷酶 （SA-β-Gal）10。已经使用了几十年的标准SA-β-Gal测定使用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷），一种蓝色显色β-半乳糖苷底物，通过光学显微镜检测固定细胞中的SA-β-Gal11。X-Gal 测定允许使用常用试剂和实验室设备对 TIS 进行定性视觉确认。基本的透射光显微镜是评估蓝色显色原存在所需的唯一仪器。然而，X-Gal 染色程序可能缺乏敏感性，有时需要超过 24 小时才能显色。染色之后，根据在光学显微镜下对表现出一定强度的蓝色色原的细胞进行计数，对单个衰老细胞进行低通量主观评分。由于X-Gal是不可渗透的，因此该测定需要溶剂固定的细胞，这些细胞无法回收用于下游分析。当处理来自动物或患者的有限样本时，这可能是一个主要缺点。

使用细胞通透性荧光酶底物改进的 SA-β-Gal 测定，包括 C 12-FDG（5-十二烷基氨基荧光素 Di-β-D-吡喃半乳糖苷，绿色）和 DDAOG（9H-（1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基）β-D-吡喃半乳糖苷，远红色）先前已出现在文献12，13，14，15 中。DDAOG的化学探针结构和光学特性见补充图S1。这些细胞通透性探针允许分析活细胞（而不是固定细胞），荧光探针而不是显色探针有助于使用快速高通量荧光分析平台，包括高内涵筛选仪器和流式细胞仪。分选流式细胞仪能够从细胞培养物或肿瘤中回收富集的活衰老细胞群，以进行下游分析（例如，蛋白质印迹、ELISA或"组学"。荧光分析还提供定量信号，可以更准确地确定给定样品中衰老细胞的百分比。可以轻松添加其他荧光探针，包括活性探针和荧光团标记的抗体，用于SA-β-Gal以外的靶标的多重分析。

与DDAOG类似，C12-FDG是SA-β-Gal的荧光探针，但其绿色荧光发射与内在细胞AF重叠，后者在衰老期间由于细胞16中脂褐素聚集体的积累而产生。通过使用远红DDAOG探针，绿色细胞AF可以用作确认衰老的辅助参数17。这通过在SA-β-Gal之外使用第二个标记物来提高测定可靠性，而SA--Gal作为衰老的单一标记物通常不可靠18。由于检测衰老细胞中的内源性AF是一种无标记的方法，因此它是扩展我们基于DDAOG的测定特异性的快速简便方法。

在该协议中，我们证明了使用DDAOG和AF作为快速，双参数流式细胞术测定，用于鉴定来自 体外 培养物或从小鼠中建立的药物治疗肿瘤中分离的活TIS肿瘤细胞（图1）。该方案使用与各种标准商业流式细胞仪和分选仪兼容的荧光团（表1）。使用标准流式细胞术分析可以定量活衰老细胞的百分比。如果需要，可以执行可选的免疫标记步骤以评估与衰老同时感兴趣的细胞表面抗原。鉴定的衰老细胞也可以使用标准的荧光激活细胞分选（FACS）方法进行富集。

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图 1:实验性工作流程。 总结DDAOG测定关键点的示意图。（A）将TIS诱导药物添加到哺乳动物培养的细胞中或施用于荷瘤小鼠。然后允许时间用于TIS的发作:对于细胞，治疗后4天;对于小鼠，总共22天，每5天进行三次治疗，外加7天恢复。收获细胞或将肿瘤解离成悬浮液。（B）用Baf处理样品以调节溶酶体pH以检测SA-β-Gal30分钟;然后，加入DDAOG探针60分钟以检测SA-β-Gal。将样品在PBS中洗涤2次，并短暂添加活性染色剂（15分钟）。或者，样品可以在开放的荧光通道中用荧光抗体染色和/或固定以供以后分析。（C）使用标准流式细胞仪分析样品。活细胞在点图中可视化，显示红色DDAOG（指示SA-β-Gal）与绿色自发荧光（脂褐素）。基于未处理的对照样品（未显示）建立确定TIS细胞百分比的门。如果使用分选细胞仪（FACS），则可以收集TIS细胞并将其放回培养物中以进行进一步的 体外 测定，或者裂解并处理以进行分子生物学测定。缩写:DDAO = 9H-（1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮）;DDAOG = DDAO-半乳糖苷;TIS=治疗诱导的衰老;FL-Ab = 荧光团偶联抗体;Baf = 巴非霉素 A1;SA-β-Gal = 衰老相关的 β-半乳糖苷酶;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。

荧光基团检测防爆/电磁（纳米）激光细胞仪（纳米）细胞仪检测器/带通滤光片（纳米）
东道格SA-β-加尔645/6601640670 / 30
自动对焦脂褐素< 600488525 / 50
CV450可行性408/450405450 / 50
体育抗体/表面标志物565/578561582 / 15

表 1:荧光团和细胞仪光学规格。 本协议中使用的细胞仪规格列出了总共具有 4 个激光器和 15 个发射检测器的仪器。在 645/660 nm 处检测到的 DDAOG 是被 SA-β-Gal1 切割的探针的形式。未裂解的DDAOG可以在460/610nm处表现出低水平的荧光，但通过方案中的洗涤步骤去除。缩写:DDAO = 9H-（1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮）;DDAOG = DDAO-半乳糖苷;AF = 自发荧光;PE = 藻红蛋白;SA-β-Gal = 衰老相关的 β-半乳糖苷酶。

研究方案

所描述的所有动物工作都得到了芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 储备溶液的制备和储存

注意:如果要对细胞进行流动分选，则应使用无菌技术制备所有溶液，并通过0.22μm过滤装置过滤。

  1. 在DMSO中制备5 mg / mL的DDAO-半乳糖苷储备溶液。每管 50 μL（或所需体积）等分。在黑暗中在-20°C下储存长达1年。
  2. 在DMSO中以1mM制备巴非洛霉素A1的储备溶液。每管 50 μL（或所需体积）等分。在-20°C下储存长达6个月。
  3. 在DMSO中以1mM制备钙黄绿素紫450 AM的储备溶液。每管 50 μL（或所需体积）等分。在黑暗中在-20°C下储存长达1年。
  4. 为了在 体外处理培养的细胞，在适当的溶剂中制备10mM浓缩的衰老诱导剂储备溶液，并使用0.2μm注射器过滤器灭菌。储存在-20°C或按照制造商的指示。
    注意:为了 在体内 递送衰老诱导化疗药物（对于具有已确定肿瘤的小鼠），这些药物应为USP级，并在注射前从浓缩原液中稀释成盐水。
  5. 为所使用的细胞系准备完整的培养基。
    注意:例如，使用 DMEM 1x + 10% FBS + 1x 谷氨酰胺替代品 + 1x 青霉素/链霉素为 B16-F10 或 A549 细胞准备培养基。培养基必须保持无菌。可以使用其他细胞系特异性培养基配方。在某些情况下，某些成分（如谷胱甘肽）可能会干扰衰老的开始。如果衰老的开始时间低于预期或对照化疗药物未观察到，则应对各种培养基制剂进行实证性检测。
  6. 准备染色和洗涤缓冲液。
    1. 在 1x PBS 中制备 1% 牛血清白蛋白 （BSA），用于染色程序。将 2 g BSA 溶解到 200 mL PBS 中，并在室温下搅拌 10 分钟或直至完全溶解。
    2. 在 1x PBS 中制备 0.5% BSA 作为洗涤缓冲液。将步骤1.6.1中制备的1%BSA的100mL稀释到100mL的1x PBS中，用于0.5%BSA。
    3. 将缓冲液在4°C下储存长达1个月。
  7. 在1x PBS中制备4%的多聚甲醛。为方便起见，使用市售的密封多聚甲醛安瓿（例如 16% v/v）:2.5 mL 16% PFA + 7.5 mL 1x PBS（= 10 mL 4% PFA）。根据每次实验所需的总体积调整制备的体积。
    注意:仅根据需要准备细胞固定;每次都准备新鲜的。
  8. 制备 FACS 分选缓冲液:1x PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% BSA （pH 7.2）。通过0.22μm过滤装置无菌过滤，并在4°C下储存长达1个月。
    注意:仅根据需要准备 FACS 分类。流动分选缓冲液配方可能因 FACS 仪器而异。上述配方与本研究中使用的仪器兼容（见 材料表）。请参阅制造商指南。
  9. 制备肿瘤解离溶液:RPMI-1640培养基中的20μg/ mL自由酶TL + 100μg/ mL DNAse I（不含FBS或其他补充剂）。储备溶液可用于保留Libase TL（按照制造商的指示制备和储存）和DNAse I（100 mg / mL在双蒸水中[ddH2O]，储存在-20°C）。
    注意:如果仅使用肿瘤，请根据需要准备;每次都准备新鲜的。

2. 化疗药物诱导培养的癌细胞衰老

注意:本节中的所有细胞操作步骤都应使用无菌实践在生物安全柜中进行。本节是为贴壁细胞类型编写的。悬浮细胞可以按照适当的修改使用，如前所述。

  1. 根据提供所用特定细胞系的供应商或实验室的标准方案培养癌细胞系。
    注意:低传代细胞（p < 10）通常是首选，因为在未经处理的细胞样品中会有较低水平的复制性衰老，即较低的背景。
  2. 在药物诱导衰老前一天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（或按照推荐）收获细胞。通过加入等体积的完全培养基来中和胰蛋白酶，并将细胞悬液转移到无菌锥形管中。
    注意:悬浮细胞不需要此步骤。
  3. 使用标准血细胞计数器方法计数细胞并记录细胞/mL。在标准 1 孔塑料培养皿中以 1 × 10 3-10 × 103 细胞/cm2 平板细胞。
    注意:最佳铺板密度取决于细胞的增殖速率，应由用户确定。细胞在处理时（即，在铺板后孵育18-24小时后）应处于约10%-20%汇合的对数期生长。悬浮细胞的起始密度（细胞/mL）应由用户确定。六孔板通常每孔产生足够的衰老细胞，用于一个标准流式细胞术分析样品。如果是流动分选，应使用更大的表面积（例如，多个P150板）来回收足够数量的衰老细胞以进行下游测定（≥1×106）。
  4. 将铺板细胞在具有5%CO2 和湿度盘的37°C培养箱中孵育过夜（18-24小时）。
  5. 用衰老诱导的化疗药物治疗铺板细胞。包括至少一种阳性对照，例如依托泊苷 （ETO） 或博来霉素 （BLM）。每种药物准备重复孔。包括一组仅用车辆作为对照处理的集合。
    注意:用户应测试每种实验剂的剂量曲线，以确定所用细胞系中衰老诱导的最佳浓度。
  6. 将细胞在具有5%CO2 和湿度盘的37°C培养箱中孵育4天，以允许衰老开始。每天使用光学显微镜检查预期的形态变化。
    注意:根据衰老开始的速度，3-5天的潜伏时间可能是可以接受的。可以根据需要更换培养基并重新应用（或不重新应用）药剂，以促进健康的生长条件，同时达到可接受的衰老细胞百分比。
  7. 衰老开始后，通过在37°C下添加胰蛋白酶 - EDTA 0.25%5分钟来收获细胞。 当细胞解离成悬浮液时，用等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。
    注意:悬浮生长的细胞不需要此步骤。如果要进行表面标志物染色，请避免使用胰蛋白酶-EDTA，因为它会暂时破坏细胞上的表面抗原。相反，使用无菌塑料细胞刮刀（或设计用于保存表面抗原的替代解离试剂）轻轻解离单层。
  8. 使用血细胞计数器计数每个样品中的细胞。计算每个样品的细胞/mL。
    注意:此时可以添加台盼蓝来评估死细胞的百分比（即，由于药物治疗），但在DDAOG染色工作流程中，细胞死亡也将使用荧光活性染料确定。
  9. 将每个样品≥ 0.5 × 10个 6 个细胞分装到 1.7 mL 微量离心管中。
    注意:每个样品的细胞数量应在所有样品中标准化。
  10. 在4°C的微量离心机中以1，000× g 离心管5分钟。 除去上清液。
    注意:如果没有冷藏微量离心机，则可以在环境温度下对某些弹性细胞类型进行离心。
  11. 在第 4 节中进行 DDAOG 染色。

3.化疗药物诱导小鼠肿瘤衰老

注意:如果肿瘤细胞将被FACS分选，请在生物安全柜中工作并使用无菌仪器，程序和试剂来确保每一步的无菌性。

  1. 根据标准方法（例如，Appelbe等人19），通过皮下注射癌细胞来创建小鼠肿瘤模型。
    注意:应针对每个方案优化要注射的癌细胞数量，注射部位和适当的小鼠品系。在这里，B16-F10细胞以1×106 个细胞在0.1mL盐水（1×107 个细胞/mL）中皮下注射。
    1. 在进行进样之前，验证使用台盼蓝的细胞活力是否为>90%。用异氟醚麻醉小鼠。
    2. 用3%异氟醚和空气的混合物麻醉6-7周龄的雌性C57 / BL6小鼠，并在这些条件下保持在放置在无菌生物安全柜内的诱导室中。通过轻轻捏住鼠标的脚来确认麻醉。在双眼上涂抹无菌兽药膏，以防止手术过程中角膜干燥。在此过程中，使用加热灯保持小鼠体温。
    3. 在无菌生物安全柜内工作，将小鼠从诱导室中取出，并将其与提供3%异氟醚供应的鼻锥接触。使用干净的电动剃须刀在注射部位剃除侧翼区域。通过在注射前手动倒置试管来短暂混合制备的细胞悬液，并使用装有无菌 27 G 针头的无菌 0.5 mL 注射器将细胞悬液皮下注射到剃光的侧腹中。从引擎盖中取出鼠标并将其转移到恢复架中。
    4. 在恢复笼中，连续监测小鼠的生命体征，直到它们恢复足够的意识以维持胸骨卧位，表现出矫正反射，并能够在笼子中安全地四处走动。不要让小鼠无人看管或将经过肿瘤细胞接种的动物送回其他动物的陪伴下，直到完全康复。每天监测所有接种的小鼠体重减轻、活动/活动减少和神经系统症状;对任何类别表现出严重症状的小鼠实施安乐死。对于接种后出现疼痛症状的小鼠，皮下注射一次丁丙诺啡（0.1-0.2mg / kg）。
      注意:丁丙诺啡后表现出持续疼痛的小鼠应实施安乐死。
  2. 从癌细胞接种后5-7天开始，每2-3天用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤体积达到50mm 3±10mm3时开始早期治疗。
    注意:在这项工作中，在0.9%氯化钠注射液（USP）中施用10mg / kg的USP级多柔比星（DOX）或聚乙二醇化脂质体阿霉素（PLD）的剂量。从肿瘤达到50mm 3±10mm 3开始腹膜内注射药物3次，每5天一次。小鼠在最终治疗后恢复7天，以允许TIS在肿瘤中发作。应优化衰老诱导剂量和其他治疗和/或肿瘤模型的条件。
  3. 在最后一次药物治疗后7天，通过CO2 过量和颈椎脱位或其他符合实验动物工作指南的批准方法处死小鼠。切除肿瘤并将其收集在装有无菌RPMI生长培养基的无菌管或6孔板中（以在处理过程中保持活力）。
    注意:如果进行组织学检查（例如，X-Gal或免疫组织化学），则可以在此处将肿瘤一分为二，其中一半在O.C.T.包埋培养基中快速冷冻并使用冷冻组织学的标准程序进行冷冻切片。剩余的肿瘤一半应产生丰富的解离和DDAOG染色材料。
  4. 将一个肿瘤转移到含有 5 mL RPMI 培养基的 P100 塑料培养皿中。用手术刀将肿瘤切成碎片。
  5. 将含有悬浮细胞和碎片的肿瘤碎片的5 mL悬浮液转移到15 mL锥形管中。如果存在大碎片，请使用 25 mL 血清移液管的较宽尖端转移该悬浮液。用额外体积的无菌RPMI冲洗培养皿以收集材料。盖上盖子并将锥形管放在冰上。
  6. 对剩余的肿瘤重复步骤3.45-3.5。对每个肿瘤使用单独的板和手术刀以避免交叉污染，或在肿瘤之间用PBS冲洗干净。使用5 mL新鲜培养基切碎每个肿瘤。
  7. 制备肿瘤解离溶液:RPMI-1640培养基（不含FBS）中的20μg/ mL自由酶TL + 100μg/ mL DNAse I。
    注意:存在许多用于肿瘤解离溶液的有效配方，并且可以包括来自不同制造商的各种酶和其他成分。不同肿瘤类型的最佳成分浓度差异很大。如果红细胞在肿瘤中高度存在，则可以额外进行红细胞溶解;如果死细胞是一个问题，可以使用死细胞去除试剂盒。强烈建议用户独立确定最佳的肿瘤解离条件，以提供高活力和低污染细胞、结缔材料和碎片的存在。
  8. 将所有肿瘤样品在锥形管中以1，000× g （4°C）离心5分钟。除去上清液。
  9. 根据肿瘤材料的体积，向每个肿瘤样品中加入1-5mL肿瘤解离溶液。确保管中有超过 1-2 mL 的肿瘤材料沉淀。以中等速度涡旋混合。
  10. 将样品置于快速旋转的37°C培养箱中45分钟。每15分钟短暂涡旋一次。
  11. 通过 100 μm 细胞过滤器将每个样品过滤到 50 mL 锥形管中。如果样品太粘而无法通过过滤器，请加入 10 mL RPMI-1640 培养基进行稀释。用RPMI培养基冲洗过滤器以收集残留细胞。
  12. 使用血细胞计数器计数每个样品的细胞/mL。
  13. 每个肿瘤样本等分两个或多个重复的5×106 个细胞。
  14. 在1，000× g （4°C）下离心5分钟。除去上清液。
  15. （可选）如果需要，冷冻保存肿瘤样本以供以后的DDAOG染色。
    1. 将解离的肿瘤细胞沉淀重悬于冷冻保存培养基中:50%FBS，40%RPMI-1640，10%DMSO，在无菌条件下以5×106 细胞/ mL制备。
    2. 将 1 mL 细胞悬液等分到每个冷冻管中。
    3. 将冷冻管在-80°C的异丙醇细胞冷冻容器中冷冻24小时;然后，转移到液氮冷冻储存中长期储存（>1周）。
    4. 当需要染色时，在冰上解冻冷冻管，然后在第 4 节中进行 DDAOG 染色。
      注意:某些肿瘤可能无法通过冷冻保存保持活力，用户应针对感兴趣的肿瘤模型评估对此过程的恢复力。
  16. 继续第 4 部分进行 DDAOG 染色。

4. 细胞或肿瘤样本中SA-β-Gal的DDAOG染色

  1. 将 1 mM 巴非霉素 A1 储备液以 1:1，000 倍稀释到 DMEM 培养基（不含 FBS）中，终浓度为 1 μM。
  2. 将制备好的Baf-DMEM溶液添加到细胞沉淀样品中（来自步骤2.11或步骤3.16），浓度为1×106 细胞/ mL。
    注意:例如，如果每个样品使用 0.5 × 10 个6 个 细胞，请添加 0.5 mL Baf-DMEM。对于肿瘤，可以在 5 mL Baf-DMEM 中染色 5 ×10 6 个细胞。
  3. 在37°C（无CO2）下在以慢速设置的旋转器/振荡器上孵育30分钟。
    注意:染色过程中避免使用CO2 培养箱，这可能会使溶液酸化，从而干扰Baf和DDAOG染色。
  4. 无需洗涤，以 1:500x（10 μg/mL 最终）的比例向每个样品中加入 DDAOG 储备溶液 （5 mg/mL）。移液器混合。在37°C（无CO2）的旋转器/振荡器上更换60分钟。避免光线直射。
  5. 在4°C下以1，000× g 离心管5分钟。 除去上清液。
  6. 每管用 1 mL 冰冷的 0.5% BSA 洗涤，移液器混合。在4°C下以1，000× g 离心管5分钟，并除去上清液。重复此步骤2次以彻底洗涤细胞。取出上清液并继续。
    注意:重要的是执行步骤4.6中的洗涤步骤以去除未切割的DDAOG，DDAOG可能会表现出不需要的荧光发射（460 / 610 nm）。
    注意:如果对细胞表面标志物进行免疫染色，请继续执行下面的第5节。
  7. （可选）固定和储存DDAOG染色细胞以供以后分析
    1. 向每个洗涤的样品中滴加 0.5 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛。移液器混合。
    2. 在室温下孵育10分钟。
    3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次。
    4. 在流式细胞术分析之前，将样品在4°C下储存长达1周。
      注意:对于固定样本，请跳过步骤 4.8。
  8. 将钙黄绿素紫 450 AM 原液 （1 mM） 以 1:1，000 倍稀释到 1% BSA-PBS（1 μM 最终）。向步骤 4.6 中洗涤的细胞沉淀中加入 300 μL（用于培养细胞样品）或 1，000 μL（用于肿瘤样品）。在黑暗中在冰上孵育15分钟。
  9. 继续流式细胞术设置（第6节）。

5. （可选）结合DDAOG对细胞表面标志物进行免疫染色

注意:与任何流式细胞术实验一样，应制备仅使用DDAOG和仅使用荧光抗体的单染色对照样品，以确定荧光通道之间的串扰（如果有）。如果观察到串扰，应进行标准流式细胞术补偿20。

  1. 将步骤4.6中获得的细胞沉淀重悬于100μL染色缓冲液（1x PBS中的1%BSA）中。
  2. 在制造商推荐的滴定下添加适用于细胞种类（小鼠或人类）的Fc受体封闭试剂。在24°C孵育10分钟。
  3. 在制造商推荐的滴定（或由用户确定）下添加荧光团偶联抗体。在冰上孵育20分钟，避光。
  4. 将试管在4°C下以1，000× g 离心5分钟。 除去上清液。
  5. 每管用 1 mL 冰冷洗涤缓冲液 （0.5% BSA-PBS） 洗涤，并移液器进行混合。在4°C下以1，000× g 离心管5分钟，并除去上清液。重复此步骤2次以彻底洗涤细胞。
  6. 将 1 mM 钙黄绿素紫 450 AM 以 1:1，000 倍稀释到 1% BSA-PBS 中。向步骤 5.5 中洗涤的细胞沉淀中加入 300 μL。在黑暗中在冰上孵育15分钟。
  7. 继续进行流式细胞术分析（第6-7节）。

6. 流式细胞仪设置和数据采集

  1. 将细胞样品转移到与流式细胞仪兼容的试管中。将试管放在冰上并避光。
    注意:如果在细胞悬液中观察到聚集体，请在分析前将悬浮液通过70-100μm细胞过滤器。不要使用40μm过滤器，因为它们可以排除一些较大的衰老细胞。
  2. 在参考的软件（请参阅 材料表）中，打开以下图:1） FSC-A 与 SSC-A 点图，2） 紫色通道直方图，3） 远红色通道（例如，APC-A）与绿色通道（例如，FITC-A）点图。
    注意:也可以使用双峰排除图和单通道直方图，但不是严格要求的。
  3. 启动细胞仪数据采集。
    1. 将用DDAOG染色的车辆专用对照样品放在进气口上。在低进气速度下，开始采集样本数据。
    2. 调整FSC和SSC电压，使>90%的事件包含在图中。如果像元不能很好地适应图，请将面积缩放设置降低到 0.33-0.5 个单位。
    3. 删除仅车辆样本而不记录数据。
    4. （可选）将一滴彩虹校准微球加入含有 1 mL PBS 的细胞仪管中。将试管放在细胞仪进气口上。开始获取样本数据。
    5. 调整紫色、绿色和远红色通道电压，使彩虹微球的顶峰在每个通道中处于 104-10 5 个单位的相对荧光范围内，并且每个通道中的所有峰都很好地分离。记录 10，000 个事件。取出试管。
  4. 将用DDAOG染色的阳性对照样品（例如BLM，ETO）放在进气口。以低速采集样本数据。观察FSC，SSC，紫色，绿色和远红色通道中的事件，以确保超过90%的事件包含在所有图中。寻找自动对焦和DDAOG信号的增加，而不是仅车辆控制。
  5. 如果使用分选细胞仪，请在此步骤中启动分选。
    1. 出于记录保存目的，记录对照样品和每个分类样品的 10，000 个细胞。
    2. 将所需数量的细胞（通常适合≥1×106 ）分选到装有3-5 mL培养基的适合仪器的收集管中。
    3. 分拣后，进行下游培养或分析。
    4. 跳至第 7 节，对分选样品进行常规分析。
  6. 如果使用荧光抗体，请使用第 5 节中制备的未染色、单染色和双染色样品优化通道电压。
    注意:对于本文使用的校准流式细胞仪，最佳通道电压通常介于 250 和 600（中档）之间，但最佳电压和通道电压范围因仪器而异。避免使用非常低或很高范围的电压，这可能会抑制信号或放大噪声。
  7. 完成步骤6.1-6.5并根据需要调整细胞仪设置后，记录所有样品的数据。确保所有样本记录的设置保持一致。每个培养细胞样本记录 ≥10，000 个事件或每个肿瘤细胞样本记录 ≥100，000 个事件。
    注意:虽然可以使用数据采集软件（例如FACSDiva）执行门控和分析，但下面的第7节描述了使用单独的分析软件（FlowJo）在采集后进行的完整门控和分析工作流程。采集后分析是首选，以减少在细胞仪工作站上的时间，并利用专用分析软件中包含的其他工具。
  8. 以 .fcs 文件格式保存示例数据。将文件导出到配备流式细胞术分析软件（例如FlowJo）的工作站计算机。继续执行第 7 部分。

7. 流式细胞术数据分析

注意:显示的工作流程使用 FlowJo 软件。如果类似地遵循本节中描述的关键步骤，则可以使用替代流式细胞术数据分析软件。

  1. 使用 FlowJo 软件，打开步骤 6.7 中的 .fcs 数据文件。
  2. 打开布局窗口。
  3. 将所有示例拖放到布局窗口中。
  4. 门禁活细胞。
    1. 首先双击仅车辆控件的示例数据以打开其数据窗口。
    2. 将数据可视化为紫色通道直方图。根据CV450染色的活细胞比死细胞更亮的荧光来鉴定活细胞。
    3. 使用单门直方图工具绘制门以仅包含活细胞。将门命名为可行。
    4. 然后，从示例布局窗口中，将活门拖到其他细胞样本上以均匀应用门。
    5. 在布局窗口中，将所有样本可视化为紫色通道（活力）直方图。在继续之前，验证活细胞门控是否适合跨样品;如果没有，请根据需要进行调整。
      注意:活力染色可能会因治疗或肿瘤而异。
  5. 门衰老细胞。
    1. 双击仅车辆控件的门控可行单元数据以打开其数据窗口。
    2. 将数据可视化为远红通道 （DDAOG） 与绿色通道 （AF） 的点图。
    3. 使用矩形门控工具绘制门，以包含 <5% 的 DDAOG+ 和 AF+（右上象限）单元格。将门命名为衰老。
    4. 然后，从样品布局窗口中，将衰老门拖动到其他细胞样本的活子集上，以均匀应用门。
    5. 在布局窗口中，拖放第 7.4 节中设控的所有活细胞子集。将所有活样本可视化为远红色（例如，APC-A）与绿色通道（例如，FITC-A）点图。
    6. 确保在步骤7.5.3中绘制的衰老门在所有图上可见，并且仅载体对照的门表现出≤5%-10%的衰老细胞。
  6. 使用上述步骤确定衰老细胞的百分比后，使用FlowJo图呈现结果数据，汇总在数据表中和/或使用标准软件进行统计分析。

结果

进行了几个实验，以证明DDAOG与X-Gal和C12-FDG在SA-β-Gal检测衰老方面的可比性。首先，X-Gal用于染色由ETO诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞（图2A）。在ETO处理的细胞亚群中出现强烈的蓝色，而其他细胞表现出不太强烈的蓝色染色。大多数ETO处理的细胞的形态扩大。用荧光SA-β-Gal底物C12-FDG（绿色）或DDAOG（远红）染色ETO处理的细胞显示出与X-Gal相当的染色模式和强度...

讨论

在过去十年左右的时间里，由于肿瘤免疫学的日益普及，低成本流式细胞仪的发展以及学术机构共享仪器设施的改进，流式细胞术已成为癌症研究中更常见的分析平台。多色检测现在是标准配置，因为大多数较新的仪器都配备了紫色、蓝绿色和红色至远红色的光学阵列。因此，该DDAOG方案可能与各种流式细胞仪兼容。当然，任何流式细胞仪都应经过用户评估。在DDAOG测定中添加额外的荧光团（例如...

披露声明

作者对本研究没有利益冲突。

致谢

我们感谢芝加哥大学的细胞术和抗体核心设施对流式细胞术仪器的支持。芝加哥大学的动物研究中心提供动物住房。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bafilomycin A1Research Products InternationalB40500
Bleomycin sulfate Cayman13877
Bovine serum albumin (BSA)US BiologicalA1380
Calcein Violet 450 AM viability dyeThermoFisher Scientific65-0854-39eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugateBiolegend137803Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinomaAmerican Type Culture CollectionCCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanomaAmerican Type Culture CollectionCRL-6475
Cell scraperCorning3008
Cell strainers, 100 µmFalcon352360
DDAO-GalactosideLife TechnologiesD6488
DMEM medium 1xLife Technologies11960-069
DMSOSigmaD2438
DNAse ISigmaDN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)PfizerNDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)Sun PharmaceuticalNDC 47335-049-40
EDTA 0.5 MLife Technologies15575-038
Etoposide Cayman12092
FBSOmega FB-11
Fc receptor blocking reagentBiolegend101320Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)Becton Dickinson (BD)VariousLSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)Becton Dickinson (BD)VariousFACSAria
GlutaMax 100xLife Technologies35050061
HEPES 1 MLonzaBW17737
Liberase TLSigma5401020001Roche
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Sciences15710
Penicillin/Streptomycin 100xLife Technologies15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1xCorningMT21031CVDulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kitSpheroTechUCRP-38-2K3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1xLife Technologies11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)Baxter Healthcare Corporation2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"Becton Dickinson (BD)n/aContact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"TreeStarn/aContact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%Life Technologies25200-114

参考文献

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -. H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -. H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

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